徐慶磊，Serafino M.A.Augustino，米思遠(yuǎn)，王雅春，黃錫霞，張 勤，俞 英*

（1.新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院，新疆烏魯木齊 830052；2.中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，北京 100193）

仔豬腹瀉常導(dǎo)致仔豬生長(zhǎng)發(fā)育停滯、飼料報(bào)酬低、成活率降低，給養(yǎng)豬業(yè)帶來(lái)了巨大損失[1]。有研究表明，產(chǎn)腸毒素大腸桿菌（Enterotoxigenic Escherichia coli，ETEC）是引起新生和斷奶仔豬腹瀉的主要致病菌，其中F4型ETEC是危害最大的致病菌之一[2]。仔豬對(duì)產(chǎn)腸毒素大腸桿菌F4（ETEC F4）的抗性或易感是由大腸桿菌黏附素性菌毛能否黏附到小腸上皮細(xì)胞表面的受體上決定的，其通過(guò)釋放腸毒素引起水鹽代謝紊亂進(jìn)而導(dǎo)致腸腔內(nèi)積液引發(fā)腹瀉[3]。因此，研究控制ETEC F4的受體基因，有助于開(kāi)展豬分子抗病育種工作，選育出F4型大腸桿菌腹瀉抗性豬。

Fu等[4]通過(guò)全基因組關(guān)聯(lián)分析篩選到可能編碼ETEC F4受體蛋白的候選基因整合素β5（ITGB5）、黏蛋白13（MUC13）等。牛曉艷等[5]發(fā)現(xiàn)，豬ITGB5基因上3個(gè)SNP與仔豬腹瀉顯著相關(guān)。王文文[6]利用CRISPR/Cas9 技術(shù)敲除ITGB5基因后，發(fā)現(xiàn)該基因缺失顯著降低黏附到小腸上皮細(xì)胞上的 ETEC數(shù)目，而過(guò)表達(dá)會(huì)增加細(xì)菌黏附數(shù)。截止到目前為止，沒(méi)有關(guān)于ITGB5基因在抗性和易感豬的表達(dá)差異的報(bào)道。

本實(shí)驗(yàn)利用熒光定量PCR技術(shù)檢測(cè)ITGB5和MUC13基因在仔豬ETEC F4抗性和易感個(gè)體間的差異表達(dá)情況以及在不同組織間的表達(dá)差異，驗(yàn)證ITGB5和MUC13基因作為ETEC F4候選受體基因的功能，進(jìn)而為選育出ETEC F4抗性豬提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料 本實(shí)驗(yàn)所用動(dòng)物為中國(guó)農(nóng)科院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物場(chǎng)飼養(yǎng)的大白仔豬，所有仔豬飼養(yǎng)于相同環(huán)境。在35日齡屠宰189頭大白仔豬并采集其小腸、脾臟、肺臟、胸腺、肝臟和淋巴，現(xiàn)場(chǎng)液氮保存，之后轉(zhuǎn)移到-80℃冰箱儲(chǔ)存。提取RNA所用試劑Trizol Reagent購(gòu)自Ambion（美國(guó)），反轉(zhuǎn)錄試劑盒購(gòu)自TaKaRa（大連），熒光定量試劑盒購(gòu)自Roche（德國(guó)）。

1.2 黏附實(shí)驗(yàn)和基因分型 首先在屠宰后2 h內(nèi)收集約10 cm的空腸段，沿其縱軸切開(kāi)，并用低滲EDTA溶液（5 mmol/L，pH 為7.4）清洗。用顯微鏡載玻片刮擦空腸組織的黏膜表面，并經(jīng)后續(xù)處理制備得到小腸上皮細(xì)胞。將小腸上皮細(xì)胞刷狀緣細(xì)胞懸浮液和ETEC F4懸浮液（各0.1 mL）與0.4 mg/mL甘露糖混合，并在室溫下孵育30 min。顯微鏡觀察細(xì)菌黏附情況，根據(jù)黏附到小腸上皮細(xì)胞上的細(xì)菌個(gè)數(shù)將49頭ETEC F4不黏附的仔豬劃分為ETEC F4抗性群體，而小腸上皮細(xì)胞與ETEC F4黏附的140頭仔豬劃分為ETEC F4易感群體，這項(xiàng)工作已經(jīng)由本課題組其他成員在前期完成[7]。本實(shí)驗(yàn)同時(shí)對(duì)前期通過(guò)全基因組關(guān)聯(lián)分析（GWAS）找到的與ETEC F4黏附表型顯著關(guān)聯(lián)且位于ITGB5基因和MUC13基因內(nèi)部的SNP進(jìn)行基因分型。首先提取小腸組織基因組DNA，分別針對(duì)ITGB5基因和MUC13基因的SNP，利用Primer 6和Oligo 6軟件設(shè)計(jì)引物，引物序列見(jiàn)表1。PCR擴(kuò)增體系為25 μL：金牌Mix 22 μL，上、下游引物各 1 μL（10 nmol/μL），DNA 模板 1 μL。反應(yīng)條件：95℃ 2 min；98℃ 10 s，60℃ 10 s，72℃ 10 s，30個(gè)循環(huán)；72℃ 2 min。隨機(jī)選擇黏附和非黏附個(gè)體的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行Sanger雙向測(cè)序并進(jìn)行基因分型。綜合黏附表型與基因分型的結(jié)果，最終得到抗性和易感全同胞仔豬各4頭用于后續(xù)檢測(cè)基因表達(dá)量。

表1 SNP分型和熒光定量引物序列

1.3 RNA提取和反轉(zhuǎn)錄 Trizol法提取小腸、脾臟、肺臟、胸腺、肝臟和淋巴6個(gè)組織的總RNA，利用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)總RNA質(zhì)量，使用NANODROP 2000超微量分光光度儀測(cè)定RNA濃度和純度，-80℃冰箱保存。以總RNA為模板，按照試劑盒說(shuō)明反轉(zhuǎn)成cDNA。具體反應(yīng)程序：① 5× gDNA Eraser Buffer 2 μL，gDNA Eraser 1 μL， 總 RNA 1 μg，RNase Free ddH2O補(bǔ)足體系至 10 μL，反應(yīng)條件為42℃ 2 min或室溫 5 min；② 5×PrimeScript Buffer 2（for Real Time）4 μL，Prime-Script RT Enzyme Mix I 1 μL，RT Primer Mix 1 μL， ① 中反應(yīng)體系 10 μL，RNase free ddH2O 4 μL，總體積 20 μL，反應(yīng)條件為37℃ 15 min，85℃ 5 s。

1.4 實(shí)時(shí)熒光定量PCR 參照NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中ITGB5基因mRNA序列（登錄號(hào)：NM_001246669.1）和MUC13基因mRNA序列（登錄號(hào)：NM_001105293.1），利用Primer 6和Oligo 6軟件設(shè)計(jì)熒光定量引物，并以GAPDH和β-actin作為內(nèi)參基因。引物信息見(jiàn)表1，引物交由北京擎科生物技術(shù)有限公司合成。以小腸等6個(gè)組織的cDNA為模板，配置反應(yīng)體系：Blue-SYBRGreen mix 10 μL，F(xiàn)orward primer 1 μL，Reverse primer 1 μL，模板 cDNA 2 μL，ddH2O 6 μL，總反應(yīng)體積 20 μL。PCR擴(kuò)增程序：95℃預(yù)變性 10 min，95℃變性 10 s，60℃退火 10 s，72℃延伸 10 s，變性到延伸45 次循環(huán)；熔解曲線形成程序：95℃ 5 s，65℃ 1 min，97℃ 10 s，40℃ 10 s。利用 2-ΔΔCt公式計(jì)算基因的相對(duì)表達(dá)量，每個(gè)樣本3次重復(fù)，取平均值用于擴(kuò)增效率的檢測(cè)，并分析熔解曲線。

1.5 統(tǒng)計(jì)分析 使用SPSS 23.0軟件對(duì)表達(dá)量數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)和分析，結(jié)果用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，用單因素方差分析比較ITGB5和MUC13基因在6個(gè)組織中的表達(dá)量差異，用t檢驗(yàn)分析抗性和易感個(gè)體的組間差異性。P＜0.05表示差異顯著，P＜0.01表示差異極顯著。

2 結(jié) 果

2.1 ETEC F4抗性與易感個(gè)體的篩選 根據(jù)黏附表型選擇黏附和非黏附個(gè)體，并對(duì)于黏附表型顯著關(guān)聯(lián)且位于ITGB5基因和MUC13基因內(nèi)部的SNP進(jìn)行基因分型。如圖1所示，ITGB5基因在g.135577826位點(diǎn)存在T/C突變位點(diǎn)，并且T對(duì)C為顯性，即CC基因型個(gè)體對(duì)大腸桿菌 F4 菌株表現(xiàn)為抗性，TT基因型個(gè)體表現(xiàn)為易感；MUC13基因在g.135435490位點(diǎn)存在A/G突變位點(diǎn)，且A對(duì)G為顯性，即GG基因型個(gè)體對(duì)大腸桿菌 F4 菌株表現(xiàn)為抗性，AA基因型個(gè)體表現(xiàn)為易感。結(jié)合黏附表型的結(jié)果，最終得到基因純合型抗性和易感全同胞仔豬各4頭。

圖1 ITGB5和MUC13基因遺傳變異位點(diǎn)測(cè)序圖

2.2 ITGB5和MUC13基因在大白仔豬不同組織中的表達(dá)譜 如圖2所示，ITGB5基因在不同組織中均有所表達(dá)，其中在肺臟中高度表達(dá)，并顯著高于小腸、淋巴、胸腺和肝臟（P＜0.05），在脾臟中表達(dá)量較高，顯著高于小腸和淋巴（P＜0.05），而在小腸、淋巴、胸腺和肝臟中表達(dá)量較低；MUC13基因在小腸中高度表達(dá)，其表達(dá)量顯著高于脾臟、淋巴、胸腺、肝臟和肺臟（P＜0.05）。

圖2 ITGB5（A）和MUC13（B）基因在不同組織中的相對(duì)表達(dá)量

2.3 ITGB5和MUC13基因在ETEC F4抗性和易感大白仔豬的表達(dá)差異分析 針對(duì)ITGB5基因（圖3-A），在ETEC F4抗性個(gè)體的小腸組織中的表達(dá)量低于易感個(gè)體（P＞0.05）；ETEC F4抗性個(gè)體的肺臟組織中的表達(dá)量顯著低于易感個(gè)體（P＜0.05）。對(duì)于MUC13基因（圖3-B），其在ETEC F4抗性個(gè)體小腸組織和胸腺中的表達(dá)量均顯著高于易感個(gè)體（P＜0.05），而在其他組織中抗性和易感個(gè)體未見(jiàn)顯著性差異（P＞0.05）。

圖3 ITGB5和MUC13基因在大白豬F4大腸桿菌抗性與易感型個(gè)體間的表達(dá)差異

2.4 候選基因相關(guān)分析及免疫相關(guān)基因在仔豬小腸組織中的表達(dá)差異分析 由圖4可見(jiàn)，IL-6基因在抗性個(gè)體中的表達(dá)量低于易感個(gè)體，其余免疫相關(guān)基因IL-8、TNF-α、NF-κB在抗性個(gè)體中的表達(dá)量均高于易感個(gè)體，但均未達(dá)到統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05）。

圖4 免疫相關(guān)基因在抗性和易感大白仔豬的表達(dá)量差異分析

3 討 論

3.1 仔豬腹瀉抗性相關(guān)基因ITGB5和MUC13的組織表達(dá)差異 本研究檢測(cè)ITGB5和MUC13基因的組織表達(dá)情況發(fā)現(xiàn)，ITGB5在不同組織中均有不同程度表達(dá)，其中在肺臟中高度表達(dá)，在脾臟組織中度表達(dá)，而在小腸、淋巴、胸腺和肝臟中表達(dá)量較低。整合素αvβ3與ITGB5基因編碼的整合素αvβ5同屬于整合素家族，整合素αvβ3廣泛表達(dá)于內(nèi)皮細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞等[8]，而肺臟中含有微血管內(nèi)皮細(xì)胞以及脾臟中含有大量的巨噬細(xì)胞，這也可能是ITGB5基因在肺臟和脾臟中表達(dá)量較高的原因。MUC13基因在小腸中高度表達(dá)，在脾臟、淋巴、胸腺、肝臟和肺臟中表達(dá)量較低或幾乎不表達(dá)。欽偉云等[9]研究發(fā)現(xiàn)，MUC13基因在梅山斷奶仔豬的十二指腸和空腸中高度表達(dá)，這與本研究結(jié)果一致。上皮細(xì)胞表面分泌的黏蛋白在抵抗腸道致病菌感染中起重要作用，因此MUC13基因在小腸中高度表達(dá)，其編碼的黏蛋白可能與致病性大腸桿菌發(fā)生互作，阻止致病菌結(jié)合糖蛋白分子，從而降低了黏附到小腸上皮細(xì)胞的細(xì)菌數(shù)，提高了機(jī)體的抵抗力。

3.2 ITGB5和MUC13基因在腹瀉抗性和易感大白仔豬間的表達(dá)差異分析 本實(shí)驗(yàn)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，ITGB5基因在抗性個(gè)體小腸中的表達(dá)量低于易感個(gè)體，這說(shuō)明ITGB5基因的低表達(dá)水平可能有助于防御F4型ETEC對(duì)仔豬小腸上皮細(xì)胞的侵襲，該基因在仔豬腹瀉抗性調(diào)控過(guò)程中發(fā)揮重要作用。本研究還發(fā)現(xiàn)，MUC13基因在抗性個(gè)體小腸中的表達(dá)量顯著高于易感個(gè)體。針對(duì)MUC13基因在抗性和易感個(gè)體中的表達(dá)量差異，前人的研究結(jié)果不一。Schroyen等[10]研究發(fā)現(xiàn)，MUC13基因在抗性個(gè)體中的表達(dá)量顯著高于易感個(gè)體，與本研究結(jié)果一致。而楊懷谷[11]研究發(fā)現(xiàn)，在蘇太豬與杜×長(zhǎng)×大三元雜交商品豬中，MUC13基因在不同黏附表型個(gè)體中的表達(dá)無(wú)顯著性差異；Sinha等[12]研究印度本地豬種不同黏附表型個(gè)體的MUC13基因在空腸表達(dá)的差異性時(shí)發(fā)現(xiàn)，MUC13基因在黏附豬個(gè)體和不黏附個(gè)體的表達(dá)量未達(dá)到顯著性差異。這可能是由于豬種不同導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)結(jié)果不一致。

針對(duì)MUC13基因分型結(jié)果，本研究發(fā)現(xiàn)表現(xiàn)為抗性個(gè)體的GG型為野生型，表現(xiàn)為易感個(gè)體的AA型為突變型，而針對(duì)ITGB5的基因分型與之相反。結(jié)果提示，突變型個(gè)體小腸中MUC13基因的低水平表達(dá)，可能導(dǎo)致其編碼的小腸上皮細(xì)胞表面的黏蛋白不能有效阻止致病性大腸桿菌結(jié)合糖蛋白分子，進(jìn)而使黏附到小腸上皮細(xì)胞的細(xì)菌數(shù)增加，仔豬表現(xiàn)為對(duì)致病性大腸桿菌易感。在抗性個(gè)體和易感個(gè)體中ITGB5基因的表達(dá)量盡管沒(méi)有顯著性差異，但I(xiàn)TGB5基因在抗性個(gè)體的表達(dá)量明顯高于易感個(gè)體，而MUC13基因內(nèi)部的SNP位點(diǎn)可能是調(diào)節(jié)突變，但它們是否為ETEC F4 受體基因真正的因果突變還需進(jìn)一步確定。

3.3 ITGB5和MUC13基因與仔豬腹瀉的關(guān)系 課題組前期通過(guò)GWAS發(fā)現(xiàn)，ITGB5和MUC13基因是仔豬腹瀉抗性的重要候選基因[4]。ITGB5基因編碼整聯(lián)蛋白的β亞基，整聯(lián)蛋白是參與細(xì)胞黏附的細(xì)胞表面受體，通過(guò)細(xì)胞表面介導(dǎo)細(xì)菌黏附的玻連蛋白，使整聯(lián)蛋白與致病菌黏附[13]。MUC13基因編碼的黏蛋白是由導(dǎo)管和腺上皮組織表達(dá)的分泌于細(xì)胞表面糖蛋白家族成員。有研究表明，MUC13基因編碼的蛋白對(duì)黏膜上皮具有保護(hù)和潤(rùn)滑的作用，可以降低細(xì)胞與細(xì)胞及細(xì)胞外基質(zhì)的黏附[14-16]。ETEC F4黏附到ITGB5或MUC13基因可能編碼的受體蛋白上，感染小腸上皮細(xì)胞，往往能激活免疫反應(yīng)，導(dǎo)致免疫相關(guān)基因的表達(dá)量發(fā)生變化。本研究發(fā)現(xiàn)在抗性和易感個(gè)體中免疫相關(guān)基因IL-6、IL-8、TNF-α、NF-KB均未見(jiàn)顯著性差異。Zhou等[17]研究發(fā)現(xiàn)，與未攻菌組相比，ETECs 感染后會(huì)引起豬小腸上皮細(xì)胞系IPEC-J2 細(xì)胞中免疫相關(guān)基因顯著上調(diào)。Devriendt等[18]同樣發(fā)現(xiàn)，ETEC F4感染 IPEC-J2 細(xì)胞均顯著增加IL-6 和IL-8 的表達(dá)。上述研究結(jié)果與本研究結(jié)果不一致，可能的原因是，在本試驗(yàn)中根據(jù)黏附試驗(yàn)得到黏附抗性和易感個(gè)體并檢測(cè)其免疫基因的表達(dá)量，與他人實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)方法不同，即實(shí)驗(yàn)組對(duì)IPEC-J2 細(xì)胞系進(jìn)行ETEC攻菌，對(duì)照組進(jìn)行PBS處理不同，導(dǎo)致研究結(jié)果有區(qū)別。

基于本研究以及已報(bào)道的2個(gè)候選基因的功能，本研究提出候選基因?qū)4型ETEC的抗性調(diào)控假說(shuō)。如圖5所示，致病性大腸桿菌通過(guò)玻連蛋白（Vn）的橋梁作用間接黏附到ITGB5基因編碼的整合素V5受體蛋白，引起“觸發(fā)”機(jī)制使致病菌定植到小腸上皮細(xì)胞并釋放腸毒素，激活腺苷酸環(huán)化酶系統(tǒng)，使細(xì)胞內(nèi)環(huán)磷酸腺苷（cAMP）大量分泌，大量氯離子和水分子持續(xù)轉(zhuǎn)運(yùn)入腸腔引發(fā)腹瀉；另一方面MUC13基因編碼的黏蛋白具有保護(hù)和潤(rùn)滑腸道黏膜上皮并阻止或減少病原菌侵染的作用。因此，ITGB5和MUC13基因可能在抵御ETEC F4感染時(shí)均發(fā)揮作用，是ETEC F4引起仔豬腹瀉重要的抗性候選基因。

圖5 ETEC侵染仔豬小腸上皮細(xì)胞假說(shuō)

4 結(jié) 論

本研究發(fā)現(xiàn)，ITGB5基因的低水平表達(dá)可能有助于抵抗F4型ETEC對(duì)仔豬小腸上皮細(xì)胞的侵襲；MUC13基因在小腸中高度表達(dá)，且在抗性個(gè)體中的表達(dá)量顯著高于易感個(gè)體，表明MUC13基因的高表達(dá)可能有助于降低致病菌黏附到小腸上皮細(xì)胞上，進(jìn)而實(shí)現(xiàn)對(duì)致病性大腸桿菌的抗性。本實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步驗(yàn)證了仔豬腹瀉抗性候選基因ITGB5和MUC13的功能，這為仔豬抗腹瀉的育種工作提供了技術(shù)依據(jù)。