秦莉花， 劉 林， 成紹武， 李 晟， 王國(guó)佐， 黃 娟， 劉 洋， 王珊珊， 龔盛強(qiáng)， 程 誠(chéng)， 葛金文△

(湖南中醫(yī)藥大學(xué) 1中西醫(yī)結(jié)合心腦疾病防治湖南省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 2護(hù)理學(xué)院， 3第一附屬醫(yī)院， 4人文與管理學(xué)院， 湖南 長(zhǎng)沙 410208)

文獻(xiàn)研究顯示女性缺血性腦卒中患者治療后的死亡率、復(fù)發(fā)率、殘疾率和病死率明顯高于男性患者[1]；實(shí)驗(yàn)研究也發(fā)現(xiàn)雌性去勢(shì)后腦缺血發(fā)病率更嚴(yán)重[2];絕經(jīng)后女性更容易發(fā)生中風(fēng)[3]。缺血性腦卒中發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，涉及多方面[4]，最終導(dǎo)致神經(jīng)元死亡。而內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激(endoplasmic reticulum stress，ERS)介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡途徑是新發(fā)現(xiàn)的凋亡信號(hào)途徑[5]。 中醫(yī)藥治療中風(fēng)歷史悠久、有豐富的臨床經(jīng)驗(yàn)。腦泰方治療急性腦梗死臨床療效顯著[6]，本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)加味腦泰方(Jiawei-Naotai formula, JWNTF)能抑制缺血性腦卒中海馬神經(jīng)元死亡[2]。為了進(jìn)一步研究加味腦泰方抗去勢(shì)腦缺血大鼠神經(jīng)細(xì)胞死亡的機(jī)制，采用去勢(shì)腦缺血大鼠為研究對(duì)象，研究加味腦泰方對(duì)去勢(shì)腦缺血海馬神經(jīng)元活化轉(zhuǎn)錄因子4(activating transcription factor 4，ATF4)、C/EBP同源蛋白(C/EBP homologous protein，CHOP)、p53上調(diào)凋亡調(diào)控因子(p53 up-regulated modulator of apoptosis，Puma)、Bax、Bcl-2和caspase-3蛋白，以及Bax、Bcl-2和caspase-3 mRNA表達(dá)的影響。

材 料 和 方 法

1 動(dòng)物

清潔級(jí)雌性Sprague-Dawley (SD)大鼠24只，體質(zhì)量(230±10) g， 8～10周齡，由湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院實(shí)驗(yàn)中心提供，許可證號(hào)為SCXK(湘)2014-0013，常規(guī)標(biāo)準(zhǔn)飼料分籠喂養(yǎng)。

2 藥物

加味腦泰方由黃芪20 g、墨旱蓮15 g、地龍10 g、女貞子10 g、僵蠶10 g和川芎5 g組成，經(jīng)湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院實(shí)驗(yàn)中心經(jīng)水煎煮濃縮冷凍備用。實(shí)驗(yàn)用加味腦泰方的劑量是24 g/kg。17β-雌二醇(17β-estradiol,17β-E2)的劑量是0.18 mg/kg。所有藥物購(gòu)于湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院。

3 試劑與儀器

抗ATF4、CHOP、PUMA、Bax和Bcl-2抗體(北京博奧森公司)；抗caspase-3(activated)抗體(上海生工)； II 抗(北京中杉金橋公司)；ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒(GE Healthcare)；水合氯醛(國(guó)藥集團(tuán))；線栓(2636 A4，北京西濃科技有限公司)。凝膠成像分析系統(tǒng)(Bio-Rad)。

4 方法

4.1分組及給藥 將大鼠隨機(jī)分為假手術(shù)(sham)組、模型(model;去卵巢+腦缺血)組、陽(yáng)性對(duì)照(po-sitive control，PC；雌激素+去卵巢+腦缺血)組和加味腦泰方(JWNTF；加味腦泰方+去卵巢+腦缺血)組。行去卵巢術(shù)后第11天陽(yáng)性對(duì)照組和加味腦泰方組分別給予 17β-E2和加味腦泰方灌胃，劑量為0.18 mg/kg和24 g/kg，連續(xù)灌胃3 d；假手術(shù)組和模型組均給予等量生理鹽水灌胃。

4.2動(dòng)物模型的建立 參照前期的造模方法[2, 7]進(jìn)行去卵巢術(shù)和腦缺血模型的造模。將模型組、陽(yáng)性對(duì)照組和加味腦泰方組大鼠術(shù)前禁食12 h，腹腔注射0.1 kg/L水合氯醛麻醉后，于背部?jī)蓚?cè)剪開(kāi)約3 cm切口，扎緊雙側(cè)輸卵管后切除雙側(cè)卵巢，縫合；假手術(shù)組于背部剪開(kāi)切口后直接縫合。手術(shù)后腹腔注射青霉素3 d。

去卵巢術(shù)后第5天起，連續(xù)5 d，每天取大鼠陰道分泌物進(jìn)行涂片以不出現(xiàn)動(dòng)情周期反應(yīng)為去勢(shì)模型成功。去卵巢術(shù)后第14天模型組、陽(yáng)性對(duì)照組和加味腦泰方組大鼠采用大腦中動(dòng)脈內(nèi)栓線阻斷方法制備腦缺血模型，腹腔注射水合氯醛麻醉后，頸部正中切開(kāi)皮膚，暴露右頸總動(dòng)脈，分離頸外動(dòng)脈和頸內(nèi)動(dòng)脈，結(jié)扎頸外動(dòng)脈近、遠(yuǎn)心端，魚(yú)線插入頸內(nèi)動(dòng)脈，深度約(18.5±0.5) mm至微感阻力，用線固定線栓，逐層縫合。術(shù)后24 h進(jìn)行參考Longa的5分制法[5]進(jìn)行神經(jīng)功能評(píng)分，1～3分為模型成功。假手術(shù)組僅切開(kāi)皮膚、分離頸總動(dòng)脈后即縫合。

4.3RT-qPCR實(shí)驗(yàn) 腦缺血造模24 h行神經(jīng)功能評(píng)分后，大鼠用腹腔注射0.1 kg/L水合氯醛麻醉，將在冰盒上快速取右側(cè)海馬組織置于液氮凍存，-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆茫? mL TRIzol提取海馬組織總RNA，具體操作按照TRIzol試劑盒說(shuō)明的步驟進(jìn)行，RNA的濃度和純度分別通過(guò)紫外分光光度計(jì)測(cè)定和電泳檢測(cè)。按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA并進(jìn)行 PCR擴(kuò)增，反應(yīng)條件為: 95 ℃ 15 min; 95 ℃ 20 s、59 ℃ 1 min、95 ℃ 15 s、72 ℃ 15 s， 40個(gè)循環(huán)。反應(yīng)結(jié)束后確認(rèn)PCR的擴(kuò)增曲線和熔解曲線，得出Ct值，同一cDNA樣本設(shè)3個(gè)復(fù)孔，求其Ct均值，并以β-actin的Ct值作為內(nèi)參照。引物序列見(jiàn)表1。

表1 RT-qPCR的引物序列

4.4Western blot實(shí)驗(yàn) 將取材后于-80 ℃冰箱保存的海馬組織，按說(shuō)明書(shū)提取蛋白并測(cè)定含量，采用考馬斯亮藍(lán)法檢測(cè)蛋白質(zhì)含量。經(jīng)灌膠、上樣、凝膠電泳、轉(zhuǎn)膜等步驟后，加入5% TBST-BSA于室溫封閉1 h，分別與兔抗大鼠ATF4、CHOP、Puma、Bcl-2、Bax和caspase-3 抗體(1∶100)和兔抗大鼠β-actin抗體(1∶500)溶液混合，4 ℃搖床過(guò)夜，用TBST在室溫下脫色搖床上洗2次，每次10 min,再用TBS 1次,每次10 min。然后加入山羊抗兔 II 抗(1∶2 500)室溫下孵育1 h后，用TBST在室溫下脫色搖床上洗2次，每次10 min,再用TBS洗1次。采用ECL化學(xué)發(fā)光法顯影，加入ECL化學(xué)發(fā)光液反應(yīng)1 min后放入凝膠成像系統(tǒng)中掃描成像，以β-actin作為內(nèi)參照，用Quantity One軟件分析目標(biāo)條帶的吸光度。

5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

所有數(shù)據(jù)均輸入計(jì)算機(jī)，用SPSS 17.0軟件進(jìn)行處理。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示，多組間比較如方差齊時(shí)用訪查分析，并選擇SNK-q法進(jìn)行各組均數(shù)間的兩兩比較，方差不齊選擇Dunnett T3法。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 各組大鼠的神經(jīng)功能評(píng)分

與假手術(shù)組比較，其余各組大鼠的神經(jīng)功能評(píng)分明顯升高(P<0.05)；與模型組比較，陽(yáng)性對(duì)照組和加味腦泰方組大鼠的神經(jīng)功能評(píng)分明顯降低(P<0.05)；加味腦泰方組與陽(yáng)性對(duì)照組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性，見(jiàn)圖1。

Figure 1.Neurological deficit scores of the rats in each group. Mean±SD.n=6.*P<0.05vssham group;#P<0.05vsmodel group.

圖1各組大鼠的神經(jīng)功能評(píng)分

2 各組大鼠海馬Bax、Bcl-2和caspase-3的mRNA表達(dá)

與假手術(shù)組比較，其余各組Bax和caspase-3的mRNA表達(dá)明顯增高，Bcl-2的mRNA表達(dá)明顯降低(P<0.05)；與模型組比較，陽(yáng)性對(duì)照組和加味腦泰方組的Bax和caspase-3的mRNA明顯降低，Bcl-2明顯升高(P<0.05)；與陽(yáng)性對(duì)照組比較，加味腦泰方組caspase-3的mRNA表達(dá)明顯減低(P<0.05)，見(jiàn)表2。

表2 各組大鼠海馬組織中Bax、Bcl-2和caspase-3的mRNA表達(dá)

*P<0.05vssham group;#P<0.05vsmodel group;△P<0.05vsPC group.

3 加味腦泰方對(duì)去勢(shì)腦缺血大鼠海馬ATF4、CHOP、Puma、Bax、Bcl-2和caspase-3蛋白表達(dá)的影響

與假手術(shù)組比較，各組大鼠海馬組織中ATF4、CHOP、Puma、Bax和caspase-3的蛋白表達(dá)明顯升高，Bcl-2的蛋白水平明顯降低(P<0.05)；與模型組比較，陽(yáng)性對(duì)照組和加味腦泰方組的ATF4、CHOP、Puma、Bax和caspase-3蛋白表達(dá)明顯降低、Bcl-2明顯升高(P<0.05)；與陽(yáng)性對(duì)照組比較，加味腦泰方組的ATF4和Puma蛋白表達(dá)降低(P<0.05)，見(jiàn)圖2及表3、4。

Figure 2.The effects of JWNTF on the protein levels of Bax, Bcl-2, caspase-3, ATF4, CHOP and Puma determined by Western blot.

圖2Westernblot分析結(jié)果

表3各組大鼠海馬組織中Bax、Bcl-2和caspase-3蛋白的表達(dá)

Table 3.The protein expression of Bax, Bcl-2 and caspase-3 in the rat hippocampus of each group (Mean±SD.n=6)

GroupBcl-2BaxCaspase-3Sham0.845±0.0400.420±0.0301.144±0.098Model0.487±0.019?1.082±0.069?2.016±0.126?PC0.544±0.014?#0.738±0.024?#1.593±0.931?#JWNTF0.565±0.019?#0.682±0.043?#1.581±0.125?#

*P<0.05vssham group;#P<0.05vsmodel group.

表4各組大鼠海馬組織中ATF4、CHOP和Puma蛋白的表達(dá)

Table 4.The protein expression of ATF4，CHOP and Puma in the rat hippocampus in each group (Mean±SD.n=5)

GroupATF4CHOPPumaSham0.393±0.0580.469±0.0240.295±0.025Model0.837±0.033?0.899±0.147?0.603±0.065?PC0.568±0.011?#0.671±0.016?#0.498±0.010?#JWNTF0.513±0.034?#△0.577±0.080?#0.416±0.069?#△

*P<0.05vssham group;#P<0.05vsmodel group;△P<0.05vsPC group.

討 論

缺血性腦卒中神經(jīng)損傷的分子機(jī)制復(fù)雜，與鈣超載、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激和谷氨酸鹽中毒等密切相關(guān)[4]，其中CHOP通路是ERS誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡主要通路[8]，CHOP基因是ERS特異性轉(zhuǎn)錄因子，也是發(fā)生過(guò)度ERS的標(biāo)志。ERS上游3條信號(hào)通路IRE-1、ATF6和PERK途徑的激活存在廣泛交流，都能激活CHOP基因的轉(zhuǎn)錄，而最主要途徑為 PERK/elF2α/ATF4信號(hào)通路，誘導(dǎo)CHOP蛋白表達(dá)最為強(qiáng)烈[5],而CHOP是細(xì)胞凋亡的重要標(biāo)志物[9],因此，CHOP在PERK通路誘導(dǎo)的細(xì)胞調(diào)亡過(guò)程中起決定性的作用。CHOP與ATF4可能作為ERS和凋亡信號(hào)通路中重要的調(diào)節(jié)信號(hào)分子，決定細(xì)胞的最終走向[10],其中Puma是CHOP的一個(gè)下游基因，是Bcl-2家族BH3-onIy亞家族成員，其凋亡效應(yīng)是通過(guò)其BH3結(jié)構(gòu)域和Bax/Bak及Bcl-2/Bcl-xL相互作用、競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合Bcl而激活了Bax的轉(zhuǎn)位而實(shí)現(xiàn)。當(dāng)Bcl-2高表達(dá)時(shí)具有抗細(xì)胞凋亡作用，反之，則啟動(dòng)凋亡。Caspase家族成員中的 caspase-3被稱為“死亡執(zhí)行蛋白酶”，在細(xì)胞凋亡過(guò)程中占核心地位[11]。Bcl-2和Bax被激活后通過(guò)線粒體途徑介導(dǎo)細(xì)胞色素C和其它凋亡因子釋放，激活caspase-3，誘導(dǎo)細(xì)胞死亡。

當(dāng)細(xì)胞受到感染或缺血、缺氧刺激持續(xù)存在時(shí)，CHOP表達(dá)上調(diào)從而誘發(fā)細(xì)胞凋亡[9]。文獻(xiàn)報(bào)道氧糖剝奪引起海馬神經(jīng)元細(xì)胞損傷，ATF4表達(dá)增加[12]；動(dòng)物實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)腦缺血/再灌注大鼠模型中CHOP表達(dá)明顯升高[9，13]。雄性大鼠腦缺血后Bcl-2和caspase-3表達(dá)降低，Bax表達(dá)升高[14-15]，這與我們的實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致。本研究結(jié)果顯示去勢(shì)腦缺血大鼠海馬組織caspase-3表達(dá)明顯升高，與文獻(xiàn)報(bào)道一致[16]。

溶栓治療是治療急性期缺血性腦卒中最有效的治療方法。但是，由于溶栓治療時(shí)間窗的限制致目前患者行溶栓治療的比例很低[16]，因此，開(kāi)發(fā)一種安全、有效的藥物對(duì)缺血性腦卒中的治療非常必要。前期研究顯示加味腦泰方明顯抑制細(xì)胞死亡[2]。本研究顯示加味腦泰方抑制ATF4、CHOP、Puma、Bax和caspase-3表達(dá)，促進(jìn)Bcl-2表達(dá)，這提示加味腦泰方可能通過(guò)抑制ATF4/CHOP/Puma通路以減輕缺血性腦卒中腦損傷。加味腦泰方中黃芪、二至丸(女貞子、墨旱蓮)均具有植物雌激素作用[17-18]，前期也顯示能提高雌激素水平[2]。雌激素主要通過(guò)與雌激素受體(estrogen receptor，ER)結(jié)合而發(fā)揮作用，ER可通過(guò)其它轉(zhuǎn)錄因子(AP1和SP1等)與DNA非直接結(jié)合、非配體依賴式與DNA結(jié)合調(diào)節(jié)基因的表達(dá)。沉默AP-1基因后CHOP基因表達(dá)降低[19]，而PUMA基因富含GC序列，SP1和Puma基因的啟動(dòng)子相結(jié)合，促進(jìn)Puma表達(dá)從而誘導(dǎo)凋亡[20]，提示ATF4/CHOP/Puma通路與ER密切相關(guān)。而本研究不足之處是并未研究?jī)烧叩南嚓P(guān)性，今后將采用ER和ATF4/CHOP/Puma通路的抑制劑進(jìn)行干預(yù),進(jìn)一步研究?jī)烧叩年P(guān)系。