趙 靜， 翟 鐵， 梁宏霞

(1唐山職業(yè)技術學院臨床醫(yī)學系， 河北 唐山 063000； 2承德市中心醫(yī)院內分泌科， 河北 承德 067000)

糖尿病腎病是常見的糖尿病并發(fā)癥之一，高血糖是誘發(fā)糖尿病腎病發(fā)生的關鍵。糖尿病腎病的發(fā)生與腎小管上皮細胞損傷有關，腎小管上皮細胞氧化損傷、炎性損傷和細胞凋亡等是腎小管上皮細胞損傷的重要組成部分[1]。Netrin-1是一種神經導向因子，具有抑制組織炎癥和促進血管生成等作用，對腎組織損傷具有保護作用[2-3]。Netrin-1具有保護腎組織的作用，阻斷netrin-1的糖尿病小鼠發(fā)生更為嚴重的腎臟疾病，netrin-1還能夠抑制糖尿病腎病患者炎癥等的發(fā)生[4-5]。本實驗用慢病毒感染的方法提高腎小管上皮細胞中netrin-1的表達水平，探討netrin-1在高糖誘導的腎小管上皮細胞損傷中的作用，為明確糖尿病腎病的發(fā)病機制提供基礎。

材 料 和 方 法

1 主要材料

人腎小管上皮HK-2細胞購自武漢普諾賽生命科技有限公司，培養(yǎng)于含有10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中。cDNA第一鏈合成試劑盒購自Biomiga；SYBR Green Realtime PCR試劑盒購自上海索寶生物科技有限公司；抗netrin-1抗體購自Bioworld；抗cleaved caspase-3抗體購自Santa Cruz；乳酸脫氫酶(lactate dehydrogenase，LDH)活性檢測試劑盒和丙二醛(malondialdehyde，MDA)含量檢測試劑盒購自Abnova；白細胞介素1β(interleukin-1β，IL-1β)和腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)含量檢測試劑盒購自南京建成生物工程研究所；引物均由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

2 方法

2.1高糖對腎小管上皮細胞中netrin-1表達的影響 HK-2細胞分別用含5.5 mmol/L[對照(control)組]和30 mmol/L葡萄糖[高糖(high glucose，HG)組]的細胞培養(yǎng)液培養(yǎng)2 d，以real-time PCR和Western blot實驗測定細胞中netrin-1的表達水平。

2.2慢病毒感染和分組 HK-2細胞分成4組:(1)control組：不做慢病毒感染的HK-2細胞培養(yǎng)于含有5.5 mmol/L葡萄糖的細胞培養(yǎng)液中；(2)HG組：不做慢病毒感染的HK-2細胞培養(yǎng)于含有30 mmol/L葡萄糖的細胞培養(yǎng)液中；(3)陰性對照慢病毒(negative control, NC)+HG組：陰性對照慢病毒感染的HK-2細胞培養(yǎng)于含有30 mmol/L葡萄糖的細胞培養(yǎng)液中；(4)netrin-1+HG組：過表達netrin-1慢病毒感染的HK-2細胞培養(yǎng)于含有30 mmol/L葡萄糖的細胞培養(yǎng)液中。慢病毒感染步驟簡述如下：HK-2細胞接種到6孔板內，細胞匯合度為30%～50%時，將培養(yǎng)液上清吸棄，加入適量的病毒液(MOI=30)，培養(yǎng)12 h后，將病毒液吸棄，細胞培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)72 h后，用嘌呤霉素篩選抗性細胞，用于后續(xù)實驗。用real-time PCR和Western blot方法檢測各組細胞中netrin-1表達水平，檢測過表達效果。

2.3流式細胞術檢測細胞凋亡 各組細胞按照上述方法培養(yǎng)48 h以后，在細胞中添加0.25%的胰蛋白酶消化，轉移到離心管中，1 000×g離心10 min。把上清溶液吸棄以后，以PBS將各組細胞洗滌3次。在細胞中添加200 μL的binding buffer混合后，添加10 μL的Annexin V-FITC混合孵育15 min,再加入5 μL的PI染液，混勻后，在用流式細胞儀檢測前添加300 μL的binding buffer。

2.4Real-time PCR 取HK-2細胞，用TRIzol法提取細胞中的總RNA，步驟參照TRIzol試劑說明書。提取的各組RNA用DEPC水溶解以后，分裝，在-80 ℃的冰箱中保存。提取的RNA經紫外分光光度計測定A260/A280值在1.8～2.0之間。以cDNA第一鏈合成試劑盒逆轉錄合成cDNA，步驟同試劑盒說明書。cDNA置于-80 ℃的冰箱中保存。取cDNA，用SYBR Green Realtime PCR試劑盒進行PCR，β-actin作為內參照，用2-ΔΔCt計算netrin-1水平。Netrin-1 的上游引物序列為5’-GGATCCATGCCGCGGAGGGGC-GCGGA-3’，下游引物序列為5’-GATTCCTACGCCTTCCTACACTTC-3’;β-actin的上游引物序列為5’-ACTCTTCCAGCCTTCCTTCC-3’， 下游引物序列為5’-GAGGAGCAATGATCTTGATCTTC-3’。

2.5Western blot檢測蛋白水平 取HK-2細胞，常規(guī)方法提取細胞中的總蛋白，用BCA法定量后，以每個泳道中加入30 μg蛋白計算，將蛋白同上樣緩沖液混合后，置于100 ℃煮沸變性。SDS-PAGE條件為 70 V電壓在濃縮膠中電泳，120 V電壓在分離膠中電泳。把凝膠取出，以90 V電壓將蛋白轉移到PVDF膜上，轉膜裝置置于冰上進行。NC膜用5%牛血清白蛋白常規(guī)方法封閉以后，再與1∶400稀釋的netrin-1抗體在4 ℃過夜或室溫孵育2 h，與1∶5 000稀釋的HRP標記的 II 抗置于37 ℃結合2 h后，按照ECL發(fā)光試劑盒發(fā)光，以 ImageJ 測定條帶的灰度值，內參照為β-actin，分析各組netrin-1蛋白表達變化。

各組細胞按照上述方法培養(yǎng)2 d以后，用上述Western blot方法檢測細胞中cleaved caspase-3水平，抗cleaved caspase-3蛋白抗體以1∶200稀釋。

2.6細胞培養(yǎng)液中LDH活性和MDA含量的檢測 各組細胞按照上述方法培養(yǎng)48 h以后，吸取培養(yǎng)液上清，用硫代巴比妥酸(thiobarbituric acid,TBA)法檢測上清中MDA含量，TBA可以與MDA結合形成紅色物質，檢測其在532 nm的A值可計算MDA含量。用2,4-二硝基苯肼法檢測培養(yǎng)液中LDH活性，LDH能夠將乳酸催化生成丙酮酸，丙酮酸能夠同2,4-二硝基苯肼結合生成棕紅色物質，通過比色可以計算出LDH活性。

2.7ELISA法檢測培養(yǎng)液中IL-1β和TNF-α含量 各組細胞按照上述方法培養(yǎng)48 h以后，吸取培養(yǎng)液上清，用ELISA法測定培養(yǎng)液中IL-1β和TNF-α含量，步驟同試劑盒說明書，在反應孔內加入100 μL的標準品或者待測樣品，在空白對照孔內添加100 μL的稀釋液，最后用空白對照孔調零以后，上酶標儀檢測參比波長450 nm的A值，根據標準品計算IL-1β和TNF-α含量。

3 統(tǒng)計學分析

實驗中所有數據均采用SPSS 21.0軟件進行處理。結果以均值±標準差(mean±SD)表示。兩組間比較采用獨立樣本t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析，組間多重比較經SNK-q檢驗。以P<0.05表示差異有統(tǒng)計學意義。

結 果

1 高糖抑制腎小管上皮細胞中netrin-1的表達

高糖處理后的腎小管上皮細胞中netrin-1的mRNA和蛋白水平較對照組均降低(P<0.05)，見圖1。

Figure 1.High glucose inhibited the expression of netrin-1 in renal tubular epithelial cells. A: the mRNA expression level of netrin-1 in the renal tubular epithelial cells after high-glucose treatment; B: Western blot was used to detect the level of netrin-1 protein in renal tubular epithelial cells after high-glucose treatment. Mean±SD.n=3.*P<0.05vscontrol group.

圖1高糖抑制腎小管上皮細胞中netrin-1的表達

2 過表達netrin-1提高高糖環(huán)境下腎小管上皮細胞中netrin-1的表達水平

腎小管上皮細胞感染過表達netrin-1慢病毒載體后，經高糖處理，細胞中netrin-1的mRNA和蛋白表達水平升高(P<0.05),說明過表達netrin-1慢病毒載體能夠提高高糖環(huán)境下腎小管上皮細胞中netrin-1的表達水平，見圖2。

3 過表達netrin-1抑制高糖環(huán)境下腎小管上皮細胞凋亡

高糖處理后的腎小管上皮細胞凋亡率升高，同時細胞中活化的caspase-3水平也升高(P<0.05)，說明高糖誘導腎小管上皮細胞凋亡；過表達netrin-1的腎小管上皮細胞凋亡率降低，細胞中活化的caspase-3水平也降低(P<0.05)，提示netrin-1能夠降低高糖環(huán)境下的腎小管上皮細胞凋亡水平，見圖3。

4 過表達netrin-1降低高糖環(huán)境下腎小管上皮細胞培養(yǎng)液上清中LDH活性和MDA水平

高糖處理后的腎小管上皮細胞培養(yǎng)液中LDH活性和MDA水平升高(P<0.05)，高糖誘導腎小管上皮細胞氧化損傷;高表達netrin-1的腎小管上皮細胞培養(yǎng)液中LDH活性和MDA水平降低(P<0.05)，netrin-1減輕高糖環(huán)境下的腎小管上皮細胞氧化損傷，見表1。

5 高表達netrin-1降低高糖環(huán)境下腎小管上皮細胞培養(yǎng)液中IL-1β和TNF-α水平的變化

高糖處理后的腎小管上皮細胞培養(yǎng)液中IL-1β和TNF-α水平升高(P<0.05)，說明高糖誘導腎小管上皮細胞炎性損傷；高表達netrin-1的腎小管上皮細胞培養(yǎng)液中IL-1β和TNF-α水平降低(P<0.05)，netrin-1減輕高糖環(huán)境下的腎小管上皮細胞炎性損傷，見表1。

Figure 2.The effect of lentivirus infection on netrin-1 expression in the renal tubular epithelial cells in high-glucose environment. A: the effect of lentivirus infection on the mRNA level of netrin-1 in the renal tubular epithelial cells in high-glucose environment; B: Western blot was used to determine the protein level of netrin-1 in the renal tubular epithelial cells with lentivirus infection in high-glucose environment. Mean±SD.n=3.*P<0.05vsHG group.

圖2慢病毒感染對高糖環(huán)境下腎小管上皮細胞中netrin-1表達的影響

討 論

糖尿病腎病是一種慢性微血管并發(fā)癥，以往的研究認定腎小球病變是其發(fā)生的主要機制，近年來發(fā)現腎小管病變與腎功能損傷關系更為密切，腎小管上皮細胞凋亡是腎小管病變發(fā)生的原因之一，其發(fā)生機制與氧化損傷和炎癥等多種因素有關[6-7]。高糖誘導腎小管上皮細胞損傷，糖尿病患者長期的高血糖誘發(fā)腎小管上皮細胞凋亡是腎功能障礙的關鍵誘因[8-11]。用高糖處理腎小管上皮細胞是最為常用的糖尿病腎病腎小管上皮細胞損傷模型[12]。本實驗的結果顯示，高糖處理后的腎小管上皮細胞凋亡增多，說明成功構建了糖尿病腎病腎小管上皮細胞損傷模型。

Netrin家族屬于可溶性的神經導向因子，能夠促進神經元和軸突信號轉導，netrin家族除了在神經系統(tǒng)中表達以外，在胰腺、肺臟和乳腺等組織中也具有廣泛表達[13]。Netrin-1是netrin家族的成員，也是第一個被鑒定出來的netrin家族成員，在內囊、脊髓和延髓等組織中廣泛表達，其具有誘導神經軸突生長等作用[14-17]。另外，在血管內皮細胞和腎小管上皮細胞等神經系統(tǒng)以外的組織中也發(fā)現netrin-1的表達，其具有調控細胞增殖、形態(tài)改變和遷移等作用[18]。目前的研究表明，netrin-1與糖尿病、腎組織損傷、腫瘤和動脈粥樣硬化等的發(fā)生有關，netrin-1具有抑制缺血再灌注腎臟組織細胞凋亡的作用，另外在腎組織纖維化中netrin-1也發(fā)揮保護作用[13,19-22]。本實驗顯示，netrin-1在高糖誘導的腎小管上皮細胞中表達降低，并且上調其表達后可以減少高糖誘導的腎小管上皮細胞凋亡，減少細胞損傷，表明netrin-1具有腎小管上皮細胞保護作用。

糖尿病腎病腎小管上皮細胞損傷的發(fā)生與炎癥反應和氧化應激等有關，正常組織中存在較低水平的氧自由基，這些氧自由基在維持細胞氧化平衡和信號轉導中具有重要作用，當細胞內氧自由基過度積累時，就會引發(fā)存在于細胞膜上的脂質發(fā)生過氧化反應，導致細胞膜的完整結構被破壞，導致細胞內的LDH等進入細胞外，MDA是脂質發(fā)生過氧化的產物，檢測細胞培養(yǎng)液中LDH和MDA含量可以間接反應細胞氧化損傷程度[23]。腎臟組織炎癥是除了氧化應激以外與腎小管上皮細胞凋亡關系最為密切的誘導因素之一，IL-1β和TNF-α等炎癥因子能夠殺傷有害病原物的同時還能夠引起正常細胞損傷，誘導細胞凋亡發(fā)生[24-25]。之前的研究報道稱，netrin-1具有抗炎和抗氧化等作用。本實驗表明，netrin-1可以減少高糖環(huán)境下腎小管上皮細胞分泌IL-1β和TNF-α，同時減少細胞培養(yǎng)液中LDH和MDA水平，提示netrin-1可能具有抑制高糖誘導的腎小管上皮細胞炎性損傷和氧化損傷的作用。

Netrin-1作為一種腎組織損傷保護因子，其具有減輕高糖誘導的腎小管上皮細胞損傷的作用，在糖尿病腎病發(fā)生中發(fā)揮保護作用。這對于研究糖尿病腎病發(fā)生機制具有重要意義。

Figure 3.Apoptosis of renal tubular epithelial cells induced by high-glucose was suppressed after up-regulation of netrin-1 expression. A: flow cytometry was used to detect the effect of netrin-1 on the apoptosis of renal tubular epithelial cells in high-glucose environment; B: the effect of netrin-1 on the protein level of cleaved caspase-3 in the renal tubular epithelial cells in high glucose environment was detected by Western blot. Mean±SD.n=3.*P<0.05vscontrol group;&P<0.05vsHG group.

圖3過表達netrin-1抑制高糖環(huán)境下腎小管上皮細胞凋亡

表1上調netrin-1后的腎小管上皮細胞經高糖處理后細胞培養(yǎng)液上清中LDH和MDA水平的變化

Table 1.The activity of LDH and the content of MDA, IL-1β and TNF-α in the culture supernatant of renal tubular epithelial cells treated with high glucose after up-regulation of netrin-1 expression (Mean±SD.n=3)

GroupLDH (×103 U/L)MDA (μmol/L)IL-1β (μg/L)TNF-α (μg/L)Control23.15±1.461.25±0.185.18±0.414.15±0.23HG39.52±2.17?2.18±0.13?16.74±1.46?12.96±1.17?NC+HG40.76±2.682.20±0.2516.82±1.2313.85±1.28Netrin-1+HG30.21±1.64&1.74±0.15&10.27±1.05&7.58±0.62&

*P<0.05vscontrol group;&P<0.05vsHG group.