代 佩， 高 奮， 高宏偉， 王 遠(yuǎn)， 馮高潔， 張秦風(fēng)， 白 瑞， 秦衛(wèi)偉， 李 虹， 宋曉蘇

(山西醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院心內(nèi)科， 山西 太原 030001)

微小RNA(microRNA，miRNA)是由18～22個核苷酸組成的內(nèi)源性非編碼單鏈RNA，其在轉(zhuǎn)錄后水平通過與靶mRNA的3’或5’非翻譯區(qū)(untranslated region,UTR)結(jié)合調(diào)控基因表達(dá)，主要與3’-UTR中特定的堿基順序列結(jié)合，通過抑制轉(zhuǎn)錄或翻譯調(diào)控機(jī)體病理生理過程[1]。業(yè)內(nèi)已證實miRNA-20a、miRNA-27、miRNA-758、miRNA-164和miRNA-33等miRNA均可參與心血管疾病的調(diào)控[2]。2010年， Rayner等[3]發(fā)現(xiàn)miRNA-33可抑制三磷酸腺苷結(jié)合盒轉(zhuǎn)運(yùn)體A1(ATP-binding cassette transporter A1， ABCA1)和三磷酸腺苷結(jié)合盒轉(zhuǎn)運(yùn)體G1(ATP-binding cassette transporter G1， ABCG1)的表達(dá)，從而抑制膽固醇逆轉(zhuǎn)運(yùn)(reverse cholesterol transport， RCT)，導(dǎo)致動脈粥樣硬化(atherosclerosis， AS)。近年來國外已經(jīng)在肝細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和ApoE-/-小鼠證實過表達(dá)miRNA-33可抑制ABCA1和ABCG1的表達(dá)，降低膽固醇的流出率，血漿內(nèi)可見高密度脂蛋白(high-density lipoprotein， HDL)水平降低；相反抑制miRNA-33的表達(dá)可增加ABCA1和ABCG1的表達(dá)，HDL濃度增高，說明其在動脈粥樣硬化病變調(diào)控過程中具有重要意義[4-5]。

同型半胱氨酸(homocysteine， Hcy)是冠心病(coronary heart disease， CHD)的獨立危險因子[6]。Hcy可以通過氧化應(yīng)激、炎癥反應(yīng)、損傷內(nèi)皮細(xì)胞、促進(jìn)血栓形成、影響體內(nèi)脂質(zhì)代謝及抑制ABCA1和ABCG1降低膽固醇流出率等多種機(jī)制導(dǎo)致動脈粥樣硬化發(fā)生[7]。李小紅等[8]和Mi等[9]已經(jīng)間接推測出低水平的Hcy可激活自噬，保護(hù)心肌細(xì)胞，而高水平的Hcy導(dǎo)致自噬過度激活而加重心肌細(xì)胞的損傷。ABCA1和ABCG1是膽固醇逆轉(zhuǎn)運(yùn)調(diào)控的關(guān)鍵分子，但是關(guān)于Hcy是否通過miRNA-33抑制ABCA1和ABCG1的表達(dá)降低膽固醇逆轉(zhuǎn)運(yùn)的效率，導(dǎo)致動脈粥樣硬化發(fā)生，至今尚未有研究。

本實驗旨在研究Hcy致AS過程中，是否通過miRNA-33抑制ABCA1和ABCG1的表達(dá)，從而降低膽固醇逆轉(zhuǎn)運(yùn)效率，同時進(jìn)一步闡述了Hcy致動脈粥樣硬化的機(jī)制。

材 料 和 方 法

1 材料和主要試劑

RAW264.7細(xì)胞株(上海中科院細(xì)胞中心)；Hcy和RNA 提取試劑TRIzol(索萊寶公司)；氧化型低密度脂蛋白(oxidized low-density lipoprotein，ox-LDL)(北京欣和佳源公司)；DMEM 培養(yǎng)基(博士德)；胎牛血清(杭州四季青生物工程材料研究所)；Opti-MEM 專用培養(yǎng)基 (Gibco)； LipofectamineTM2000 轉(zhuǎn)染試劑(Invitrogen)； miRNA-33 mimics/inhibitor (上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司)；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(TaKaRa)；[3H]標(biāo)記的膽固醇(American Life Science)。

2 主要儀器

CO2培養(yǎng)箱(Thermo)；PCR儀和酶標(biāo)儀(Bio-Rad)；超凈工作臺 (蘇州市漢達(dá)工業(yè)自動化有限公司)；相差倒置顯微鏡(Nikon TS100)；FJ22107P液體閃爍計數(shù)儀 (國營二六二廠)；低溫離心機(jī)(Eppendorf)；恒溫水浴箱 HS-4(成都儀器廠)；電子天平(Sartorius)；酸堿度儀 PB-10(Sartorius)。

3 實驗方法

3.1RAW264.7細(xì)胞的復(fù)蘇、培養(yǎng)和傳代 從液氮罐中取出凍存的RAW264.7巨噬細(xì)胞，置于25 cm2的培養(yǎng)瓶中，用DMEM培養(yǎng)基(含10%胎牛血清和1%青、鏈霉素鈉)，在溫度37 ℃、5% CO2的條件下培養(yǎng)，在細(xì)胞生長良好的狀態(tài)下，細(xì)胞覆蓋培養(yǎng)瓶的80%～90%時，用含0.25%的胰蛋白酶消化并按(1∶4)進(jìn)行傳代。

3.2RAW264.7源性泡沫細(xì)胞的誘導(dǎo) 待細(xì)胞傳2～3代后，取生長較好的對數(shù)期細(xì)胞經(jīng)消化、離心后，用2 mL DMEM培養(yǎng)基稀釋，待細(xì)胞吹打均勻后取10 μL滴于細(xì)胞計數(shù)板進(jìn)行細(xì)胞計數(shù)，按1.8×109/L細(xì)胞進(jìn)行種板，24 h觀察細(xì)胞，待細(xì)胞密度接近70%～80%時，每孔加入50 mg/L ox-LDL誘導(dǎo)，同時更換為DMEM培養(yǎng)基(含4%胎牛血清和1%青、鏈霉素)培養(yǎng)24 h后進(jìn)行后續(xù)實驗。

3.3細(xì)胞轉(zhuǎn)染及實驗分組 RAW264.7源性泡沫細(xì)胞誘導(dǎo)成功以后，根據(jù)LipofectamineTM2000 轉(zhuǎn)染說明書進(jìn)行轉(zhuǎn)染，細(xì)胞再轉(zhuǎn)染前1～2 h需換成Opti-MEM無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)6～8 h，后每組均給予5 mmol/L的Hcy干預(yù)(包括空白對照組)，24 h后收集細(xì)胞進(jìn)行實驗。實驗共分為5組，分別為空白對照組、miRNA-33 mimics組、miRNA-33 mimics-NC組、miRNA-33 inhibitor組和miRNA-33 inhibitor-NC組。

3.4油紅O染色 使用前將油紅O液體與蒸餾水以3∶2比例配制，靜置10 min，吸取6孔板的培養(yǎng)液，用遇冷的PBS清洗3次；4%中性甲醛固定10 min后，再用PBS清洗3次；每孔加入約1.5 mL已配置好的油紅O染色液，30 min后用PBS清洗3次，于相差熒光倒置顯微鏡下觀察。

3.5Western blot檢測ABCA1和ABCG1的蛋白表達(dá) 輕輕吸去細(xì)胞培養(yǎng)液，用預(yù)冷PBS 清洗 3 次細(xì)胞；以一定比例加入細(xì)胞裂解液和蛋白酶抑制劑(100∶1)，用刮刀刮下細(xì)胞，靜置20～30 min后將裂解的蛋白裝入有標(biāo)記EP管經(jīng)超聲波粉碎機(jī)粉碎，4 ℃、12 000 r/min離心10 min，將上層液體(即收集的蛋白)移入另一EP管，直接用于實驗或-80 ℃保存。用BCA蛋白定量法測定蛋白濃度，根據(jù)凝膠配置試劑盒說明書進(jìn)行配膠，經(jīng)SDS-PAGE分離、轉(zhuǎn)膜將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，用含5%牛奶TBST封閉2 h 后孵育 I 抗，4 ℃搖床過夜后，TBST洗膜3次，每次5 min,室溫?fù)u床孵育 II 抗2 h，再次洗膜后進(jìn)行曝光(超敏ECL法)。

3.6RT-qPCR檢測miRNA33的轉(zhuǎn)染效率及ABCA1和ABCG1的mRNA表達(dá) 待細(xì)胞干預(yù)后，吸取培養(yǎng)液，PBS清洗細(xì)胞3次，用TRIzol試劑提取RNA，用紫外分光光度計來測定RNA的濃度以及純度，使RNA的A260/A280保持在1.9～2.1之間；按照TaKaRa逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書合成cDNA；PCR擴(kuò)增反應(yīng)條件為95 ℃預(yù)變性30 s; 95 ℃ 5 s、60 ℃ 30～60 s，循環(huán)40次進(jìn)行PCR反應(yīng)，以HS-ACTB作為內(nèi)參照。運(yùn)用2-ΔΔCt進(jìn)行分析。

3.7液體閃爍計數(shù)法測膽固醇流出率 將RAW264.7源性泡沫細(xì)胞用[3H]標(biāo)記的膽固醇負(fù)荷培養(yǎng)24 h，用PBS液清洗2次，換用新的培養(yǎng)液(含10%胎牛血清和1%青、鏈霉素鈉)按上述實驗條件培養(yǎng)細(xì)胞，干預(yù)后用PBS液洗滌細(xì)胞，后培養(yǎng)于含25 mg/L 載脂蛋白A-I (apolipoprotein A-I, ApoA-I)的新鮮培養(yǎng)基6 h，經(jīng)閃爍液裂解細(xì)胞后，用閃爍計數(shù)法檢測培養(yǎng)液和細(xì)胞的[3H]標(biāo)記的膽固醇。膽固醇流出率(%)=培養(yǎng)液閃爍計數(shù)/(培養(yǎng)液閃爍計數(shù)+細(xì)胞閃爍計數(shù))×100% (閃爍計數(shù)的單位為min-1)。

3.8高效液相色譜檢測細(xì)胞內(nèi)膽固醇含量 藥物干預(yù)后按上述方法清洗RAW264.7源性泡沫細(xì)胞，加入一定量的0.5% NaCl溶液，超聲波粉碎10 min，將裂解的液體分成2份，分別用于總膽固醇和游離膽固醇的提取。取合適的膽固醇標(biāo)準(zhǔn)品溶解于流動相中，置于10 mL玻璃瓶中，等倍比稀釋5個不同濃度梯度于EP管中，分別是0、78.125、156.25、312.5、625和1 250 mg/L，將上述標(biāo)準(zhǔn)品溶液分別注入高效液相色譜儀，進(jìn)樣量為10 μL，以膽固醇的質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)X軸，其峰面積為縱坐標(biāo)Y軸，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。采用Waters反向C18柱，流動相為異丙醇+乙腈(兩者體積1∶1)，流速 1 mL/min，柱溫 40 ℃，將各實驗組所得的樣品溶液按上述色譜條件，進(jìn)樣20 μL，記錄膽固醇的峰面積。計算總膽固醇量(total cholesterol，TC)和游離膽固醇(free cholesterol，F(xiàn)C)量，總膽固醇量減去游離膽固醇量為膽固醇酯(cholesteryl ester，CE)的量。

4 統(tǒng)計學(xué)處理

采用SPSS 19.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行分析，數(shù)據(jù)均采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示，多組間比較采用單因素方差分析(one-way ANOVA)，組間兩兩比較采用SNK-q檢驗法，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

1 油紅O染色觀察細(xì)胞內(nèi)脂滴含量

在相差倒置熒光顯微鏡20倍鏡下觀察誘導(dǎo)成功后的泡沫細(xì)胞，細(xì)胞被染成橘黃色，見圖1A；同時在鏡下觀察到miRNA-33 mimics轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞脂滴含量比miRNA-33 inhibitor組的脂滴含量多，見圖1B。

Figure 1.Oil red O staining to observe intracellular lipid droplets (×200).A: observation of successfully induced RAW264.7 foam cells; B: observation of intracellular lipid droplets after transfection of miRNA-33 mimics and miRNA-33 inhibitor.

圖1油紅O染色觀察細(xì)胞內(nèi)脂滴含量

2 miRNA-33 mimics/inhibitor對RAW264.7源性泡沫細(xì)胞ABCA1和ABCG1表達(dá)的影響

將miRNA-33 mimics或miRNA-33 inhibitor轉(zhuǎn)染至RAW264.7源性泡沫細(xì)胞內(nèi)，經(jīng)同一濃度Hcy干預(yù)后，用RT-qPCR及Western blot 檢測ABCA1和ABCG1的表達(dá),結(jié)果發(fā)現(xiàn)與空白對照組相比，miRNA-33 mimics組ABCA1和ABCG1的mRNA及蛋白表達(dá)量較低，而miRNA-33 inhibitor組ABCA1和ABCG1的mRNA及蛋白表達(dá)量較高(P<0.05)，見圖2～4。

Figure 2.The effects of miRNA-33 mimics/inhibitor on the protein expression of ABCA1 in the RAW264.7 macrophage-derived foam cells determined by Western blot. Mean±SD.n=3.*P<0.05vsblank control group;△P<0.05vsmiRNA-33 mimics-NC group;#P<0.05vsmiRNA-33 inhibitor-NC group.

圖2miRNA-33mimics/inhibitor對RAW264.7源性泡沫細(xì)胞ABCA1蛋白表達(dá)的影響

3 miRNA-33 mimics/inhibitor對RAW264.7源性泡沫細(xì)胞內(nèi)膽固醇流出率的影響

將miRNA-33 mimics或miRNA-33 inhibitor轉(zhuǎn)染至RAW264.7源性泡沫細(xì)胞內(nèi)，經(jīng)同一濃度Hcy干預(yù)后，用液體閃爍計數(shù)法測各組細(xì)胞的膽固醇流出率，結(jié)果顯示miRNA-33 mimics組細(xì)胞的膽固醇流出率降低，miRNA-33 inhibitor組細(xì)胞的膽固醇流出率增加(P<0.05)，見圖5。

Figure 3.The effects of miRNA-33 mimics/inhibitor on the protein expression of ABCG1 in the RAW264.7 macrophage-derived foam cells determined by Western blot. Mean±SD.n=3.*P<0.05vsblank control group;△P<0.05vsmiRNA-33 mimics-NC group;#P<0.05vsmiRNA-33 inhibitor-NC group.

圖3miRNA-33mimics/inhibitor對RAW264.7源性泡沫細(xì)胞ABCG1蛋白表達(dá)

4 miRNA-33 mimics/inhibitor對RAW264.7源性泡沫細(xì)胞內(nèi)膽固醇含量的影響

將miRNA-33 mimics或miRNA-33 inhibitor轉(zhuǎn)染至RAW264.7源性泡沫細(xì)胞內(nèi)，經(jīng)同一濃度Hcy干預(yù)后，高效液相色譜檢測細(xì)胞內(nèi)的膽固醇含量，結(jié)果示miRNA-33 mimics組細(xì)胞的膽固醇含量較高，miRNA-33 inhibitor組細(xì)胞的膽固醇含量低下(P<0.05)，見表1。

討 論

隨著人們生活方式的改變，冠心病的發(fā)生率趨向于年輕化，且已成為導(dǎo)致患者死亡的主要原因之一[10]。動脈粥樣硬化是其發(fā)生的病理機(jī)制，而脂質(zhì)代謝紊亂是其導(dǎo)致AS發(fā)生的病理基礎(chǔ)，泡沫細(xì)胞的形成是AS的起始標(biāo)志之一[11]?，F(xiàn)在關(guān)于冠心病的治療及預(yù)防，尤其近年來在分子水平的研究仍是大家研究的重點。

Figure 4.The effect of miRNA-33 mimics/inhibitor on the mRNA expression of ABCA1 and ABCG1 in the RAW264.7 macrophage-derived foam cells detected by RT-qPCR. Mean±SD.n=3.*P<0.05vsblank control group;△P<0.05vsmiRNA-33 mimics-NC group;#P<0.05vsmiRNA-33 inhibitor-NC group.

圖4miRNA-33mimics/inhibitor對RAW264.7源性泡沫細(xì)胞ABCA1和ABCG1mRNA表達(dá)的影響

Figure 5.The effect of miRNA-33 mimics/inhibitor on the cholesterol efflux rate in the RAW264.7 macrophage-derived foam cells determined by liquid scintillation counting. Mean±SD.n=3.*P<0.05vsblank control group;△P<0.05vsmiRNA-33 mimics-NC group;#P<0.05vsmiRNA-33 inhibitor-NC group.

圖5液體閃爍計數(shù)儀檢測細(xì)胞膽固醇流出率

表1miRNA-33mimics/inhibitor對RAW264.7源性泡沫細(xì)胞內(nèi)膽固醇含量的影響

Table 1.The effects of miRNA-33 mimics/inhibitor on cholesterol content in the RAW264.7 macrophage-derived foam cells (Mean±SD.n=3)

GroupTC (mg/dL)FC (mg/dL)CE (mg/dL)CE/TC (%)Blank control396±10150±4246±662miRNA-33 mimics600±8?△254±10?△346±6?△57miRNA-33 mimics-NC403±12146±4257±1263miRNA-33 inhibitor286±24?#95±4?#191±13?#66miRNA-33 inhibitor-NC408±7147±3261±963

TC: total cholesterol; FC: free cholesterol; CE: cholesteryl ester.*P<0.05vsblank control group;△P<0.05vsmiRNA-33 mimics-NC group;#P<0.05vsmiRNA-33 inhibitor-NC group.

同型半胱氨酸是甲硫氨酸循環(huán)代謝的中間產(chǎn)物，研究證明其是冠心病的獨立危險因素，并且血Hcy水平也是預(yù)測冠心病死亡率的指標(biāo)之一[12]。臨床上將由各種原因?qū)е碌难獫{同型半胱氨酸超過15 μmol/L稱為高同型半胱氨酸血癥(hyperhomocysteinemia，HHcy)[13]。 Hcy可通過以下機(jī)制導(dǎo)致AS：增強(qiáng)基質(zhì)金屬蛋白酶的表達(dá)及促進(jìn)血管平滑肌增殖；促進(jìn)氧化應(yīng)激、炎癥反應(yīng)、細(xì)胞凋亡和血管內(nèi)皮功能障礙；破壞體內(nèi)凝血與纖溶間的平衡關(guān)系，導(dǎo)致血小板聚集和血液凝固性增高；通過引起膽固醇調(diào)節(jié)障礙及抑制ABCA1和ABCG1表達(dá)降低膽固醇逆轉(zhuǎn)運(yùn)效率等多種機(jī)制導(dǎo)致AS[14-15]。我們在實驗中發(fā)現(xiàn)Hcy可以通過抑制ABCA1和ABCG1的表達(dá)降低RCT，導(dǎo)致AS。

膽固醇逆轉(zhuǎn)運(yùn)是以HDL為載體排出體內(nèi)多余膽固醇的主要途徑之一[16]。ABCA1和ABCG1作為ATP結(jié)合盒轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(ATP-binding cassette transporter，ABC)家族的成員，均包含由180個氨基酸組成的標(biāo)志性ATP 結(jié)合域，即核酸結(jié)合域(nucleotide-binding domain，NBD)，均以ATP作為能量供應(yīng)體對體內(nèi)各種物質(zhì)進(jìn)行轉(zhuǎn)運(yùn)，同時也是膽固醇逆轉(zhuǎn)運(yùn)的重要調(diào)控靶點，ABCA1和ABCG1在RCT過程中主要負(fù)責(zé)膽固醇的流出[17]。

miRNAs是高度保守的單鏈非編碼RNA，在轉(zhuǎn)錄及轉(zhuǎn)錄后水平參與機(jī)體病理、生理及脂質(zhì)代謝調(diào)控[18]。2010年，Rayner等[3]和Horie 等[19]發(fā)現(xiàn)miRNA-33與宿主基因固醇調(diào)節(jié)元件結(jié)合蛋白(sterol-regulatory element binding protein，SREBP)共轉(zhuǎn)錄，在轉(zhuǎn)錄后水平參與調(diào)控抑制RCT關(guān)鍵酶ABCA1和ABCG1的表達(dá)，參與膽固醇逆轉(zhuǎn)運(yùn)代謝。miRNA-33包括miRNA-33a和miRNA-33b 2個亞基，其位于內(nèi)含子miRNA的SREBP處的堿性螺旋-環(huán)-螺旋亮氨酸拉鏈轉(zhuǎn)錄因子的主要功能是調(diào)節(jié)糖、脂代謝[20-21]。我們在本研究中發(fā)現(xiàn)，給予同一濃度Hcy干預(yù)后，miRNA-33 mimics組的ABCA1和ABCG1mRNA和蛋白表達(dá)量及膽固醇流出率相比miRNA-33 inhibitor組均是下降的，且miRNA-33 mimics組細(xì)胞內(nèi)的膽固醇含量相比miRNA-33 inhibitor組是增加的，而空白對照組和miRNA-33 mimics-NC組和miRNA-33 inhibitor-NC組3組相比較，所檢測指標(biāo)均無統(tǒng)計學(xué)顯著性，說明miRNA-33 mimics可以通過抑制ABCA1和ABCG1的表達(dá)抑制RCT，導(dǎo)致AS。因此初步得出結(jié)論Hcy可以通過誘導(dǎo)miRNA-33抑制ABCA1和ABCG1的mRNA和蛋白表達(dá)抑制RCT，導(dǎo)致AS。

本研究是從細(xì)胞水平探討同型半胱氨酸致動脈粥樣硬化的新機(jī)制，存在一定缺陷，接下來我們將繼續(xù)從動物水平進(jìn)一步驗證。