于海奕， 宋 峣， 馬曉偉， 馮 偉， 高 煒， 張幼怡

(北京大學第三醫(yī)院心內(nèi)科， 血管醫(yī)學研究所， 國家衛(wèi)生健康委心血管分子生物學與調(diào)節(jié)肽重點實驗室， 分子心血管學教育部重點實驗室， 心血管受體研究北京市重點實驗室， 北京 100191)

心臟重構(gòu)(cardiac remodeling)是多種因素共同作用的結(jié)果，神經(jīng)體液調(diào)節(jié)失衡、炎性細胞激活、炎性介質(zhì)釋放和內(nèi)皮功能紊亂等多種因素均參與了心臟重構(gòu)的發(fā)生發(fā)展[1]，其中β-腎上腺素受體(β-adrenergic receptors，β-ARs)過度激活是生理和病理狀態(tài)下調(diào)節(jié)心臟結(jié)構(gòu)和功能的主要神經(jīng)體液機制[2]。β1-AR和β2-AR轉(zhuǎn)基因小鼠可出現(xiàn)心臟肥厚和纖維化等病理改變[3]。異丙基腎上腺素(isoproterenol，ISO)是β-ARs非選擇性激動劑，我們先前采用連續(xù)腹腔注射或微滲透泵方式給予小鼠ISO 1～2周可誘導明顯的心臟重構(gòu)[4]。β-ARs過度激活引起心臟重構(gòu)的主要作用機制包括Gs/AC/cAMP/PKA信號通路、激活細胞外信號調(diào)節(jié)激酶-絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase，MAPK)級聯(lián)反應、白介素-6(interleukin-6，IL-6)/ 信號傳導及轉(zhuǎn)錄激活因子(signal transducers and activators of transcription, STAT3)信號轉(zhuǎn)導以及非經(jīng)典通路等[5]。

微小RNAs(microRNAs, miR)是一類內(nèi)源性小分子非編碼RNA。業(yè)已證明，多種miRNA參與β-ARs過度激活引起的心臟重構(gòu)[6-7]。激動β-ARs后，采用microRNA芯片檢測心臟中多種microRNA表達水平改變，其中miR-21表達顯著上調(diào)[8]。Tatsuguchi等[9]證明miR-21是體內(nèi)和體外心臟肥大的重要調(diào)節(jié)因子。 miR-21可通過靶向負調(diào)控軟脂?；椎鞍?sprouty 1，Spry1)及磷酸酶和張力蛋白同系物(phosphatase and tensin homolog deleted on chromosome ten，PTEN)激活MAPK信號途徑等，促進心肌細胞生長及成纖維細胞的增殖和膠原合成[10]。 在不同病因?qū)е碌男呐K重構(gòu)中，miR-21上游可受到不同轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控，包括缺氧誘導因子-1α[11]和STAT3[12]等，引起miR-21轉(zhuǎn)錄增加，進而發(fā)揮下游的促心臟重構(gòu)作用。

miR-21在β-ARs激動誘導的心臟重構(gòu)中可發(fā)揮重要作用，但β-ARs激動如何調(diào)控心臟miR-21表達，目前尚未得知。本研究采用ISO分別作用于心肌細胞和心臟成纖維細胞，探討β-ARs激動引起miR-21表達增加的主要調(diào)控機制，分析細胞間旁分泌作用對miR-21表達的影響，并驗證IL-6/ STAT3通路是否介導β-ARs激動引起miR-21表達增加。以期進一步認識心臟細胞之間相互作用參與交感過度激活引起心臟重構(gòu)的分子機制。

材 料 和 方 法

1 主要試劑

ISO和AG 490購自Sigma；抗p-STAT3抗體購自Santa Cruz Biotechnology；抗p-STAT3抗體購自Cell Signaling； Real-time PCR相關試劑購自ThermoFisher；細胞培養(yǎng)和轉(zhuǎn)染試劑購自Invitorgen；Dual-Luciferase Reporter Assay System購自Promega；其它生化試劑均為進口分裝或國產(chǎn)分析純。

2 主要方法

2.1原代小鼠心肌細胞和心臟成纖維細胞的分離 BALB/c新生小鼠，出生1～2 d，由北京大學醫(yī)學部實驗動物中心提供，動物許可證號為SYXK(京)2016-0041,動物實驗倫理批準號為LA2010-036。胸腹部用75%的乙醇消毒后，立即開胸取出心臟，置入4 ℃的Hank’s平衡鹽溶液中清洗2次，去除心房和心底部大血管，然后將心室剪碎成小塊，用Hank’s平衡鹽溶液配制的含0.07%胰蛋白酶和0.04%Ⅱ型膠原酶于37 ℃恒溫攪拌條件下消化。收集消化后細胞懸液，用含10% FBS的DMEM培養(yǎng)液混合后離心清洗2次，合并每次所得心肌細胞懸液，接種于培養(yǎng)板中，在37 ℃、5% CO2的培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，90 min內(nèi)貼壁生長的細胞為成纖維細胞P0代，傳代1次后為P1代成纖維細胞，用于后續(xù)實驗；未貼壁細胞懸液(含心肌細胞)加入BrdU(終濃度為0.1 mmol/L)以抑制非心肌細胞生長，所得心肌細胞另行接種，用含10% FBS的DMEM培養(yǎng)液培養(yǎng)36 h后，更換為不含血清的DMEM培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)24 h，用于后續(xù)實驗。

2.2條件培養(yǎng)液的制備 將P1代成纖維細胞撤血清培養(yǎng)24 h，加入ISO(10 μmol/L)，分別于1、6、12、24和48 h收集培養(yǎng)液上清，制成共5種梯度條件培養(yǎng)液。在所制備的5種條件培養(yǎng)液中，選取起效早、效應顯著的24 h時點培養(yǎng)液，檢測條件培養(yǎng)液引起心肌細胞p-STAT3/STAT3和miR-21表達增加的機制。

2.3miRNA提取和定量分析 按照 TRIzol試劑(Invitorgen)操作手冊提取新生小鼠心肌細胞中的總RNA。采用TaqMan MicroRNA Reverse Transcription Kit(Applied Biosystems，Cat#4366596)逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，采用TaqMan MicroRNA Assays試劑盒(Applied Biosystems，Cat#4324018)，用實時定量PCR(real-time PCR)檢測成熟的miR-21(Applied Biosystems， 貨號000397)和U6 RNA(Applied Biosystems，貨號001973)，PCR擴增條件為：98 ℃預變性10 min；98 ℃變性15 s、60 ℃退火60 s，共40個循環(huán)。采用Realplex 2 PCR儀進行real-time PCR反應，讀取樣本中miR-21和U6 RNA的Ct值,以U6作為內(nèi)參照，miR-21相對表達量采用2-ΔΔCt法進行計算。

2.4細胞總蛋白的提取 細胞用冰浴的PBS洗滌2遍后加入全細胞裂解液(20 mmol/L Tris-HCl pH7.4，150 mmol/L NaCl, 2.5 mmol/L EDTA, 50 mmol/L NaF，0.1 mmol/L Na4P2O7，1 mmol/L Na3VO4, 1% Triton X-100, 10% 甘油, 0.1% SDS, 1% 脫氧膽酸, 1 mmol/L PMSF和1 mg/L 抑肽酶)，在冰上用細胞刮刮下細胞，將裂解液收集至Epperdorf管中，超聲處理后于4 ℃、12 000×g離心15 min，將上清移入新的EP管中，-80 ℃凍存。

2.5Western blot法檢測蛋白水平 細胞裂解液進行蛋白定量后，取60 μg蛋白進行10%SDS-PAGE凝膠電泳，蛋白分離后轉(zhuǎn)膜至硝酸纖維素膜，置于5%脫脂奶粉中室溫封閉1 h，分別孵育抗STAT3抗體(1∶1 000)、p-STAT3抗體(1∶1 000)和eIF5抗體(1∶1 000)4 ℃過夜。次日采用TBST溶液洗膜后，置于HRP標記的山羊抗兔IgG(1∶3 000)中，室溫孵育1 h，洗膜后采用ECL發(fā)光液顯影。

2.6ELISA檢測IL-6含量 采用R&D的小鼠IL-6免疫檢測試劑盒(Cat#DY406)，用ELISA方法檢測細胞培養(yǎng)液上清中IL-6含量。以標準品的A450值作線性回歸直線，再通過樣品的A450值計算出樣品的濃度。

2.7miR-21啟動子報告基因質(zhì)粒的構(gòu)建 采用天根生化公司的基因組提取試劑盒提取新生小鼠基因組，擴增miR-21啟動子片段，上游引物序列為5’-CCGCTCGAGCGAGTACATAAA-3’，下游引物序列為5’-CCGCTCGAGCAAAGATCACTATCCCAATC-3’?；厥掌?，與載體pGL3-basic分別進行XhoI/HindIII雙酶切、回收和連接，轉(zhuǎn)化和鑒定質(zhì)粒。

2.8質(zhì)粒轉(zhuǎn)染和報告基因活性檢測 采用Invitrogen的Lipofectamine 2000進行質(zhì)粒轉(zhuǎn)染。心肌細胞按約每孔1.5×105個細胞種植于24孔板，貼壁培養(yǎng)24 h后，換液(含BrdU和血清但不含雙抗的DMEM，每孔500 μL)，轉(zhuǎn)染操作按照說明書進行。轉(zhuǎn)染螢光素酶報告基因質(zhì)粒(含miR-21啟動子區(qū)螢光素酶報告基因pGL3-21PPR)每孔0.32 μg，同時共轉(zhuǎn)染每孔0.02 μg海腎(Renilla)螢光素酶報告基因作為內(nèi)參照，轉(zhuǎn)染24 h后換液(無血清的DMEM每孔1 mL)繼續(xù)培養(yǎng)24 h后，加入條件培養(yǎng)液處理24 h后，收集細胞裂解液，-80 ℃凍存待測。應用Promega的Dual-Luciferase Reporter Assay System(Cat# E1910)進行檢測。檢測時應用Promega的CLOMAX儀。預先加好每孔20 μL細胞裂解液放入白板，避光放置5 min，然后啟動自動加樣的DLR(雙報告)程序。每次順序加入每孔100 μL LARII以及100 μL Stop&Glo Reagent至96孔白板(Costar, Cat# 3922)。讀數(shù)為目的基因螢火蟲螢光素酶(firefly)活性以及內(nèi)參海腎螢光素酶(Renilla)報告基因的活性，檢測結(jié)果經(jīng)內(nèi)參校正，用相對螢光素酶活性單位(relative luciferase activity，RLU)表示，即目的基因螢光素酶活性與Renilla螢光素酶報告基因的螢光素酶活性的比值。

3 統(tǒng)計學處理

實驗結(jié)果以均數(shù)±標準誤(mean±SEM)表示。數(shù)據(jù)統(tǒng)計采用Prism 5.0軟件進行分析(Graphpad Software Inc.)。對照組與處理組之間的比較采用t檢驗或方差分析。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

結(jié) 果

1 ISO處理心臟成纖維細胞的條件培養(yǎng)液可使小鼠心肌細胞miR-21表達增加

采用條件培養(yǎng)液孵育心肌細胞24 h后，檢測miR-21表達量的改變。隨著ISO孵育成纖維細胞時間越長，所制備的條件培養(yǎng)液引起的心肌細胞miR-21的表達量越高；其中ISO作用24 h產(chǎn)生的條件培養(yǎng)液，可使心肌細胞miR-21表達量比對照組增加130%(P<0.01)，ISO作用48 h產(chǎn)生的條件培養(yǎng)液，可使miR-21增加140%(P<0.05)，見圖1A，而ISO直接作用下的心肌細胞及心臟成纖維細胞miR-21的表達量未見明顯增加，見圖1B。

2 ISO作用的心臟成纖維細胞條件培養(yǎng)液可使心肌細胞miR-21轉(zhuǎn)錄活性顯著增加

應用螢光素酶報告基因?qū)嶒灆z測了ISO作用不同時間的條件培養(yǎng)液對心肌細胞miR-21轉(zhuǎn)錄活性的影響。隨著ISO孵育成纖維細胞時間的延長，所制備的條件培養(yǎng)液引起的心肌細胞miR-21的轉(zhuǎn)錄活性增加越高，其中ISO作用24 h產(chǎn)生的條件培養(yǎng)液可使心肌細胞miR-21轉(zhuǎn)錄活性比對照組增加94.9%(P<0.01)，ISO作用48 h產(chǎn)生的條件培養(yǎng)液，可使心肌細胞miR-21增加77.1% (P<0.01)，與miR-21表達水平的變化趨勢一致，見圖2。

Figure 1.The expression of miR-21 in cardiomyocytes after incubation with conditioned medium from fibroblasts treated with ISO (10 μmol/L) for different time. A: the expression of miR-21 in cardiomyocytes significantly increased after incubation with the medium from ISO-treated fibroblasts, and ISO did not directly induce miR-21 up-regulation in cardiomyocytes; B: miR-21 expression was not induced in fibroblasts by ISO (10 μmol/L) stimulation. Mean±SEM.n=3.*P<0.05,**P<0.01vsISO group.

圖1ISO處理心臟成纖維細胞的條件培養(yǎng)液可使小鼠心肌細胞miR-21表達增加

Figure 2.miR-21 transcriptional activity was determined by luciferase activity assay. Transcriptional activity of miR-21 in cardiomyocytes significantly increased after incubation with the medium from ISO-treated fibroblasts. Mean±SEM.n=3.**P<0.01vscontrol group.

圖2螢光素酶報告基因?qū)嶒灆z測miR-21的轉(zhuǎn)錄活性

3 ISO作用成纖維細胞形成的條件培養(yǎng)液增加心肌細胞轉(zhuǎn)錄因子STAT3活性

隨著ISO孵育成纖維細胞時間越長，所制備的條件培養(yǎng)液引起的心肌細胞磷酸化STAT3(p-STAT3)含量越高,其中ISO作用24 h產(chǎn)生的條件培養(yǎng)液作用于心肌細胞30 min，p-STAT3/STAT3增加96.6%(P<0.01)；ISO作用48 h產(chǎn)生的條件培養(yǎng)液，可使心肌細胞p-STAT3/STAT3增加142%(P<0.01),見圖3A。

ISO作用成纖維細胞24 h產(chǎn)生的條件培養(yǎng)液使心肌細胞p-STAT3/STAT3和miR-21表達量分別較對照組增加57.7%(P<0.01)和128%(P<0.01)。 應用JAK2/3/STAT3的抑制劑AG490預先孵育細胞30 min抑制JAK-STAT3通路，再給予條件培養(yǎng)液孵育，則可顯著抑制條件培養(yǎng)液引起的心肌細胞p-STAT3/STAT3和miR-21表達增加，與只給予條件培養(yǎng)液組相比，分別抑制25.9%(P<0.05)和40.2%(P<0.05)， AG490本身不影響心肌細胞p-STAT3/STAT3和miR-21的表達，見圖3B、3C。

4 ISO作用的成纖維細胞條件培養(yǎng)液中IL-6水平增加，IL-6可劑量依賴性升高心肌細胞miR-21表達

ISO作用成纖維細胞6、12、24和48 h制成的4種條件培養(yǎng)液，均可顯著增加成纖維細胞上清中IL-6的水平，而ISO對心肌細胞IL-6的分泌水平無明顯影響,見圖4A。直接給予IL-6刺激心肌細胞24 h可以起miR-21表達增加，100 pmol/L的IL-6使心肌細胞miR-21表達增加約153%(P<0.05)，與條件培養(yǎng)液的效果類似，見圖4B。

討 論

miR-21通過負調(diào)控多種靶基因，如Sprouty、PTEN[10]、Smad7[13]和programmed cell death protein 4(PDCD4)等[14]，發(fā)揮促細胞增殖和分泌、抑制細胞凋亡的作用。miR-21參與心臟重構(gòu)的作用已有報道，但miR-21的上游調(diào)控機制尚未闡明。本項工作探討了交感/腎上腺素受體激動引起的心臟重構(gòu)過程中，引起miR-21這一重要分子表達改變的調(diào)控機制，證實了激動β-ARs可介導成纖維細胞合成和表達IL-6，旁分泌作用于心肌細胞，進而通過上調(diào)心肌細胞中轉(zhuǎn)錄因子STAT3活性，增加miR-21的轉(zhuǎn)錄和表達水平，加重心臟重構(gòu)反應。揭示成纖維細胞旁分泌IL-6，經(jīng)由細胞間的相互作用，以上調(diào)心肌細胞miR-21表達，參與了β-ARs激動所介導的心臟重構(gòu)的信號轉(zhuǎn)導機制。

Figure 3.Altered p-STAT3 expression in cardiomyocytes after incubation with conditioned medium from fibroblasts treated with ISO for different time. A: the relative expression of p-STAT3/STAT3 of cardiomyocytes were time-dependently increased after incubation with conditioned medium; B: AG490 inhibited the relative expression of p-STAT3/STAT3 in cardiomyocytes induced by ISO-incubated medium from fibroblast; C: AG490 inhibited miR-21 expression in cardiomyocytes induced by ISO-incubated medium from fibroblast. Mean±SEM.n=3.**P<0.01vscontrol medium group;#P<0.05vsISO medium group.

圖3ISO作用心臟成纖維細胞的條件培養(yǎng)基增加心肌細胞p-STAT3和miR-21的表達

多種心臟重構(gòu)模型中均可見miR-21表達增加[15-17]。在不同病因作用下miR-21作用于多種靶基因，發(fā)揮促心臟重構(gòu)的作用[8]。但既往的研究中檢測心肌組織中miR-21的表達均為心臟整體表達情況，為了研究整體心臟中增加的miR-21的來源和調(diào)控機制，本研究分別在原代心肌細胞和心臟成纖維細胞中進行檢測，單獨給予這2種細胞ISO處理均不引起miR-21的表達變化，提示miR-21的表達上調(diào)可能源于細胞間的交互作用。ISO作用于成纖維細胞形成的培養(yǎng)液上清，可時間依賴性上調(diào)心肌細胞miR-21表達，并且條件培養(yǎng)液可顯著激活miR-21的轉(zhuǎn)錄活性，證實激動β-ARs引起的miR-21表達上調(diào)是在轉(zhuǎn)錄水平實現(xiàn)的。以往亦有研究報道ISO作用于大鼠心肌細胞，可促進miR-21表達增加[18]，與我們研究結(jié)果不同，可能原因是細胞來源的動物種屬不同所致。

Figure 4.ISO regulates cardiac miR-21 expression through the paracrine action of IL-6 from fibroblasts. A: IL-6 secretion of cardiomyocytes and fibroblasts upon ISO incubation for different time. ISO did not induce IL-6 secretion in cardiomyocytes, but IL-6 secretion was significantly increased in cardiac fibroblasts; B: IL-6 time-dependently increases miR-21 expression in cardiomyocytes. Mean±SEM.n=3.*P<0.05vsother groups;#P<0.05vs1 pmol/L group. FB-ISO: cardiac fibroblast with ISO (10 μmol/L) treatment. CM-ISO: cardiomyocytes with ISO (10 μmol/L) treatment. CTR: control.

圖4ISO作用的成纖維細胞培養(yǎng)液中IL-6水平增加

轉(zhuǎn)錄因子是引起心肌細胞miR-21轉(zhuǎn)錄激活的主要機制之一，miR-21的啟動子區(qū)含有多個保守的增強子原件，包括激活蛋白1(AP1，由Fos和Jun家族核心癌基因組成)、C/EBP-α(控制造血系統(tǒng)分化的關鍵因子)及核因子I(NFI)、SRF、p53和STAT3的結(jié)合位點[19]。STAT3是miR-21的轉(zhuǎn)錄因子[20]，STAT3激活可增加miR-21的轉(zhuǎn)錄活性和表達水平，同時STAT3是介導腎上腺素受體激活發(fā)揮促心臟重構(gòu)作用的重要信號分子[21-22]。本研究結(jié)果與既往報道一致，ISO作用成纖維細胞形成的條件培養(yǎng)液，導致心肌細胞中STAT3活性顯著增加，STAT3活性變化與miR-21表達改變一致；給予STAT3通路抑制劑，則可顯著抑制條件培養(yǎng)液引起的心肌細胞miR-21的表達增加，證實激動β-ARs引起的心肌miR-21表達上調(diào)至少部分依賴于心肌細胞中轉(zhuǎn)錄因子STAT3的激活。

我們以往研究表明，小鼠心肌細胞上的β-ARs并不能直接介導STAT3激活，而是首先激動成纖維細胞的β2-AR，使其分泌IL-6水平分泌增加，IL-6旁分泌作用于心肌細胞上的gp130受體，從而導致心肌細胞的STAT3激活[23]。本研究中ISO既不能直接使小鼠心肌細胞miR-21增加，也不能使成纖維細胞miR-21明顯增加，但是ISO作用后的成纖維細胞的培養(yǎng)液上清卻可使心肌細胞miR-21表達量和轉(zhuǎn)錄活性顯著增加，表明心臟β-ARs介導的miR-21表達增加可能同STAT3的激活機制相似。有報道發(fā)現(xiàn)多發(fā)性骨髓瘤細胞IL-6通過激活STAT3，使其與miR-21啟動子上游的結(jié)合位點結(jié)合，促進miR-21的表達，從而保證瘤細胞的存活[24]。我們檢測了條件培養(yǎng)液中IL-6水平，觀察到了與既往研究一致的結(jié)果，隨著ISO孵育成纖維細胞時間的延長，培養(yǎng)液中IL-6水平逐漸增加，IL-6可以時間依賴性地增加心肌細胞中miR-21的表達量。近期研究報道，β-ARs通過IL-6旁分泌機制參與心臟重構(gòu)，ISO通過激活作用于心臟成纖維細胞的p38，促進IL-6合成和釋放，進而通過旁分泌作用引起心肌細胞肥大改變[25]。本研究結(jié)果進一步補充了上述研究中的級聯(lián)調(diào)控機制，即提示β-ARs通過作用于心臟成纖維細胞，引起其分泌IL-6水平增高，旁分泌作用于心肌細胞，經(jīng)由轉(zhuǎn)錄因子STAT3活化，從而在轉(zhuǎn)錄水平激活miR-21，引起miR-21表達顯著增高，發(fā)揮多靶向作用，促進細胞肥大，抑制細胞凋亡，參與心臟重構(gòu)。

β-ARs激活引起的心臟重構(gòu)中，細胞間相互作用機制對細胞和心臟功能產(chǎn)生了重要的影響；成纖維細胞響應刺激信號，合成和分泌細胞因子IL-6水平增加，旁分泌作用于心肌細胞，繼而引起心肌細胞STAT3活化和miR-21轉(zhuǎn)錄增加。靶向抑制成纖維細胞旁分泌途徑中的關鍵分子，將抑制miR-21上游激活機制，從而抑制β-ARs/STAT3/IL-6/miR-21信號通路的效應，可望阻遏心臟重構(gòu)的進展，保護心臟功能。