沈 鳳， 楊 鵬， 陶曉靜， 李 丹， 顏淵鴛， 羅雪蘭， 秦祖杰， 覃裕旺△， 歐和生， △

(1廣西醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院， 廣西 南寧 530021； 2廣西中醫(yī)藥大學(xué)附屬廣西國際壯醫(yī)醫(yī)院， 廣西 南寧 530001)

血管平滑肌細(xì)胞(vascular smooth muscle cells，VSMCs)是維持血管正常生理功能的重要細(xì)胞。在正常情況下，VSMCs呈非增殖性的收縮型，在血管損傷和一些生物活性物質(zhì)(如一氧化氮產(chǎn)物、血管緊張素Ⅱ和血小板生長因子等)刺激的情況下，VSMCs轉(zhuǎn)化為增殖性的合成表型，合成并分泌血管活性物質(zhì)和生長因子等，并發(fā)生增殖和遷移，從而導(dǎo)致血管壁增厚、管腔狹窄和血管重構(gòu)。血小板源性生長因子(platelet-derived growth factor，PDGF)是一種重要的促細(xì)胞分裂原，主要有AA、 BB 及AB 3種形式，其中 PDGF-BB 可與 VSMCs 表面的 PDGF-β受體結(jié)合以激活多條信號通路，誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生表型轉(zhuǎn)換、增殖和遷移。VSMCs表型轉(zhuǎn)換及增殖是高血壓和動脈粥樣硬化等血管增殖性疾病發(fā)生發(fā)展過程的重要因素[1]。

微小RNAs(microRNAs，miRNAs，miR)是一類內(nèi)源性非編碼小分子RNA，它們通過抑制翻譯過程或者促進(jìn)靶目標(biāo)mRNA降解參與胚胎發(fā)育、細(xì)胞分化、血管生成和腫瘤形成等幾乎所有病理生理過程。近年來發(fā)現(xiàn)miRNAs參與心血管系統(tǒng)疾病的調(diào)控過程，并且在血管重構(gòu)過程發(fā)揮重要作用，如miR-145/143可以抑制VSMCs增殖、促進(jìn)其分化，減少血管新內(nèi)膜的形成[2]；而miR-34a通過調(diào)節(jié)Notch表達(dá)水平抑制VSMCs增殖和遷移，并減少內(nèi)膜增生[3]。27nt-miRNA來源于內(nèi)皮型一氧化氮合酶(endothelial nitric oxide synthase，eNOS)基因第 4 內(nèi)含子中的 27 堿基重復(fù)序列,本課題組前期工作提示27nt-miRNA可能在心血管疾病的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用，內(nèi)含子源性27nt-miRNA一方面可以抑制內(nèi)皮細(xì)胞的增殖和遷移；另一方面，高表達(dá)27nt-miRNA可以抑制內(nèi)皮細(xì)胞代謝產(chǎn)生和釋放一氧化氮(nitric oxide，NO)[4]。由于NO不僅是調(diào)節(jié)血管舒張功能的重要因子，而且參與VSMCs增殖、遷移和表型改變的調(diào)節(jié)[5]，因此，本研究推測27nt-miRNA可能通過對組織特異性基因的表達(dá)調(diào)節(jié)，參與VSMCs增殖及其表型改變的調(diào)控過程。為證實這一觀點，本實驗選取大鼠主動脈血管平滑肌細(xì)胞為研究對象，構(gòu)建27nt-miRNA慢病毒載體，然后轉(zhuǎn)染VSMCs，檢測VSMCs收縮型標(biāo)志物平滑肌22α蛋白(smooth muscle 22α protein, SM22α)的表達(dá)水平，并觀察VSMCs形態(tài)、細(xì)胞活力和遷移能力的變化。

材 料 和 方 法

1 細(xì)胞和試劑

大鼠原代主動脈血管平滑肌細(xì)胞(武漢普諾賽生命科技有限公司)；DMEM培養(yǎng)基(Gibco)；胎牛血清(Lonsera)；胰蛋白酶消化液(Gibco)；重組人PDGF-BB (PeproTech)；MTT(北京索萊寶科技有限公司)；RNA提取試劑盒(北京百泰克生物技術(shù)有限公司);逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(MBI)；PCR試劑盒(天根生化科技有限公司)；慢病毒載體(上海吉凱基因化學(xué)技術(shù)有限公司)；兔抗SM22α和GAPDH抗體(Proteintech)。

2 方法

2.127nt-miRNA慢病毒載體的構(gòu)建和鑒定 以eNOS第4內(nèi)含子中27堿基重復(fù)序列5’-GAAGTCTAGACCTGCTGCAGGGGTGAG-3’為根據(jù)，設(shè)計miRNA的發(fā)夾結(jié)構(gòu)，以Ubi-MCS-BFLAG-SV40-EGFP-IRES-puromycin為載體，經(jīng)AgeI和NheI雙酶切，轉(zhuǎn)染 293FT細(xì)胞，濃縮得到27nt-miRNA高表達(dá)慢病毒載體mimic 27nt-miRNA，同時根據(jù)發(fā)夾結(jié)構(gòu)構(gòu)建27nt-miRNA反義序列(anti-27nt-miRNA)和陰性對照(negative control,NC)慢病毒載體。病毒載體上含有嘌呤霉素抗性，可用來識別細(xì)胞轉(zhuǎn)染是否成功，加入嘌呤霉素進(jìn)行篩選，建立穩(wěn)定細(xì)胞株。

2.2大鼠原代血管平滑肌細(xì)胞的培養(yǎng)和轉(zhuǎn)染 VSMCs用含15%胎牛血清、青霉素(1×105U/L)和鏈霉素(100 mg/L)的DMEM培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)，放置于37 ℃、5% CO2恒溫飽和濕度培養(yǎng)箱中，待細(xì)胞密度>85%時，傾去培養(yǎng)液，用 PBS洗滌細(xì)胞。加入0.25%胰蛋白酶進(jìn)行消化，37 ℃放置1～2 min后再加入2 mL含15% FBS的DMEM培養(yǎng)液，吹打使細(xì)胞形成單細(xì)胞懸液。按每孔5×105細(xì)胞的濃度接種6孔板，混勻后正常靜置培養(yǎng)24 h。上述3種慢病毒載體以MOI=70感染VSMCs，置于培養(yǎng)箱孵育48 h，在倒置熒光顯微鏡下觀察熒光表達(dá)情況，加入嘌呤霉素(8 mg/L)進(jìn)行篩選。實驗分為5組：(1)正常(normal)組：VSMCs正常培養(yǎng)；(2)PDGF-BB組：VSMCs加入終濃度為10 μg/L的PDGF-BB；(3)PDGF-BB+mimic 27nt-miRNA組：往成功轉(zhuǎn)染27nt-miRNA過表達(dá)慢病毒載體的細(xì)胞株加入終濃度10 μg/L的PDGF-BB；(4)PDGF-BB+NC組：向成功轉(zhuǎn)染陰性對照慢病毒載體的細(xì)胞株加入10 μg/L的PDGF-BB；(5) PDGF-BB+anti-27nt-miRNA組：向成功轉(zhuǎn)染anti-27nt-miRNA的細(xì)胞株加入10 μg/L的PDGF-BB。

2.3MTT法檢測細(xì)胞活力 成功轉(zhuǎn)染后，除正常組外其它4組都加入10 μg/L PDGF-BB，然后取對數(shù)生長期的細(xì)胞以每孔6×103個細(xì)胞接種到96孔板中，放置37 ℃、5% CO2恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)。待細(xì)胞密度達(dá)到50%時更換無血清的培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)24 h。后加入MTT培養(yǎng)4 h，使用酶聯(lián)免疫檢測儀在490 nm波長處測每孔的吸光度(A)值。

2.4劃痕實驗檢測各組VSMCs的遷移能力 通過細(xì)胞劃痕實驗檢測27nt-miRNA對VSMCs的遷移能力的影響。各組細(xì)胞接種到48孔板中，每孔2×104個，置于37 ℃、5% CO2細(xì)胞恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)至細(xì)胞基本達(dá)到100%融合，用200 μL移液槍及槍頭在培養(yǎng)板底部正中位置劃“一”字痕，棄去原有培養(yǎng)基，并用無菌PBS洗去劃落的細(xì)胞及碎片，重復(fù)2～3次。后每孔加入無血清的DMEM培養(yǎng)基200 μL，置于培養(yǎng)箱中繼續(xù)分別培養(yǎng) 0 h和24 h，應(yīng)用倒置電子顯微鏡觀察不同時點細(xì)胞遷移愈合的情況，遷移率(%)=(0 h劃痕寬度-24 h劃痕寬度)/0 h劃痕寬度×100%，實驗重復(fù)3 次，取平均值。

2.5RT-PCR 檢測細(xì)胞 SM22α的mRNA 表達(dá) 根據(jù)TRIzol 試劑盒說明書提取各組細(xì)胞的總RNA，利用 Primer 5.0 軟件設(shè)計合成引物，SM22α的上游引物序列為5’-CGTGGAGATCCCAACTGGTTTATG-3’， 下游引物序列為5’-CCCTCTGTTGCTGCCCATTTG-3’； GAPDH的上游引物序列為5’-GATGACATCAAGAAGGTGGTGA-3’， 下游引物序列為5’-ACCCTGTTGCTGTAGCCATATTC-3’。分別取各組細(xì)胞RNA 1 μg，加入1 μL(0.5 g/L)Oligo(dT)18Primer，70 ℃變性 5 min后立即放置冰上冷卻；加4 μL 5×Reaction Buffer、1 μL Ribo LockTMRibonuclease Inhibitor(2.0×107U/L)、2 μL dNTP Mix(10 mmol/L)，37 ℃溫育5 min，加入1 μL逆轉(zhuǎn)錄酶，42 ℃ 1 h，后70 ℃ 10 min終止反應(yīng),得到cDNA 第1 鏈。PCR 擴(kuò)增反應(yīng)條件為94 ℃預(yù)變性 5 min；94℃ 30 s、56℃ 1 min、72 ℃ 1 min，30個循環(huán)；最后72 ℃ 5 min，終止反應(yīng)。取 5 μL PCR 產(chǎn)物進(jìn)行1.5% 瓊脂糖凝膠電泳分析。

2.6免疫組化檢測各實驗組SM22α的表達(dá) 將無菌玻片放入 6孔板，將實驗細(xì)胞消化，取細(xì)胞懸液加入6孔板中，每孔加2 mL，搖勻靜置，放入37 ℃、5%CO2恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)，24 h后取出玻片放于載玻片上，PBS 沖洗 3 次，中性樹膠封片，4%甲醛固定。雙蒸水沖洗 3 次，敷Ⅰ抗、Ⅱ抗后顯色劑顯色。使用顯微鏡觀察、拍照，并計算細(xì)胞陽性率。實驗重復(fù)3 次，取平均值。

2.7Western blot檢測SM22α蛋白的表達(dá) 將各組細(xì)胞裂解，4 ℃、12 000 r/min離心15 min,取上清。各組分別取30 μg蛋白進(jìn)行SDS-PAGE(10%)分離并轉(zhuǎn)移到PVDF膜上。用脫脂奶粉封閉1 h后加入抗SM22α抗體濕盒過夜(4 ℃)。第2天用TBST沖洗3次，每次10 min，然后加入 II 抗孵育2 h，重復(fù)用TBST沖洗3次，每次10 min。最后利用Odyssey紅外熒光掃描成像系統(tǒng)(LI-COR)分析蛋白電泳條帶的灰度值，計算SM22α蛋白的表達(dá)量，以GAPDH為內(nèi)參照，SM22α相對表達(dá)量=SM22α灰度值/GAPDH灰度值。實驗重復(fù)3次，取平均值。

3 統(tǒng)計學(xué)處理

采用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析。實驗重復(fù)3次，數(shù)據(jù)均用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示，多組間比較用單因素方差分析，組間兩兩比較采用SNK-q檢驗。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

1 27nt-miRNA對PDGF誘導(dǎo)VSMCs活力的影響

細(xì)胞成功轉(zhuǎn)染后，用MTT法檢測各組細(xì)胞24 h的細(xì)胞活力，結(jié)果顯示，與正常對照組比較，PDGF-BB組的A值明顯升高(P<0.05)，提示PDGF可促進(jìn)VSMCs的活力；與PDGF-BB+NC組相比，PDGF-BB+mimic 27nt-miRNA組的A值下降，而PDGF-BB+anti-27nt-miRNA組的A值升高(P<0.05)，提示27nt-miRNA可以抑制PDGF誘導(dǎo)的VSMCs細(xì)胞活力，見圖1。

Figure 1.The effect of 27nt-miRNA on the cell viability of VSMCs measured by MTT assay. Mean±SD.n=3.*P<0.05vsnormal group;#P<0.05vsPDGF-BB+NC group.

圖1MTT實驗檢測27nt-miRNA對VSMCs細(xì)胞活力的影響

2 27nt-miRNA對PDGF誘導(dǎo)VSMCs遷移的影響

劃痕實驗檢測各組細(xì)胞遷移能力，PDGF-BB組的遷移率比正常組升高(P<0.05)，PDGF-BB+mimic 27nt-miRNA組的遷移率與PDGF-BB+NC組相比則下降(P<0.05)，而PDGF-BB+anti-27nt-miRNA組卻比PDGF-BB+NC組上升(P<0.05),提示27nt-miRNA對PDGF誘導(dǎo)VSMCs遷移起到一定的抑制作用，見圖2。

Figure 2.The effect of 27nt-miRNA on the migration ability of VSMCs(×200). Mean±SD.n=3.*P<0.05vsnormal group;#P<0.05vsPDGF-BB+NC group.

圖227nt-miRNA對VSMCs遷移能力的影響

3 RT-PCR 檢測細(xì)胞 SM22α的mRNA 表達(dá)

與正常組比較，PDGF-BB組SM22α的mRNA表達(dá)量下降(P<0.05)；與PDGF-BB+NC組比較，PDGF-BB+mimic 27nt-miRNA組SM22α的mRNA表達(dá)量提高，而PDGF-BB+anti-27nt-miRNA組SM22α的mRNA表達(dá)量下降(P<0.05)，見圖3。結(jié)果提示27nt-miRNA促進(jìn)SM22α的轉(zhuǎn)錄。

Figure 3.The effect of 27nt-miRNA on the mRNA expression of SM22α in the VSMCs detected by RT-PCR. Mean±SD.n=3.*P<0.05vsnormal group;#P<0.05vsPDGF-BB+NC group.

圖3RT-PCR檢測27nt-miRNA對SM22αmRNA表達(dá)的影響

4 免疫組化檢測27nt-miRNA對SM22α表達(dá)的影響

用免疫細(xì)胞化學(xué)染色方法檢測各組細(xì)胞中的收縮型特異性蛋白SM22α的表達(dá)量，結(jié)果顯示，SM22α蛋白主要在細(xì)胞胞漿表達(dá)，陽性染色呈棕黃色顆粒。運(yùn)用IPP6.0軟件對SM22α蛋白表達(dá)量進(jìn)行計算，平均吸光度(mean absorbance)越大，SM22α蛋白表達(dá)越高。與正常組比較，PDGF-BB組的SM22α表達(dá)量下降(P<0.05)，提示PDGF-BB可以促進(jìn)VSMCs的表型轉(zhuǎn)換；PDGF-BB+mimic 27nt-miRNA組的SM22α表達(dá)量比PDGF-BB+NC組升高(P<0.05)，而與PDGF-BB +NC相比，PDGF-BB+anti-27nt-miRNA組的SM22α表達(dá)量下降(P<0.05)。結(jié)果提示，27nt-miRNA對PDGF-BB誘導(dǎo)的VSMCs表型轉(zhuǎn)換具有一定的抑制作用，見圖4。

5 Western blot檢測27nt-miRNA對SM22α蛋白表達(dá)的影響

與正常組比較，PDGF-BB組的SM22α表達(dá)水平下降(P<0.05)；與PDGF-BB + NC組比較，PDGF-BB+mimic 27nt-miRNA組SM22α表達(dá)水平提高(P<0.05)，而PDGF-BB+anti-27nt-miRNA組的SM22α表達(dá)水平下降(P<0.05)。結(jié)果提示27nt-miRNA促進(jìn)VSMCs收縮型特異性蛋白SM22α的表達(dá)，見圖5。

討 論

本文通過研究27nt-miRNA對大鼠血管平滑肌細(xì)胞的細(xì)胞活力、遷移及表型改變的影響，發(fā)現(xiàn)27nt-miRNA參與SM22α表達(dá)的調(diào)控；在調(diào)控SM22α表達(dá)同時，影響VSMCs的活力以及遷移能力。SM22α是VSMCs收縮型的特異性蛋白之一，PDGF-BB可以促進(jìn)VSMCs從收縮型轉(zhuǎn)變?yōu)楹铣尚停?7nt-miRNA高表達(dá)可能抑制VSMCs從收縮型轉(zhuǎn)變?yōu)楹铣尚?。?jù)我們所知，這是首次報道來源于eNOS基因的27nt-miRNA參與VSMCs活力、遷移及表型改變的調(diào)控過程。

Figure 4.The effect of 27nt-miRNA on the protein expression of SM22α in the VSMCs was detected by immunohistochemistry (×200). Mean±SD.n=3.*P<0.05vsnormal group;#P<0.05vsPDGF-BB+NC group.

圖4免疫組化檢測27nt-miRNA對細(xì)胞SM22α蛋白表達(dá)的影響

Figure 5.The effect of 27nt-miRNA on the protein expression of SM22α in the VSMCs was detected by Western blot. Mean±SD.n=3.*P<0.05vsnormal group;#P<0.05vsPDGF-BB+NC group.

圖5Westernblot檢測27nt-miRNA對VSMCs中SM22α蛋白表達(dá)的影響

血管平滑肌細(xì)胞的功能改變與心血管疾病的發(fā)生發(fā)展具有密切的關(guān)系[6-7]。心血管疾病已成為威脅人類健康的主要疾病之一，高血壓、動脈粥樣硬化和缺血性腦病等血管增殖性疾病發(fā)病率及病死率逐年升高。VSMCs與血管內(nèi)皮細(xì)胞是血管的重要組成成分，血管內(nèi)皮細(xì)胞位于血管內(nèi)膜，VSMCs位于中膜。正常情況下，VSMCs處于分化成熟狀態(tài)也稱為收縮型，維持動脈血管壁的正常收縮功能，從而調(diào)節(jié)血壓。當(dāng)血管內(nèi)皮損傷后或周圍微環(huán)境改變后，多種信號通路被激活進(jìn)而作用于VSMCs，促使VSMCs由收縮型變成合成型，發(fā)生增殖和遷移，并大量合成和分泌細(xì)胞外基質(zhì)沉積于血管，從而導(dǎo)致血管重塑。研究發(fā)現(xiàn)[8]，生長因子、PDGF-BB、Ang-II和機(jī)械因素等可以使VSMCs由收縮型向合成型轉(zhuǎn)變，促進(jìn)其增殖和遷移，其中 PDGF-BB可能通過影響 KLF4 磷酸化與不同轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子的相互作用的機(jī)制，進(jìn)而誘導(dǎo) VSMCs 由收縮型轉(zhuǎn)變?yōu)楹铣尚蚚9]。本文選用PDGF-BB刺激VSMCs建立VSMCs表型轉(zhuǎn)換模型，結(jié)果發(fā)現(xiàn)PDGF-BB組的細(xì)胞活力和遷移率明顯高于正常VSMCs組，并且PDGF-BB組的收縮型特異性SM22α蛋白表達(dá)量低于正常VSMCs組，結(jié)果證實PDGF-BB可以促進(jìn)VSMCs表型轉(zhuǎn)變。miRNA可以通過抑制或相關(guān)基因的表達(dá)從而調(diào)控細(xì)胞功能，如細(xì)胞分化、增殖及維持穩(wěn)態(tài)等。眾多研究表明[10]，miRNA的特異性表達(dá)在心血管疾病發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮重要作用。因此，miRNA是否對VSMCs表型轉(zhuǎn)換以及活力和遷移有影響是一個很重要的研究課題。Yang等[11]在動物體內(nèi)實驗發(fā)現(xiàn)大鼠受傷的主動脈中，miR-22表達(dá)水平下降，而且體外實驗發(fā)現(xiàn)miR-22過表達(dá)抑制VSMCs從收縮型變?yōu)楹铣尚?；miRNA-18a/b通過作用于血清反應(yīng)因子促進(jìn)VSMCs從收縮型變?yōu)楹铣尚蚚12]；此外，miR-26a作為另外一個參與VSMCs表型調(diào)控的miRNA，可以通過抑制Smad1從而抑制PDGF-BB誘導(dǎo)的VSMCs的表型轉(zhuǎn)變[13]。miRNA不僅參與VSMCs表型調(diào)控，還參與VSMCs活力、遷移及內(nèi)膜形成的調(diào)控過程。Ham等[14]發(fā)現(xiàn)miR-9過表達(dá)可以抑制VSMCs增殖和遷移，且同時在球囊損傷實驗中發(fā)現(xiàn)miR-9抑制新內(nèi)膜的形成；miR-146a 通過 NF-κB依賴的途徑可以促進(jìn)血管平滑肌細(xì)胞增殖以及遷移[15]。27nt-miRNA來源于eNOS基因第 4 內(nèi)含子中的 27 堿基重復(fù)序列，我們前期工作發(fā)現(xiàn)高表達(dá)27nt-miRNA通過抑制轉(zhuǎn)錄因子AP1從而抑制eNOS的活性,并且抑制NO的合成和釋放[4]。已有研究報道NO可以活化VSMCs內(nèi)的鳥苷酸環(huán)化酶，通過環(huán)磷鳥苷酸依賴蛋白激酶Ⅰ信號通路催化一系列蛋白磷酸化，從而使血管平滑肌舒張，抑制VSMCs增殖和遷移[5]。由此推測27nt-miRNA可能對VSMCs的表型轉(zhuǎn)變、活力及遷移有一定影響。本研究發(fā)現(xiàn)27nt-miRNA高表達(dá)組SM22α的mRNA和蛋白表達(dá)量高于PDGF-BB+NC組，細(xì)胞活力和遷移能力明顯下降，而27nt-miRNA抑制組與高表達(dá)組相反，這一結(jié)果強(qiáng)烈提示27nt-miRNA參與VSMCs收縮型特異性SM22α基因調(diào)控，并且抑制PDGF-BB誘導(dǎo)VSMCs生長及遷移，并有可能抑制其表型轉(zhuǎn)換。VSMCs的表型轉(zhuǎn)變、活力及遷移是一個多因素調(diào)節(jié)的過程，不是單一分子或基因所調(diào)控，本文研究發(fā)現(xiàn)27nt-miRNA可能通過調(diào)控SM22α基因從而影響VSMCs的表型轉(zhuǎn)變、生長及遷移的過程，但是否存在其它影響因素存在，有待進(jìn)一步的探究。