許武軍， 謝娟娟， 陳 仙

(南華大學(xué)附屬第二醫(yī)院泌尿外科， 湖南 衡陽 421000)

尿源性膿毒血癥(urosepsis)是由泌尿生殖系統(tǒng)感染引起的全身性惡性炎癥反應(yīng)綜合征，約占膿毒血癥的30%[1]。近年來，隨著醫(yī)療水平的不斷提高，抗感染治療以及器官功能支持療法獲得快速發(fā)展，但是膿毒血癥的死亡率仍高達(dá)30%～70%[2]。腎臟是尿源性膿毒血癥中最易受損的臟器之一，急性腎損傷(acute kidney injury，AKI)是膿毒血癥常見的重癥并發(fā)癥，膿毒血癥誘導(dǎo)的AKI死亡率可達(dá)75%左右[3]。研究證實(shí)硫化氫(hydrogen sulfide，H2S)作為繼NO和CO之后公認(rèn)的第3種氣體信號(hào)分子，具有調(diào)節(jié)中樞神經(jīng)的作用[4]。秦文瀚等[5]研究發(fā)現(xiàn)外源性H2S能夠顯著降低內(nèi)毒素脂多糖誘導(dǎo)的小鼠急性肺損傷；舒維等[6]研究證實(shí)H2S供體NaHS可以通過調(diào)節(jié)炎癥介質(zhì)的釋放減輕大鼠急性肺損傷。不僅如此，H2S還可以通過調(diào)節(jié)感染性免疫應(yīng)答反應(yīng)減輕膿毒血癥引發(fā)的急性肺損傷[7-8]。Toll樣受體4(Toll-like receptor 4，TLR4)可以通過激活下游髓樣分化因子88(myeloid differentiation factor-88，MyD88)依賴的信號(hào)通路，刺激炎癥因子的合成以及釋放。磷脂酰肌醇3-激酶(phosphatidylinositol 3-kinase，PI3K)是細(xì)胞內(nèi)重要的調(diào)控蛋白，參與細(xì)胞的生長、分化、增殖和凋亡。TLR4通路的激活可以促進(jìn)PI3K下游蛋白Akt的磷酸化，從而激活核因子κB (nuclear factor-κB，NF-κB)，最終誘導(dǎo)炎癥反應(yīng)。本研究通過使用大腸桿菌建立兔上尿路感染所致的膿毒血癥模型，探究TLR4/MyD88/PI3K通路在H2S保護(hù)尿源性膿毒性腎損傷中的作用機(jī)制。

材 料 和 方 法

1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

40只雄性新西蘭白兔，體重(2.0±0.2)kg,購自南華大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物學(xué)部，許可證號(hào)為SYXK(湘)2015-0001。實(shí)驗(yàn)開始前，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物先在動(dòng)物室適應(yīng)性喂養(yǎng)2周，溫度(23±2)℃。大腸桿菌(ATCC 25922)由南華大學(xué)附二醫(yī)院微生物室提供。

2 主要試劑

NaHS購自Sigma；抗TLR4、MyD88、PI3K、p-PI3K、Akt和p-Akt抗體購自Abcam；白細(xì)胞介素1β(interleukin-1β，IL-1β)、IL-6和腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)ELISA試劑盒購自Bio-swamp；中性粒細(xì)胞明膠酶相關(guān)脂質(zhì)運(yùn)載蛋白(neutrophil gelatinase-associated lipocalin，NGAL)、腎損傷分子1(kidney injury molecule 1，KIM-1)和血降鈣素原(procalcitonin，PCT)ELISA試劑盒購自上海遠(yuǎn)慕生物科技有限公司；TLR4通路抑制劑TAK-242購自MedchemExpress；BCA試劑盒購自碧云天生物公司。

3 主要方法

3.1尿源性膿毒血癥動(dòng)物模型的建立 根據(jù)隨機(jī)數(shù)字表法將40只新西蘭白兔隨機(jī)分為正常對(duì)照(control)組、假手術(shù)(sham)組、模型(sepsis)組、NaHS處理(NaHS)組及NaHS聯(lián)合TAK-242處理(NaSH+TAK-242)組，每組8只。對(duì)照組8只白兔給予正常飼料和水喂養(yǎng)，不做處理。造模前腹腔注射戊巴比妥鈉(40 mg/kg)麻醉動(dòng)物，假手術(shù)組8只白兔麻醉后左下腹腹直肌旁切口打開腹腔分離出左輸尿管中段，腸管復(fù)位后關(guān)閉并縫合切口；24只白兔分離并結(jié)扎左側(cè)輸尿管中段，將1×1011/L的大腸桿菌懸液注入輸尿管管腔內(nèi)，注射劑量0.5 mL/kg。 NaHS處理組在造模后經(jīng)耳緣靜脈注射濃度為50 mmol/L的NaHS，注射劑量為 8.4 μmol/kg，TAK-242組術(shù)后耳緣靜脈注射0.5 mg/kg TAK-242。所有白兔術(shù)后給予正常顆粒飼料和水喂養(yǎng)。術(shù)后72 h將所有白兔安樂死，動(dòng)脈取血，取適量腎組織固定于4%多聚甲醛中用于組織病理學(xué)檢測(cè)，另取適量腎組織于EP管中保存于-80 ℃?zhèn)溆谩?/p>

3.2腎組織的HE染色 取適量腎臟組織使用4%多聚甲醛固定、石蠟包埋制作病理切片。將石蠟切片經(jīng)脫蠟、蘇木精染色、分化以及藍(lán)化后伊紅染色、洗滌脫水以及透明后封片。使用光學(xué)顯微鏡觀察組織變化情況并攝片。

3.3血液指標(biāo)的檢測(cè) 靜脈取血5 mL，3 000 r/min，離心10 min，取上清。使用全自動(dòng)生化分析儀檢測(cè)血清肌酐(serum creatinine，SCr)和血尿素氮(blood urea nitrogen，BUN)水平。使用ELISA法檢測(cè)血清中NGAL、KIM-1、PCT以及炎癥因子IL-1β、IL-6和TNF-α的水平。

3.4Western blot檢測(cè)蛋白水平 取兔腎臟組織50 mg于2.0 mL EP管中，加入1 mL含蛋白酶抑制劑的RIPA裂解液，每管加入2粒玻璃珠，均漿器勻漿5 min后,4 ℃、12 000 r/min離心15 min。取上清使用BCA試劑盒檢測(cè)蛋白濃度。每組取30 μg蛋白進(jìn)行SDS-PAGE，檢測(cè)TLR4、MyD88、PI3K、p-PI3K、Akt和p-Akt的蛋白水平。以GAPDH作為內(nèi)參照，使用BanScan 5.0軟件進(jìn)行灰度值分析。

4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

使用SPSS 19.0軟件進(jìn)行所有數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示，各組之間的比較采用單因素方差分析(one-way ANOVA)，組間兩兩比較采用SNK-q檢驗(yàn)，以P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 NaHS對(duì)膿毒血癥兔腎臟組織病理學(xué)影響

HE染色結(jié)果顯示，control組和sham組的兔腎臟組織結(jié)構(gòu)完整，無充血以及炎性細(xì)胞浸潤;sepsis組兔腎小球變形，腎曲小管濁腫變形壞死，腎小管管腔變大，腎間質(zhì)充血，大量炎性細(xì)胞浸潤;NaHS和NaHS聯(lián)合TAK-242處理后上述變化顯著減輕，見圖1。

Figure 1.The histopathological changes of rabbit kidneys were observed by HE staining. Arrow: renal interstitial hyperemia and edema, and inflammatory cell infiltration; oval: necrosis and detachment of renal tubular epithelial cells.

圖1HE染色觀察兔腎臟組織病理變化

2 NaHS處理顯著改善膿毒血癥兔血清SCr和BUN水平

Sepsis組兔血清中SCr和BUN水平顯著高于對(duì)照組(P<0.05)，但NaHS處理后兔血清中SCr和BUN水平顯著降低(P<0.05)，且TAK-242聯(lián)合NaHS處理后膿毒血癥兔血清中BUN水平顯著低于NaHS組(P<0.05),見圖2。

3 NaHS處理顯著改善膿毒血癥兔血清NGAL、KIM-1和PCT水平

Sepsis組兔血清中NGAL、KIM-1和PCT水平與對(duì)照組比顯著升高(P<0.05)；與sepsis組相比，NaHS處理后兔血清NGAL、KIM-1和PCT的水平顯著降低(P<0.05)；與NaHS組相比，NaHS聯(lián)合TAK-242處理組兔血清中NGAL和PCT進(jìn)一步降低(P<0.05)，見圖3。

4 NaHS處理顯著改善膿毒血癥兔血清炎癥因子水平

膿毒血癥模型組兔血清中的促炎因子IL-1β、IL-6和TNF-α水平顯著高于對(duì)照組(P<0.05)；NaHS處理72 h后能顯著降低膿毒血癥兔血清中IL-1β、IL-6和TNF-α的水平，說明NaHS能在一定程度上緩解膿毒血癥誘發(fā)的炎癥反應(yīng)(P<0.05)；使用TAK-242抑制TLR4通路以后，血清炎癥因子IL-6和TNF-α水平進(jìn)一步降低(P<0.05)，見圖4。

Figure 2.The levels of BUN and SCr in the rabbits of each group. Mean±SD.n=8.*P<0.05vscontrol group;#P<0.05vssepsis group;▲P<0.05vsNaHS group.

圖2各組兔BUN和SCr水平的變化

Figure 3.The levels of NGAL, KIM-1 and PCT in the rabbit se-rum of each group. Mean±SD.n=8.*P<0.05vscontrol group;#P<0.05vssepsis group;▲P<0.05vsNaHS group.

圖3各組兔血清中NGAL、KIM-1和PCT含量的變化

5 TLR4/MyD88/PI3K通路參與NaHS減輕膿毒血癥誘導(dǎo)的急性腎損傷的作用

膿毒血癥兔腎組織中TLR4和MyD88蛋白水平顯著上升(P<0.05)，PI3K/Akt通路激活，p-PI3K和p-Akt的蛋白水平顯著上升(P<0.05)；NaHS處理后TLR4/MyD88/PI3K通路激活受到顯著抑制，說明NaHS可以通過抑制TLR4/MyD88/PI3K信號(hào)通路激活減輕膿毒血癥型腎損傷,見圖5。

Figure 4.The levels of IL-1β, IL-6 and TNF-α in the rabbit serum of each group. Mean±SD.n=8.*P<0.05vscontrol group;#P<0.05vssepsis group;▲P<0.05vsNaHS group.

圖4各組兔血清炎癥因子IL-1β、IL-6和TNF-α含量的變化

討 論

膿毒血癥的致病機(jī)制是誘發(fā)全身性惡性炎癥反應(yīng)，急性腎損傷是其常見的并發(fā)癥，若不及時(shí)采取有效的治療措施極易誘發(fā)多器官功能衰竭。炎癥介質(zhì)的釋放在膿毒血癥誘導(dǎo)的機(jī)體損傷中起關(guān)鍵作用，與病情發(fā)展的嚴(yán)重程度以及預(yù)后明顯相關(guān)[9]。在膿毒血癥急性腎損傷發(fā)展過程中，炎癥反應(yīng)介導(dǎo)血管內(nèi)皮損傷和腎小管功能紊亂，提示抑制機(jī)體炎癥免疫反應(yīng)可能為有效治療膿毒血癥急性腎損傷提供新的治療策略。

本研究中兔尿源性膿毒血癥造模72 h后血清SCr和BUN濃度顯著升高，說明膿毒血癥造模成功；且膿毒血癥相關(guān)AKI標(biāo)志物NGAL、KIM-1和PCT含量也顯著升高，說明發(fā)生了急性腎功能損傷。此外，免疫調(diào)節(jié)因子IL-1β、IL-6和TNF-α在sepsis模型動(dòng)物血液中的水平也顯著提高，說明炎癥反應(yīng)在尿源性膿毒血癥腎損傷中發(fā)揮重要作用。TLR4/MyD88通路在調(diào)節(jié)炎癥因子釋放過程中發(fā)揮重要作用。TLR4作為炎癥上游因子可以通過識(shí)別細(xì)胞表面抗原，發(fā)揮信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)功能以及介導(dǎo)炎癥反應(yīng)[10];MyD88作為TLR4的下游信號(hào)分子，可以通過與TLR4結(jié)合調(diào)控炎癥因子的合成與釋放，參與炎癥反應(yīng)[11];PI3K作為細(xì)胞內(nèi)重要的調(diào)節(jié)因子，在細(xì)胞的生長和凋亡中發(fā)揮重要作用;TLR4可以通過作用于p85亞基激活PI3K/Akt通路。本研究通過Western blot技術(shù)檢測(cè)TLR4、MyD88以及PI3K/Akt通路蛋白的表達(dá)情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在尿源性膿毒血癥兔腎組織中TLR4和MyD88蛋白表達(dá)顯著升高，且PI3K/Akt信號(hào)通路激活，表明尿源性膿毒血癥AKI與TLR4/MyD88/PI3K信號(hào)通路相關(guān)。

Figure 5. The protein levels of TLR4, MyD88, PI3K, p-PI3K, Akt and p-Akt in the rabbit kidney tissues. Mean±SD.n=3.*P<0.05vscontrol group;#P<0.05vssepsis group;▲P<0.05vsNaHS group.

圖5兔腎組織中TLR4、MyD88、PI3K、p-PI3K、Akt和p-Akt蛋白水平的變化

研究表明腎組織可以通過胱硫醚β-合成酶和胱硫醚γ-裂解酶作用于含硫氨基酸產(chǎn)生內(nèi)源性H2S，發(fā)揮腎功能調(diào)節(jié)作用[12]。越來越多的研究證實(shí)H2S在膿毒血癥腎損傷中發(fā)揮重要保護(hù)作用。我們的前期研究也證實(shí)H2S可以通過抑制NF-κB信號(hào)通路阻斷炎癥因子的表達(dá)，減輕尿源性膿毒血癥腎損傷[13]。本研究結(jié)果也發(fā)現(xiàn)NaHS處理后，sepsis兔血液中炎癥因子IL-1β、IL-6和TNF-α及Scr、BUN水平顯著降低，腎損傷相關(guān)標(biāo)志物NGAL、KIM-1和PCT也顯著降低，說明NaHS處理能夠顯著緩解尿源性膿毒血癥性急性腎損傷。TLR4/MyD88信號(hào)通路作為NF-κB的上游調(diào)節(jié)因子可以調(diào)控NF-κB的表達(dá)。為進(jìn)一步探究NaHS在保護(hù)尿源性膿毒血癥性腎損傷中的作用機(jī)制，我們檢測(cè)了腎組織中TLR4/MyD88/PI3K信號(hào)通路，以及使用NaHS聯(lián)合TLR4抑制劑TAK-242處理，結(jié)果發(fā)現(xiàn)NaHS顯著抑制腎組織中TLR4/MyD88/PI3K信號(hào)通路的激活，且使用聯(lián)合TLR4抑制劑處理后對(duì)損傷腎臟的保護(hù)作用加強(qiáng)。陳克研等[14]研究也證實(shí)抑制TLR4信號(hào)通路，可以通過抑制炎癥反應(yīng)發(fā)揮對(duì)腎臟的保護(hù)作用。