白 云 ，黨李蘋 ，陳 航 ，王 斌 ，王哲鵬 *

（1.西北農(nóng)林科技大學(xué)動物科技學(xué)院，陜西楊凌 712100；2.略陽縣畜牧獸醫(yī)總站，陜西略陽 724300）

黃羽肉雞的外貌特征對其市場銷售具有重要影響，如三黃（黃羽、黃喙和黃脛）特征通常給消費(fèi)者傳遞“土雞”、“味道鮮美”、“營養(yǎng)價(jià)值高”等信息，成為消費(fèi)者選購的重要標(biāo)準(zhǔn)之一[1-2]。但在黃羽肉雞的選育中總有部分個(gè)體脛色發(fā)青，給黃羽肉雞的銷售帶來不利影響。

雞的青脛表型是由真皮沉積黑色素引起，受真皮黑色素抑制基因（Id）的調(diào)控[3]。Id 位點(diǎn)曾被定位到Z染色體上，攜帶顯性等位基因（Id）的個(gè)體將表型為白脛或黃脛，而攜帶隱性等位基因（id+）的個(gè)體將表現(xiàn)為青脛[3-4]。Dorshorst等[3]基于關(guān)聯(lián)定位結(jié)果提出，B4GALT1（β-1,4-Galactosyltransferase 1，β-1,4-半 乳糖轉(zhuǎn)移酶1）可能是對應(yīng)于Id位點(diǎn)的候選基因，但因果突變尚未被克隆。除了Id位點(diǎn)外，一些調(diào)控皮膚顏色的基因也可能對青脛的外顯產(chǎn)生干擾，如雞的黃皮膚基因BCDO2（β-Carotene Dioxygenase 2，β-胡蘿卜素雙加氧脫氫酶）[5]。BCDO2是一個(gè)可將有色的類胡蘿卜素分解為無色的脫輔基類胡蘿卜素的酶。當(dāng)BCDO2基因突變時(shí)會抑制類胡蘿卜素分解，引起黃皮膚表型[5]。如果選育的黃羽肉雞也攜帶BCDO2基因，則青脛表型的外顯率極有可能受飼料中核黃素、葉黃素等天然色素的干擾，給選育提純增大難度。

本研究旨在分析日齡、飼料、藥物等非遺傳因素對黃羽雞青脛表型外顯率的影響，檢測Id位點(diǎn)和BCDO2基因在金陵黃雞群體中的分布情況及與青脛表型的關(guān)聯(lián)性，為黃羽肉雞青脛選淘方法的建立提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物及分組 本研究以廣西金陵農(nóng)牧集團(tuán)有限公司黃羽肉雞配套系E系花雞為研究對象，選取來自同一批次出雛的1 950只祖代雞，隨機(jī)分為全價(jià)料組、自配料組和藥物組，經(jīng)21 d飼養(yǎng)并去除死淘樣本后，其中全價(jià)料組629只、自配料組638只、藥物組632只。全價(jià)料組全期飼喂正大公司肉仔雞全價(jià)配合飼料（表1）；自配料組全期飼喂金陵公司自配料（表1）；藥物組飼喂企業(yè)自配料，并在飲水中添加1 g/kg氟爾康（氟苯尼考）全期給雞飼喂，其他飼養(yǎng)條件與全價(jià)料和自配料組保持一致。飼養(yǎng)周期為45 d，在21日齡和45日齡由同一名觀察人員記錄雛雞脛色。試驗(yàn)動物均在同一棟雞舍飼養(yǎng)。

表1 日糧組成及營養(yǎng)成分（風(fēng)干基礎(chǔ)）

1.2 血樣采集與DNA提取 首先在同一黃羽肉雞群體內(nèi)，采集30只青脛和26只黃脛雞血樣。羅曼雞和尼克雞是已知的膚色與脛色被選育固定為黃皮膚的商業(yè)蛋雞品種，而略陽烏雞是青脛性狀被固定的一個(gè)地方品種。因此，本試驗(yàn)采集40只羅曼雞和15只尼克雞血樣作為黃脛陽性對照，采集15只略陽烏雞血樣作為青脛陽性對照。翅下靜脈采血，ACD抗凝（ACD:血液=1:4）。ACD配方為0.48 g 檸檬酸、1.32 g 檸檬酸三鈉、1.47 g葡萄糖，用雙蒸水溶解后定容至100 mL。

基因組DNA用全血基因組提取試劑盒（TaKaRa）按說明提取。所得DNA用TE緩沖液溶解，用0.8%瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA質(zhì)量，用NanoDrop2000（Thermo）測定DNA濃度并將濃度調(diào)至50 ng/μL，4℃儲存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 BCDO2基因和Id位點(diǎn)序列變異檢測 本研究主要對BCDO2基因C位點(diǎn)（BCDO2-SNP）的基因型[5]、Id位點(diǎn)的rs14686603（Id-SNP）及位于B4GALT1 3'UTR的1個(gè)SNP（B4G-SNP）[3]進(jìn)行檢測（表2）。

SNP基因型用PCR-RFLP檢測，部分結(jié)果用Sanger測序進(jìn)行驗(yàn)證。PCR-RFLP檢測所用引物和內(nèi)切酶信息見表2。PCR擴(kuò)增條件：94℃變性4 min，（94℃變性30 s，60℃退火25 s，72℃延伸25 s）×34循環(huán)，72℃延伸5 min。酶切體系：內(nèi)切酶0.5 μL（5 U），Buffer 1 μL，PCR 產(chǎn)物 2 μL，ddH2O 補(bǔ)齊至 10 μL。在37℃下用PCR儀孵育2 h，取6 μL酶切產(chǎn)物與2 μL上樣緩沖液混合，用2.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測酶切產(chǎn)物，電壓90 V進(jìn)行電泳45 min。電泳結(jié)束后用EB染色，用凝膠成像系統(tǒng)拍照記錄酶切結(jié)果。

1.4 統(tǒng)計(jì)分析 日齡、飼料、藥物及候選基因序列變異與脛色的關(guān)聯(lián)性均用SAS 9.2進(jìn)行卡方檢驗(yàn)分析，顯著水平為P＜0.05。

2 結(jié) 果

2.1 日齡、飼料和藥物對黃羽肉雞青脛外顯率的影響如表3所示，隨著日齡增長，全價(jià)料組和自配料組黃羽肉雞的青脛比例均顯著降低（P＜0.05），但藥物組變化不顯著（P＞0.05）。在相同日齡下，不同飼料和藥物添加對青脛外顯率均有顯著影響（P＜0.05）；21日齡時(shí)藥物組青脛比例最低，45日齡時(shí)全價(jià)料組青脛比例最低，其次是自配料組。因?yàn)槿珒r(jià)料、藥物和自配料組青脛比例在21日齡和45日齡的分布模式并不相同，因此這些結(jié)果也表明飼料、藥物和日齡對黃羽肉雞青脛外顯率的影響存在明顯的互作效應(yīng)。

表2 BCDO2及Id位點(diǎn)內(nèi)SNP信息

2.2 BCDO2和Id位點(diǎn)序列變異與青脛表型的關(guān)聯(lián)性分析 本研究用 PCR-RFLP檢測 BCDO2_SNP、Id_SNP和B4G_SNP的基因型，獲得預(yù)期大小的PCR和酶切產(chǎn)物，經(jīng)測序驗(yàn)證PCR-RFLP分型結(jié)果與測序結(jié)果一致（圖1）。

BCDO2_SNP和Id_SNP位點(diǎn)的3種基因型在各群體中的分布無顯著差異；B4G_SNP的AA型在帶有青脛表型的黃羽肉雞和略陽烏雞中以較高的頻率出現(xiàn)，而在帶有黃脛表型的尼克和羅曼雞中并未發(fā)現(xiàn)（表4）。在黃羽肉雞品種內(nèi)，本研究并未檢測到AA與青脛表型顯著關(guān)聯(lián)（P＞0.05）。

3 討 論

雞青脛表型通常被認(rèn)定為一個(gè)由單基因Id控制的質(zhì)量性狀[3]，但本研究在黃羽肉雞中發(fā)現(xiàn)青脛表型不僅受非遺傳因素影響，而且個(gè)體青脛外顯程度表現(xiàn)出連續(xù)變異性，因此更符合數(shù)量性狀遺傳特點(diǎn)。

本研究表明，隨著日齡增長，青脛的比例在全價(jià)料組和自配料組均顯著降低，特別是全價(jià)料組使用了更多含有核黃素、葉黃素等天然色素的玉米性原料，青脛比例隨著日齡以更大幅度在減少。本研究證明了日齡、飼料和藥物等非遺傳因素對青脛外顯率的影響，并發(fā)現(xiàn)黃皮膚基因BCDO2在黃羽肉雞群體中高頻出現(xiàn)。這為非遺傳因素參加與青脛的調(diào)控奠定分子基礎(chǔ)，即飼料中的類胡蘿卜素會因?yàn)锽CDO2基因的存在而在皮膚中大量沉積，影響青脛外顯率。

表3 日齡、飼料和藥物對黃羽肉雞青脛外顯率的影響

表4 BCDO2、Id及B4GALT1分型結(jié)果及基因型分布情況

在試驗(yàn)早期，青脛比例最低的是藥物組，但在試驗(yàn)后期藥物組的青脛比例并未像飼料組那樣隨著日齡增長逐漸降低。氟苯尼考是當(dāng)今家禽養(yǎng)殖中廣泛使用的一種廣譜類抗生素，但迄今為止它與類胡蘿卜素有怎樣的直接互作關(guān)系并不清楚。但氟苯尼考可能通過以下2種間接途徑影響類胡蘿卜素沉積，進(jìn)而影響雞的膚色：第一，預(yù)防性地使用氟苯尼考可以提高家禽抗病力，促進(jìn)類胡蘿卜素沉積。雞感染球蟲會抑制類胡蘿卜素在皮膚中沉積，而在飼料中添加鹽霉素能明顯緩解這種抑制作用，提高血清類胡蘿卜素水平，改善脛部著色[6]。第二，氟苯尼考可能通過影響雞腸道微生物群系結(jié)構(gòu)，影響類胡蘿卜素的代謝。長期使用抗生素不僅改變雞腸道微生物菌群結(jié)構(gòu)，而且還會對免疫力產(chǎn)生長遠(yuǎn)影響[7]。而腸道微生物在維生素的合成代謝方面發(fā)揮著重要作用，如B族維生素主要由腸道微生物合成，供宿主利用[8]。β-類胡蘿卜素作為維生素A前體，它的合成、代謝、吸收很可能受腸道微生物的影響?；谝陨涎芯炕A(chǔ)，本研究推測在21日齡以前，藥物組個(gè)體預(yù)防性地使用氟苯尼考導(dǎo)致抗病力增強(qiáng)，類胡蘿卜素沉積效率提高，因此青脛比例比飼料組低，但隨著用藥時(shí)間延長，雛雞的腸道菌群結(jié)構(gòu)發(fā)生明顯改變，對類胡蘿卜素沉積可能產(chǎn)生負(fù)面影響，造成藥物組在試驗(yàn)后期的青脛比例未持續(xù)降低。

Dorshorst等[3]發(fā)現(xiàn)Id_SNP與雞青脛表型顯著關(guān)聯(lián)。但本研究在黃羽肉雞群體內(nèi)不論是對Id_SNP，還是對候選基因B4GALT1內(nèi)的B4G_SNP均未檢測到這種關(guān)聯(lián)性。由于青脛表型的因果突變尚未被克隆，Id_SNP只是一個(gè)與性狀關(guān)聯(lián)的分子標(biāo)記。本研究推測，在黃羽肉雞傳代過程中，由于Id_SNP與因果突變間多次重組，這種關(guān)聯(lián)性可能消失；此外非遺傳因素可能對青脛表型的鑒定產(chǎn)生干擾，在關(guān)聯(lián)分析時(shí)引起誤差。盡管如此，這些結(jié)果并不能排除黃羽肉雞青脛表型具有遺傳基礎(chǔ)的可能性。本研究認(rèn)為，黃羽肉雞的青脛表型也是由基因突變引起，之所以呈現(xiàn)出數(shù)量性狀的特征可能與修飾基因、環(huán)境間的互作有關(guān)。如果上述推測成立，則解決黃羽肉雞青脛問題的根本在于淘汰青脛基因。B4G_SNP的AA基因型只在帶有青脛表型的品種中出現(xiàn)。如果A等位基因確實(shí)與青脛基因緊密連鎖，在黃羽肉雞中未檢測到關(guān)聯(lián)是因?yàn)榉沁z傳因素干擾，在今后的選育工作中應(yīng)該控制環(huán)境因素，分別統(tǒng)計(jì)AA型母雞的后代青脛比例是否顯著高于GG型。這不僅有助于澄清上述推測，而且將為B4G_SNP是否可用于黃羽肉雞青脛表型的選淘提供重要依據(jù)。

4 結(jié) 論

本研究證實(shí)了黃羽肉雞青脛表型受日齡、營養(yǎng)、藥物等非遺傳因素的影響。因黃羽肉雞群體中存在黃皮膚基因，因此非遺傳因素的作用可能通過類胡蘿卜素途徑實(shí)現(xiàn)。在當(dāng)前青脛表型遺傳基礎(chǔ)仍不清楚的前提下，通過營養(yǎng)調(diào)控（如在飼料中添加天然色素或加大黃玉米用量）是解決黃羽肉雞青脛問題最直接有效的措施。