林 玲， 高 麗， 師瑞紅

(河南醫(yī)學(xué)高等?？茖W(xué)校生理教研室， 河南 鄭州 451191)

創(chuàng)傷后應(yīng)激障礙(posttraumatic stress disorder，PTSD)是指個(gè)體經(jīng)歷、目睹或遭遇到一個(gè)或多個(gè)涉及自身或他人的實(shí)際死亡、受傷，或軀體完整性受到嚴(yán)重威脅，所導(dǎo)致的個(gè)體延遲出現(xiàn)并持續(xù)存在的一種精神障礙，以認(rèn)知功能減弱為主要特征[1-2]，在臨床上主要表現(xiàn)為病理性重視、持續(xù)性警覺性增高和回避[3]。PTSD已經(jīng)成為嚴(yán)重威脅人類健康甚至是生命的重要疾病之一，近年來雖受到廣泛關(guān)注，但其發(fā)病機(jī)制目前尚不十分清楚。有研究表明，在精神應(yīng)激的過程中，多個(gè)腦區(qū)參與了對(duì)機(jī)體功能的調(diào)節(jié)，包括大腦皮質(zhì)、海馬(hippocampus，Hippo)、杏仁核和下丘腦等。以往有關(guān)PTSD及機(jī)制的研究主要集中在海馬，但在前額葉皮層(prefrontal cortex，PFC)上的研究相對(duì)較少。本實(shí)驗(yàn)選擇海馬CA1區(qū)和PFC為共同靶點(diǎn)，通過行為學(xué)檢測PTSD大鼠的學(xué)習(xí)記憶能力，免疫組化、Western blot和免疫熒光檢測突觸小泡蛋白(synaptophysin)的表達(dá)，探討PTSD大鼠空間記憶損傷的機(jī)制。

材 料 和 方 法

1 材料

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 成年雄性Sprague-Dawley(SD)大鼠36只，SPF級(jí)，體質(zhì)量180～220 g,購于湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司，合格證號(hào): SCXK(湘)2011-0003。動(dòng)物飼養(yǎng)環(huán)境：通風(fēng)，自然光照環(huán)境，室溫維持在(22±1) ℃。

1.2主要試劑 兔抗突觸小泡蛋白多克?、窨官徸訟bcam；HRP標(biāo)記的羊抗兔甘油 II 抗、FITC標(biāo)記的羊抗兔熒光 II 抗、Triton X-100、 BSA和DAB顯色試劑盒等均購于碧云天生物技術(shù)有限公司。

1.3實(shí)驗(yàn)儀器 Morris水迷宮(北京醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥物研究所研制)；熒光顯微鏡和冰凍切片機(jī)(OLYMPUS);高速冷凍離心機(jī)(BECKMAN)；轉(zhuǎn)膜儀和電泳儀(北京六一儀器廠)。

2 方法

2.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物隨機(jī)分為正常對(duì)照(control)組和模型(model)組，每組18只。常規(guī)分籠飼養(yǎng)，每籠6只，采用國家標(biāo)準(zhǔn)嚙齒類動(dòng)物干燥飼料喂養(yǎng)，充足水分供應(yīng)。

2.2PTSD動(dòng)物模型的制備 按照文獻(xiàn)[4]的方法，模型組大鼠遭遇單次延長應(yīng)激(single prolonged stress, SPS)：禁錮2 h；強(qiáng)迫性游水20 min(水深40 cm、水溫25 ℃)；休息15 min后乙醚麻醉至意識(shí)喪失。2組動(dòng)物無干擾飼養(yǎng)，常規(guī)攝食飲水，飼養(yǎng)溫度為18～22 ℃。

2.3行為學(xué)測試 造模完成之后24 h行Morris水迷宮實(shí)驗(yàn),分為前5 d的定位航行實(shí)驗(yàn)與第6天的空間搜索實(shí)驗(yàn)：(1)定位航行實(shí)驗(yàn)：歷時(shí)5 d，每天1次，記錄大鼠找到水下平臺(tái)的時(shí)間(即逃避潛伏期)，超過120 s找不到平臺(tái)的，可引導(dǎo)其找到平臺(tái)，成績記為120 s。(2)空間搜索實(shí)驗(yàn)：實(shí)驗(yàn)第6天撤去水下平臺(tái)，大鼠于固定象限面向池壁入水，記錄120 s內(nèi)平臺(tái)所在象限的游泳時(shí)間和穿越平臺(tái)的次數(shù)。

2.4免疫組化實(shí)驗(yàn) 水迷宮實(shí)驗(yàn)結(jié)束后各組取6只大鼠進(jìn)行免疫組化實(shí)驗(yàn)。大鼠經(jīng)10%水合氯醛腹腔麻醉(300 mg/kg)后，經(jīng)4%多聚甲醛心臟灌注，快速取腦后固定，常規(guī)石蠟包埋，冠狀切片，片厚3 μm，切片常規(guī)脫蠟，蒸餾水沖洗，PBS沖洗3次，每次5 min,用枸櫞酸鹽緩沖液進(jìn)行微波抗原修復(fù)，于新配制的0.3% H2O2溶液中室溫下孵育10 min，PBS沖洗3次，每次5 min,滴加兔抗突觸小泡蛋白多克隆抗體(1∶500)，4 ℃孵育過夜，PBS沖洗， DAB顯色，常規(guī)脫水，透明，中性樹膠封片，光學(xué)顯微鏡下觀察，攝片。應(yīng)用ImageJ圖像分析軟件測定陽性細(xì)胞的平均積分吸光度值。

2.5Western blot實(shí)驗(yàn) 各組另取1/3大鼠(6只)在行為學(xué)實(shí)驗(yàn)完畢之后進(jìn)行Western blot實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)大鼠在腹腔麻醉后快速取出全腦，冰浴分離出海馬，RIPA充分裂解提取蛋白，BCA蛋白定量試劑盒(Novagen)測定蛋白濃度。調(diào)節(jié)各組蛋白濃度統(tǒng)一為0.5 g/L，加2×SDS上樣緩沖液，99 ℃變性10 min。每孔中加10 μL樣品，Tris-SDS PAGE轉(zhuǎn)印到硝酸纖維素膜上，用5%脫脂奶粉室溫封閉1 h，加入抗突觸小泡蛋白抗體4 ℃過夜。傾去 I 抗，TBST洗膜3次,每次15 min。分別加入滴加辣根過氧化酶標(biāo)記的羊抗兔IgG II 抗(1∶2 000)，置于搖床上搖動(dòng)，室溫下1 h；棄去II抗，TBST洗膜3次,每次15 min；ECL顯色，凝膠成像分析系統(tǒng)成像，檢測蛋白質(zhì)印跡條帶，Image J軟件分析求得平均吸光度值，以目的條帶與β-actin的吸光度比值表示目的蛋白的相對(duì)表達(dá)量。

2.6免疫熒光實(shí)驗(yàn) 各組取最后1/3大鼠進(jìn)行免疫熒光實(shí)驗(yàn)。將各組大鼠灌注后取腦，置于4% 多聚甲醛溶液中過夜，經(jīng)30%蔗糖溶液脫水后，用恒溫(-20 ℃)冰凍切片機(jī)作冠狀切片，厚度30 μm，隔 4片取 1片腦片，切片經(jīng)0.3% Ttiton X-100通透2 h，0.01 mol/L PBS漂洗3次,每次5 min，10% BSA封閉1 h，0.01 mol/L PBS漂洗3次,每次5 min。滴加突觸小泡蛋白I抗，4 ℃條件下孵育過夜; 復(fù)溫后0.01 mol/L PBS漂洗3次,每次5 min。暗室加入FITC標(biāo)記的羊抗兔 II 抗(1∶1 000)，室溫孵育2 h，0.01 mol/L PBS漂洗3次，每次5 min, DAPI染核，防淬滅的封片劑封片，熒光顯微鏡下觀察拍片，每張切片檢測海馬CA1區(qū)平均陽性細(xì)胞數(shù)和積分吸光度(integral absorbance,IA; IPP 6.0軟件分析)。

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

所有實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示，經(jīng)SPSS 24.0處理，數(shù)據(jù)分析前經(jīng)正態(tài)性分布檢驗(yàn)，兩組間均數(shù)的比較采用t檢驗(yàn)。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 不同組別大鼠定位航行實(shí)驗(yàn)和空間搜索實(shí)驗(yàn)成績的比較

Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，在定位航行實(shí)驗(yàn)中，從實(shí)驗(yàn)第2天開始到第5天，與對(duì)照組比較，模型組大鼠逃避潛伏期均明顯延長(P<0.01)。在空間搜索實(shí)驗(yàn)中，與對(duì)照組比較，模型組大鼠在目標(biāo)象限的停留時(shí)間均明顯降低(P<0.01)，穿越原平臺(tái)位置的次數(shù)也明顯減少(P<0.01)，見表1、2。

表1 2組大鼠逃避潛伏期的比較

**P<0.01vscontrol group.

表22組大鼠目標(biāo)象限停留時(shí)間和穿越原平臺(tái)次數(shù)的比較

Table 2.Comparison of the target quadrant stay time and the times of crossing the platform in the 2 groups (Mean±SD.n=18)

GroupTarget quadrant stay time (s)Times of crossing the platformControl58.72±6.3512.65±1.74Model42.56±7.43??8.33±1.28??

**P<0.01vscontrol group.

2 免疫組化實(shí)驗(yàn)檢測2組大鼠海馬CA1區(qū)和PFC突觸小泡蛋白的表達(dá)

結(jié)果顯示，在海馬CA1區(qū)和PFC，胞漿內(nèi)呈現(xiàn)棕黃色顆粒為突觸小泡蛋白免疫反應(yīng)陽性細(xì)胞；與對(duì)照組比較,模型組大鼠海馬CA1區(qū)和PFC突觸小泡蛋白的表達(dá)均顯著減少，積分吸光度均顯著降低(P<0.05或P<0.01),見圖1。

3 Western blot實(shí)驗(yàn)檢測2組大鼠海馬和PFC突觸小泡蛋白的表達(dá)

結(jié)果顯示，與對(duì)照組比較，模型組大鼠海馬CA1區(qū)和前額葉皮層突觸小泡蛋白的表達(dá)均顯著減少(P<0.05或P<0.01),見圖2。

4 免疫熒光實(shí)驗(yàn)檢測2組大鼠海馬和PFC突觸小泡蛋白的表達(dá)

熒光顯微鏡下，海馬CA1區(qū)和PFC的神經(jīng)元胞漿內(nèi)可見FITC標(biāo)記的綠色熒光免疫反應(yīng)陽性產(chǎn)物為突觸小泡蛋白。對(duì)照組大鼠突觸小泡蛋白陽性細(xì)胞熒光染色強(qiáng)，模型組大鼠突觸小泡蛋白陽性細(xì)胞熒光染色淺,見圖3A、B。在海馬和PFC，與對(duì)照組比較，模型組大鼠突觸小泡蛋白陽性細(xì)胞數(shù)均呈顯著減少，積分吸光度呈顯著降低(P<0.05或P<0.01)，見圖3C、D。

Figure 1.The expression of synaptophysin in the CA1 region of hippocampus and PFC of the rats in the 2 groups was detected by immunohistochemical staining. The scale bar=20 μm. Mean±SD.n=6.*P<0.05,**P<0.01vscontrol group.

圖1免疫組化實(shí)驗(yàn)檢測2組大鼠海馬CA1區(qū)和PFC突觸小泡蛋白的表達(dá)

Figure 2.The expression of synaptophysin in the CA1 region of hippocampus and PFC of the rats in the 2 groups was detected by Western blot. Mean±SD.n=6.*P<0.05,**P<0.01vscontrol group.

圖2Westernblot實(shí)驗(yàn)檢測2組大鼠突觸小泡蛋白在海馬CA1區(qū)和前額葉皮層的表達(dá)

討 論

正常機(jī)體能夠?qū)Ω鞣N環(huán)境因素的復(fù)雜變化作出適應(yīng)性反應(yīng)，以適應(yīng)各種應(yīng)激，如果適應(yīng)能力下降就會(huì)導(dǎo)致各種疾病。PTSD是一種典型的應(yīng)激障礙性疾病，其臨床表現(xiàn)以再度體驗(yàn)創(chuàng)傷為特征,并伴有情緒的易激惹和回避行為,是一種創(chuàng)傷后心理失衡狀態(tài)[5-6]。

在本研究中，我們利用SPS構(gòu)建PTSD大鼠模型，在Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)中，模型組大鼠的逃避潛伏期較對(duì)照組明顯延長，撤去水下平臺(tái)之后，模型組大鼠目標(biāo)象限游泳時(shí)間明顯減少，穿越原平臺(tái)位置的次數(shù)也明顯減少，說明了PTSD大鼠的空間記憶能力明顯減退，這些都符合PTSD 的臨床特征，說明模型復(fù)制成功。

本課題組既往的研究表明，PTSD大鼠學(xué)習(xí)記憶能力減退與海馬5-HT1A受體表達(dá)明顯增加以及學(xué)習(xí)記憶相關(guān)蛋白PSD-95的表達(dá)明顯減少密切相關(guān)[7]。

Figure 3.The expression of synaptophysin in CA1 region of hippocampus (A) and PFC (B) of the rats in the 2 groups was observed by immunofluorescence, and the number of the synaptophysin positive cells (C) andIAvalues of synaptophysin (D) were determined. The scale bar=20 μm. Mean±SD.n=6.*P<0.05,**P<0.01vscontrol group.

圖3免疫熒光實(shí)驗(yàn)檢測2組大鼠在海馬CA1區(qū)和PFC突觸小泡蛋白的表達(dá)、突觸小泡蛋白陽性細(xì)胞計(jì)數(shù)和突觸小泡蛋白平均積分吸光度的比較

但是有沒有其他蛋白質(zhì)也參與了PTSD大鼠學(xué)習(xí)記憶能力的減退呢？突觸小泡蛋白是突觸前膜囊泡上的一種膜蛋白，是突觸囊泡中含量最為豐富的蛋白之一，它擔(dān)負(fù)著神經(jīng)遞質(zhì)的包裝、儲(chǔ)存、調(diào)節(jié)及釋放。大量研究表明，突觸小泡蛋白表達(dá)的增加能夠增強(qiáng)大鼠的空間辨別性學(xué)習(xí)記憶能力[8-9]。在本實(shí)驗(yàn)中，通過免疫組化、Western blot和免疫熒光實(shí)驗(yàn)檢測了PTSD大鼠海馬和PFC突觸小泡蛋白的表達(dá)，結(jié)果表明，PTSD大鼠均較對(duì)照組顯著減少，這可能也是導(dǎo)致其學(xué)習(xí)記憶能力減退的原因之一。

PFC在學(xué)習(xí)記憶等認(rèn)知行為中也具有非常重要的作用[10-11]，但以往關(guān)于PTSD發(fā)病機(jī)制的研究在額葉皮層上相對(duì)較少。在本實(shí)驗(yàn)中，PTSD模型大鼠PFC突觸小泡蛋白的表達(dá)較正常大鼠顯著減少，這與Campos等[12]和Carvalho-Netto等[13]的研究結(jié)果是一致的。研究表明，急性創(chuàng)傷性應(yīng)激可導(dǎo)致大鼠腦內(nèi)凋亡蛋白caspase-3和caspase-9的表達(dá)明顯增加[14-15]。這可能是創(chuàng)傷性應(yīng)激障礙導(dǎo)致腦內(nèi)促凋亡蛋白的表達(dá)增加，加速了神經(jīng)元的凋亡，進(jìn)而使學(xué)習(xí)記憶相關(guān)蛋白的表達(dá)減少，最終導(dǎo)致大鼠的空間認(rèn)知能力減退。

也有研究表明，在海馬CA1區(qū)和PFC之間有一個(gè)CA1-mPFC網(wǎng)絡(luò)環(huán)路，此環(huán)路通過多巴胺遞質(zhì)系統(tǒng)調(diào)節(jié)應(yīng)激性抑郁的認(rèn)知功能障礙[16]。故可作如下推測：在PTSD的大鼠模型中，當(dāng)大鼠接受創(chuàng)傷性刺激之后，激活腦內(nèi)的5-HT遞質(zhì)系統(tǒng)，使海馬神經(jīng)元損傷甚至是凋亡及壞死，突觸前膜突觸小泡蛋白的合成及釋放也減少，再通過海馬與PFC之間的神經(jīng)環(huán)路，進(jìn)而導(dǎo)致PFC學(xué)習(xí)記憶相關(guān)蛋白突觸小泡蛋白的表達(dá)減少，突觸可塑性的功能減退，最終導(dǎo)致大鼠的空間記憶能力減退。但是創(chuàng)傷后應(yīng)激所致認(rèn)知行為障礙的具體機(jī)制，還有待做更加深入的研究。