喻宗崗，蔣 雋，燕海峰*，謝農(nóng)村

（1.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，湖南長沙 410128；2.湖南省畜牧獸醫(yī)研究所，湖南長沙 410131；3.湖南佳牛牧業(yè)有限公司，湖南長沙 410143）

在采精、稀釋到凍精制作這一系列過程中，精液處于離體狀態(tài)，精子所處的環(huán)境驟變。精液稀釋時(shí)各種稀釋液和抗凍劑的添加導(dǎo)致胞內(nèi)組分增加，滲透壓、pH與體內(nèi)不一致導(dǎo)致精子正常機(jī)能受限或受損[1]；離體操作使精子較長時(shí)間與空氣接觸，精液中氧含量升高導(dǎo)致精細(xì)胞內(nèi)形成氧化自由基，各種酶活性降低，氧化還原平衡狀態(tài)被打破造成精子氧化損傷[2]；冷凍過程中溫度驟降所導(dǎo)致的胞內(nèi)水冰晶化造成精子機(jī)械損傷[3]。這些改變都不同程度地影響精子的正常機(jī)能，其中對精子機(jī)能影響最顯著的是溫度驟降使水冰晶化造成的機(jī)械損傷和精液中氧含量升高造成的氧化損傷[4]。本文主要從氧化損傷、機(jī)械損傷的機(jī)理及減輕損傷的途徑進(jìn)行綜述，以期為進(jìn)一步提高畜禽冷凍精液品質(zhì)提供思路，切實(shí)提高畜禽凍精品質(zhì)。

1 冷凍精液的抗氧化損傷及抗氧化劑應(yīng)用

1.1 氧化損傷原理 冷凍精液氧化是指精子結(jié)構(gòu)成分的氧化，包括脂質(zhì)氧化、蛋白質(zhì)氧化、核酸氧化和糖類氧化[5]。精子膜由大量脂類、少量的糖和蛋白質(zhì)構(gòu)成，而冷凍過程中形成的大量活性氧（ROS）首先會(huì)與膜上的脂類發(fā)生氧化反應(yīng)，因此脂類氧化對精子的危害最大。

精液從液態(tài)變?yōu)楣虘B(tài)的過程中，由于冷凍刺激使精細(xì)胞代謝異常驟然產(chǎn)生大量ROS，當(dāng)ROS濃度超過精細(xì)胞內(nèi)抗氧化系統(tǒng)清除上限時(shí)，ROS便會(huì)過度積累，打破氧化物和抗氧化物之間的動(dòng)態(tài)平衡，此時(shí)細(xì)胞膜上的脂類物質(zhì)就會(huì)發(fā)生氧化，此時(shí)精細(xì)胞便處于氧化應(yīng)激狀態(tài)[5]。氧化應(yīng)激會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞膜通透性增強(qiáng)，膜上離子通道受損，膜外鈣離子大量進(jìn)入胞內(nèi)，鈣離子失衡的精子內(nèi)部代謝紊亂，胞內(nèi)維持細(xì)胞正常機(jī)能的酶外泄，當(dāng)膜氧化受損嚴(yán)重時(shí)ROS會(huì)進(jìn)入胞內(nèi)，氧化胞內(nèi)遺傳物質(zhì)DNA[1]。當(dāng)氧化應(yīng)激水平超過細(xì)胞承受上限時(shí)，細(xì)胞死亡[2,5]。

1.2 抗氧化劑的抗氧化機(jī)制及在畜禽凍精中的應(yīng)用 抗氧化劑對于防止精液脂類氧化尤為關(guān)鍵，主要有維生素類、氨基酸類、酶類、糖類、蛋白類。

1.2.1 維生素類及其衍生物 細(xì)胞膜上含有大量的多不飽和脂肪酸（PUFA），當(dāng)脂肪酸受到自由基攻擊時(shí)，精細(xì)胞膜就會(huì)發(fā)生脂質(zhì)過氧化反應(yīng)。只要在中途將介導(dǎo)因子自由基清除，鏈?zhǔn)街|(zhì)過氧化反應(yīng)過程就會(huì)中斷[6]。反應(yīng)方式：

上述反應(yīng)中過氧化自由基過氧化物是由氧化自由基的產(chǎn)物與氧結(jié)合形成，過氧化物供氫與維生素類抗氧化劑結(jié)合阻止過氧化自由基的形成，反應(yīng)鏈就會(huì)中斷，從而防止細(xì)胞膜上脂類被氧化。

在凍精中添加的維生素種類主要是維生素B12、維生素C、維生素E、番茄紅素。添加維生素B12顯著提高了藏羊凍后精子活力和頂體完整率[7-8]。添加維生素C顯著提高豬精子的凍后活力、質(zhì)膜完整率和頂體完整率[9-10]和活率[9]及線粒體活性、抗氧化酶活性、精子存活時(shí)間[10]。在雞[11]和山羊[12]凍精中添加番茄紅素，雞受精效果不明顯，顯著提高了山羊精子活率、頂體完整性、質(zhì)膜完整性和線粒體活性。在雞[13]、豬[14]冷凍精液中添加維生素E，雞精子活力、雞和豬的精子活率和質(zhì)膜完整性均顯著提高，雞精子脂質(zhì)過氧化水平顯著降低。以上維生素類都提高了凍后精子活力和頂體完整率，但是除了雞的受精率外，對生產(chǎn)有效果的指標(biāo)幾乎沒有涉及。

1.2.2 氨基酸類 作為抗氧化劑的氨基酸主要是谷氨酰胺、?；撬?、亞牛磺酸、半胱氨酸、肉堿。氨基酸抗氧化機(jī)制有4種：一是直接清除自由基或活性氧；二是螯合金屬離子或還原金屬離子阻止其催化氫過氧化物生成氧自由基；三是與其他抗氧化劑發(fā)揮協(xié)同抗氧化作用；四是氨基酸與某些氧化脂質(zhì)發(fā)生化學(xué)反應(yīng)生成的次級產(chǎn)物具有抗氧化作用[15]。氨基酸在畜禽精液冷凍過程中的抗氧化機(jī)制主要以第4種為主。

在雞精液稀釋基礎(chǔ)液中添加氮乙酰半胱氨酸（NAC）后冷凍，其冷凍精液受精效果不明顯[11]；精子活力和質(zhì)膜完整性極顯著提高，且細(xì)胞凋亡顯著減少[16]。在雞凍精中添加谷氨酰胺顯著提高了活力、活率和質(zhì)膜完整性[17]。添加?；撬犸@著提高了內(nèi)蒙古絨山羊[18]、雞[19]和豬[20]冷凍精液的精子活率，顯著提高了馬[1]和豬[20]的精子活力、豬的精子頂體完整性[20-21]、雞的染色體完整性[19]和豬的質(zhì)膜完整性[20]；顯著降低了雞[19]和豬[20-21]脂質(zhì)過氧化水平、雞[19]和豬[20]線粒體活性、雞[19]的細(xì)胞凋亡水平。以上含硫氨基酸及其衍生物都是通過與自由基發(fā)生反應(yīng)起到抗氧化作用。添加肉堿顯著提高了雞[22]、人[23]和豬[20,24]的精子活率和活力，提高了豬[20,24]的線粒體活性、頂體完整性和質(zhì)膜完整性；降低了雞[22]、豬[20,24]和水牛[25]的脂質(zhì)過氧化水平。

1.2.3 酶類 精子膜有一個(gè)抗氧化系統(tǒng)，擁有抵御ROS和脂質(zhì)過氧化作用（LPO）的保護(hù)機(jī)制，主要包括超氧化物歧化酶 （SOD）、谷胱甘肽 （GSH）、過氧化氫酶（CAT）、谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-Px）和其他的一些抗氧化物質(zhì)[2]。

凍精中添加的抗氧化酶類主要是SOD、GSH、CAT等[11]。凍精中添加CAT，雞受精效果不明顯[11]，豬精子活力、活率、質(zhì)膜完整率和頂體完整率極顯著提高[9]。添加SOD顯著提高雞凍后精子活力[15]、雞和豬質(zhì)膜完整性[14-15]、豬凍后精子活率[14]。關(guān)中驢凍精中添加GSH及豬凍精中聯(lián)合添加100 IU/mL SOD+200 IU/ mL CAT，顯著提高冷凍-解凍后豬和關(guān)中驢精子活率和質(zhì)膜完整率及頂體完整率、豬精子活力及關(guān)中驢的凍后精子活率和線粒體完整性[9,26]。

1.2.4 糖類及其衍生物 糖類抗氧化機(jī)制可能是抑制氧自由基形成，提高過氧化物酶活性，防止胞內(nèi)酶外流，減少細(xì)胞脂質(zhì)過氧化，保持細(xì)胞膜通透性，但是具體機(jī)制還不明確[27]。透明質(zhì)酸可以使精子呈現(xiàn)均勻分布的狀態(tài)，因?yàn)槠浔旧淼母哒硿运鶐淼募?xì)胞空間的適當(dāng)滲透壓防止了細(xì)胞的聚集作用，從而防止了局部聚集區(qū)域缺氧而導(dǎo)致的細(xì)胞死亡。透明質(zhì)酸能夠吸收水分，從而能形成一個(gè)低濃度的水溶膠結(jié)構(gòu)。透明質(zhì)酸本身攜帶的負(fù)電荷可以吸附溶液中對頂體反應(yīng)中起關(guān)鍵作用的陽離子，尤其是鈣離子，這種吸附作用可以預(yù)防頂體反應(yīng)的發(fā)生[28]。

糖類主要是海藻糖、海帶多糖、紅景天多糖、透明質(zhì)酸。凍精中添加海藻糖顯著提高了山羊和牛精子活力[18,20,29]、山羊[18,29]精子質(zhì)膜完整率和頂體完整率、山羊[18]精子活率和線粒體活性，降低牛精子畸形率[30]；關(guān)中驢[26]、雞[31]凍精中添加海帶多糖均顯著提高了凍后精子活率、質(zhì)膜和頂體完整率以及線粒體活性；凍精中添加紅景天多糖顯著提高了藏豬[32]和雞[31]精子活率、頂體完整率、質(zhì)膜完整率及雞[31]精子線粒體活性，降低了藏豬精子畸形率[32]；在豬和雞精液中添加透明質(zhì)酸顯著提高了活力和頂體完整性，顯著提高了豬活動(dòng)精子百分率，顯著降低了豬和雞的氧化應(yīng)激水平，還顯著提高了雞的受精率和孵化率[9,33-35]。

1.2.5 白藜蘆醇 除以上抗氧化劑外，白藜蘆醇被廣泛應(yīng)用于畜禽及人凍精中。白藜蘆醇是一種天然的植物類抗氧化物質(zhì)，具有親脂性的非黃酮類多酚化合物是其抗氧化功能成分，該酚類化合物能夠抑制線粒體呼吸鏈中的復(fù)合酶Ⅲ的活性，防止ROS產(chǎn)生，其酚羥基可以清除芬頓反應(yīng)產(chǎn)生的氫氧自由基等ROS，抑制脂質(zhì)過氧化，它還可以調(diào)節(jié)GSH等抗氧化相關(guān)酶活性發(fā)揮抗氧化作用[36]。

在人凍精中添加白藜蘆醇，避免了精液冷凍保存造成的精子氧化損傷[37]、減少了精子DNA損傷和提高了保存精子的結(jié)構(gòu)完整性[38]；誘導(dǎo)增加的AMP依賴的蛋白激酶（Adenosine 5'-monophosphate(AMP)-activated Protein Kinase，AMPK）活性對冷凍狀態(tài)下精子DNA完整性和關(guān)鍵父本轉(zhuǎn)錄物有保護(hù)作用[39]。

在豬、牛、羊凍精中添加白藜蘆醇，顯著降低了山羊精子DNA損傷率[40]、水牛精子獲能狀態(tài)和氧化應(yīng)激[41]；顯著提高了水牛精子膜穩(wěn)定性和體外受精能力[41]、豬的精子活力[42]、牛的精子活率[43]、豬和牛的精子頂體完整性和精子質(zhì)膜完整率[42-43]。

2 機(jī)械損傷及其控制

2.1 機(jī)械損傷原理 在精液冷凍過程中，有一個(gè)危險(xiǎn)溫區(qū)，即液體發(fā)生強(qiáng)烈結(jié)晶過程的溫度范圍。該溫度范圍會(huì)導(dǎo)致冰晶增長及鹽溶液濃縮，冰晶增長及鹽溶液濃縮會(huì)嚴(yán)重?fù)p傷細(xì)胞的脂蛋白膜。這個(gè)危險(xiǎn)溫區(qū)通常在-50～0℃，最有害區(qū)是-25～-15℃[44]。溫度降低到冰點(diǎn)時(shí)會(huì)使精液中胞外水由液態(tài)轉(zhuǎn)化為固態(tài)，胞外水減少滲透壓升高，穩(wěn)態(tài)被破壞，細(xì)胞失水皺縮，隨著時(shí)間的增長胞內(nèi)水也會(huì)結(jié)晶，胞內(nèi)外水形成冰晶匯集體積增加，嚴(yán)重?fù)p傷胞內(nèi)細(xì)胞器、酶及染色體等功能物質(zhì)，導(dǎo)致細(xì)胞正常生存、獲能及受精機(jī)能降低甚至喪失，還會(huì)導(dǎo)致精子膜通道受阻，精子膜破損甚至精細(xì)胞裂解死亡[1]。

減輕液體結(jié)晶化造成的機(jī)械損傷有2種方式：一是通過向精液中添加抗凍劑；二是通過控制降溫速率快速越過危險(xiǎn)溫區(qū)。

2.2 抗凍劑 在精液冷凍過程中，由于溫度驟降會(huì)使精液內(nèi)的水結(jié)晶，水結(jié)晶會(huì)對精子造成機(jī)械損傷，嚴(yán)重限制精子的生理機(jī)能?？箖鰟┦且环N防止水在冷凍過程中由于溫度驟降而形成冰晶的物質(zhì)，在精液中添加抗凍劑是必需的。滲透性抗凍劑可以滲入細(xì)胞內(nèi)與胞內(nèi)水結(jié)合減少胞內(nèi)水結(jié)晶，增加胞內(nèi)滲透壓而吸收胞外水減少胞外水冰晶化，從而降低水冰晶化的機(jī)械損傷，增加了細(xì)胞膜的流動(dòng)性使精子正常機(jī)能得以維持[45]。

抗凍劑主要有甘油（glycerol）、二甲基乙酰胺（DMA）、二甲基甲酰胺（DMF）、二甲基亞砜（DMSO）、乙二醇（EG）、甲基乙酰胺（MA）、甲酰胺（Formamide），使用最廣泛的是甘油和DMA[11]。

在雞凍精中的研究結(jié)果均證明DMA的毒害作用小于甘油[46-47]，添加DMA和DMSO顯著提高了雞精子活率[46]，DMA凍精的受精率顯著高于甘油凍精[47]；柴局[18]研究報(bào)道，在山羊精液中添加DMSO精子質(zhì)膜完整性顯著高于EG、丙二醇，原因是DMA和DMSO的相對分子量小、粘度低、通透性強(qiáng)[46]。另外，聯(lián)合使用不同種抗凍劑的效果良好。Mosca等[48]研究報(bào)道，聯(lián)合添加滲透性冷凍保護(hù)劑MDA和非滲透性冷凍保護(hù)劑海藻糖顯著提高了雞精子活力和精子復(fù)蘇率；張育軍[49]研究報(bào)道，在安徽絨山羊精液稀釋液中添加1%MDF和6%甘油顯著提高了精子活率。除海藻糖外，以上添加的抗凍劑均為滲透性抗凍劑，它可滲入胞內(nèi)結(jié)合胞內(nèi)水，防止胞內(nèi)水形成冰晶且可使水處于過冷狀態(tài)，降低結(jié)晶溫度[46]，由此可見滲透性抗凍劑應(yīng)用更廣泛。

近幾年研究報(bào)道，環(huán)糊精也有良好的抗凍作用。Partyka等[50]報(bào)道，2-羥丙基-β-環(huán)糊精增加了精子脂膜流動(dòng)性，防止脂膜變成凝固態(tài)，減少解凍精子的冷凍損傷，提高了冷凍保存后精子活率和運(yùn)動(dòng)力。在豬、雞精液稀釋基礎(chǔ)液中添加高膽固醇環(huán)糊精，極顯著提高了雞凍后精子活力、頂體完整性，降低線粒體膜電位、受精率[51]，提高凍融后豬精子的活力、精子活率、頂體完整率和減少線粒體的損傷[52-53]。

2.3 冷凍速率

2.3.1 合適冷凍速率減輕機(jī)械損傷的原理 合適的冷凍速率能夠使精子內(nèi)部的水有足夠的時(shí)間向外滲出，這樣會(huì)使細(xì)胞內(nèi)外的化學(xué)勢達(dá)到平衡，細(xì)胞內(nèi)形成少量小冰晶，此時(shí)對精子造成的損傷小，精子生存率高。冷凍速率過快，細(xì)胞中的水滲出不充分，未滲出的水會(huì)形成大量體積龐大的冰晶，這些大冰晶對細(xì)胞有較大傷害，精細(xì)胞生存率降低；如果冷凍速率過慢，雖然化學(xué)勢達(dá)到平衡，但會(huì)形成較大的冰結(jié)晶，不利于精子生存[54]。因此，冷凍速率是冷凍精液質(zhì)量產(chǎn)生較大差異的因素。

2.3.2 冷凍速率控制途徑 控制冷凍速率的措施有程序儀控制和液氮熏蒸法。冷凍程序儀控溫速率更加精準(zhǔn)，但是設(shè)備昂貴；相比之下液氮價(jià)格較低，且熏蒸簡單易行。

張凱等[55]研究報(bào)道，以10%的DMSO作為冷凍保護(hù)劑，使用冷凍程序儀以7℃/min的冷凍速率，從5℃降至-35℃，再以9℃/min的冷凍速率，從-35℃下降至-120℃，這樣處理過的雞精液冷凍解凍效果最好。王捷等[56]報(bào)道，將0.25 mL豬細(xì)管精液放入程序冷凍儀中，以1℃/min的速率從4℃降至-5℃，當(dāng)溫度恒定在-5℃時(shí)，將細(xì)管置于液氮面3 cm上方熏蒸10 min，迅速投入到液氮中保存，解凍后精子功能完整性顯著提高。常永梅等[57]報(bào)道，藏羊細(xì)管精液冷凍曲線為4～-10℃（降溫速率 5℃/min）、-10～-100℃（降溫速率55℃/min）、-100～-140℃（降溫速率 20℃/min）時(shí)，精子凍后質(zhì)量較好。不同動(dòng)物使用的都是三段冷凍法，但下限溫度的設(shè)定不同，這可能與物種精子性質(zhì)有關(guān)，且在初始-中段-末段降溫速率依次為低-高-中，前段慢速降溫使抗凍劑有充分的時(shí)間滲透入細(xì)胞內(nèi)與胞內(nèi)水分結(jié)合，中段快速降溫可快速越過危險(xiǎn)溫區(qū)減少冰晶形成。

當(dāng)外部處于恒定室溫下，內(nèi)部充有部分液氮的液氮罐，其液氮上部空間的溫度分布相對穩(wěn)定，通過調(diào)整樣品在液氮罐中的位置，可以控制樣品的降溫速度、保溫時(shí)間、深冷次數(shù)和停留時(shí)間等參數(shù)，實(shí)現(xiàn)對樣品的最佳保存，為各種實(shí)際應(yīng)用提供便利條件[58]。

在液氮面上不同的距離處熏蒸不同時(shí)間即獲得不同的冷凍速率。鄧溯順等[59]將DMA細(xì)管精液置于液氮面上1 cm處熏蒸10 min后置于液氮中冷凍，解凍后獲得較好的活力；Long等[60]將DMA細(xì)管精液置于液氮面上1.25 cm處熏蒸2 min后置于液氮中冷凍，解凍后人工輸精獲得較好的受精率；Kowalczyk等[61]將MDF細(xì)管和顆粒精液置于液氮面2 cm處熏蒸3 min后置于液氮中冷凍，解凍后獲得較高的活率；將DMA細(xì)管精液置于液氮面3 cm處熏蒸1 min后置于液氮中冷凍，解凍后顯著提高精子復(fù)蘇率[48,62]、活力[48]；將甘油細(xì)管凍精在液氮面上4 cm處熏蒸7 min后解凍精子活力和活率[17,22,35]、頂體完整性[22]、線粒體膜電位[17]、脂質(zhì)過氧化水平和獲能力[22,35]以及受精率[17]都顯著提高；Abouelezz 等[47]將甘油細(xì)管和DMA細(xì)管置于液氮面上7 cm處熏蒸10.5 min解凍后人工輸精，DMA細(xì)管顯著提高精子活力和受精率。以上研究者均采用一步熏蒸法，即在凍精置于液氮面上某一距離熏蒸一定的時(shí)間后直接置于液氮中冷凍。也有研究者采用兩步熏蒸法，即在液氮面上2個(gè)不同距離熏蒸一定時(shí)間后置于液氮中冷凍。陽小胡等[63]將甘油細(xì)管凍精先置于液氮面上17 cm處熏蒸1～5 min，再置于1 cm處熏蒸1～5 min后置于液氮中冷凍，解凍后精子活力顯著提高。Chuaychu-noo等[51]將MDF細(xì)管先置于液氮面上11 cm處熏蒸12 min，再于3 cm處熏蒸5 min后置于液氮中冷凍，解凍后精子質(zhì)量顯著提高。一步熏蒸法熏蒸距離主要集中在1～4 cm處，但是熏蒸時(shí)間跨度很大，這可能與研究者使用的液氮量及液氮面上蒸汽層的高度不同有關(guān)，應(yīng)進(jìn)一步篩選并規(guī)范化。兩步熏蒸法增加了步驟和相關(guān)環(huán)節(jié)，相比之下一步熏蒸研究更多。

3 展 望

目前，大量抗氧化劑被用于冷凍精液冷凍研究中，但仍存在實(shí)驗(yàn)結(jié)果不一致、有受精率的結(jié)果少、哪種或哪類抗氧化劑才是高效抗氧化劑、每種或各類抗氧化劑影響精子凍后質(zhì)量的具體作用機(jī)制還不清楚等問題。此外，冷凍保護(hù)液的組分和含量直接影響液體的酸堿度和滲透壓，冷凍速率也可能通過溫度的變化等不同程度地對抗凍劑的擴(kuò)散和分布造成影響。未來對于精液冷凍的研究應(yīng)該致力于高效抗氧化劑的篩選、各種抗氧化劑對精子凍后質(zhì)量作用的具體機(jī)制、聯(lián)合使用各種抗氧化劑對精子不同結(jié)構(gòu)機(jī)能的作用以及精液冷凍保護(hù)液中的抗凍劑、抗氧化劑和冷凍速率間的互作效應(yīng)等方面。