韓慧，李敏，楊曉嵐，段躍強(qiáng)，谷宏婧，范鐵炯，李鑫，楊鵬輝，劉媛，閆芳，鄭源強(qiáng)，石艷春，趙忠鵬

1.內(nèi)蒙古自治區(qū)分子生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)，內(nèi)蒙古 呼和浩特010058；2.病原微生物生物安全國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，軍事科學(xué)院 軍事醫(yī)學(xué)研究院 微生物流行病研究所，北京100071；3.上海賽倫生物技術(shù)股份有限公司，上海 201707；4.解放軍總醫(yī)院 第五醫(yī)學(xué)中心，北京100039；5.山西農(nóng)業(yè)大學(xué) 動(dòng)物科技學(xué)院，山西 太谷030800

金黃色葡萄球菌是引起人類(lèi)感染和細(xì)菌性食物中毒的一種重要致病菌，在自然界中分布廣泛[1]。在歐美各國(guó)、日本、東南亞國(guó)家及我國(guó)，由金黃色葡萄球菌引起的食物中毒時(shí)有發(fā)生。歷年的食物中毒調(diào)查表明，由該菌引起的食物中毒事件排在整個(gè)細(xì)菌性食物中毒的前兩位[2]。

金黃色葡萄球菌腸毒素B（staphylococcal en?terotoxin B，SEB）是由金黃色葡萄球菌分泌的一種外毒素，可溶，耐熱，不受胰蛋白酶影響[3]。一般情況下，SEB 刺激嘔吐中樞會(huì)導(dǎo)致以嘔吐為主要癥狀的食物中毒，并且SEB 結(jié)合于腸壁上皮細(xì)胞的受體，促進(jìn)腸液與氯離子分泌，引起腹瀉癥狀。另外，SEB 是一種細(xì)菌超抗原，非特異性地激活T細(xì)胞，并因釋放過(guò)量細(xì)胞因子，產(chǎn)生毒副作用而致病，能引起人嘔吐、腹瀉、腹痛甚至致死性休克等中毒癥狀[4]。

目前，我國(guó)對(duì)SEB 中毒尚無(wú)有效防治藥品，只能對(duì)癥治療。因此，研制SEB 救治藥物是一項(xiàng)緊迫的任務(wù)。鑒于SEB 至今沒(méi)有有效的解毒劑，憑借歷史上解毒藥物開(kāi)發(fā)的經(jīng)驗(yàn)，利用當(dāng)代馬抗生產(chǎn)技術(shù)研制SEB 治療性抗體，是非常有價(jià)值的一種探索[7]。

在本研究中，我們利用成熟的治療性馬抗生物制品制備技術(shù)平臺(tái)，研制出馬抗SEB 免疫球蛋白F（ab'）2制品，為SEB 中毒的應(yīng)急救治提供了候選藥。

1 材料和方法

1.1 材料

體質(zhì)健康蒙古馬，4～6歲，10 匹，購(gòu)自赤峰博恩藥業(yè)有限公司，經(jīng)檢疫符合現(xiàn)行《中國(guó)藥典》要求；SPF 級(jí)BALB/c 小鼠，6～8周齡，購(gòu)自斯貝福（北京）生物技術(shù)有限公司；產(chǎn)SEB 重組菌株，實(shí)驗(yàn)室自制；產(chǎn)SEB 野生菌株，購(gòu)自中國(guó)食品藥品研究院標(biāo)準(zhǔn)品中心。

1.2 重組SEB 免疫原的制備及檢定

挑取內(nèi)含pGEM-7Zf-SEB 質(zhì)粒的大腸桿菌DH5α單菌落于新鮮培養(yǎng)基中，當(dāng)菌液D600nm值達(dá)0.6～0.8 時(shí)，加入1.0 mmol/L的IPTG，于32℃誘導(dǎo)表達(dá)10 h，離心得菌體，用0.1 mmol/L的Tris-HCl溶解，超聲波破碎，離心去菌體，取上清；將固體硫酸銨加入收集的上清液中，使其飽和度達(dá)45%，4℃放置5 h，12 000 r/min 離心10 min，收集上清后繼續(xù)加入硫酸銨，使其飽和度達(dá)75%，4℃放置5 h，12 000 r/min 離心10 min，取沉淀；將沉淀蛋白溶解于1 mol/L 硫酸銨溶液中，調(diào)蛋白濃度；將兩疏水柱Pheny l FF和Pheny l HP 串聯(lián)后用1 mol/L的硫酸銨平衡，再將樣品以1 mL/min的流速過(guò)此串聯(lián)疏水柱，收集穿透液；穿透液經(jīng)過(guò)夜透析后，以5 mL/min的流速上已平衡的SP陽(yáng)離子柱，待紫外吸收值回到基線后進(jìn)行線性梯度洗脫，收集蛋白峰；經(jīng)SDS-PAGE和HPLC 測(cè)定重組SEB 蛋白純度；在腹腔注射50 μg/kg LPS 激發(fā)下，通過(guò)腹腔注射重組SEB 蛋白攻擊小鼠測(cè)定重組SEB 半數(shù)致死量（LD50）。

1.3 天然SEB 樣品的制備及檢定

挑取產(chǎn)B 型腸毒素的金黃色葡萄球菌單菌落于Dolman 培養(yǎng)液中，37℃過(guò)夜培養(yǎng)后，以1%的接種量均勻鋪于覆蓋滅菌玻璃紙的新鮮Dolman 固體培養(yǎng)基平板表面，37℃孵育48 h，用無(wú)菌生理鹽水收獲刮洗菌苔，12 000 r/min 離心15 min，取上清用聚乙二醇8000 濃縮至1/30，置截留量5kD的透析袋中，在4℃條件下充分透析平衡；取平衡透析液至陽(yáng)離子交換柱CM-32，依次以不同離子強(qiáng)度緩沖液進(jìn)行階段洗脫，收集洗脫峰，充分透析平衡；取一定量粗純平衡液上樣至平衡過(guò)夜的凝膠過(guò)濾柱Sephadex G-75，洗脫，收集第二個(gè)洗脫峰，對(duì)蒸餾水充分透析脫鹽，真空冷凍干燥，即為純化的天然SEB，4℃保存；用SDS-PAGE和HPLC 測(cè)定純化后天然SEB的純度，在腹腔注射50 μg/kg LPS 激發(fā)下，通過(guò)腹腔注射攻擊小鼠測(cè)定天然SEB的LD50。

1.4 馬抗SEB 原料血漿的制備

重組SEB 加入不完全弗氏佐劑乳化制備免疫原，采用皮下、肌肉、腹股溝淋巴結(jié)多點(diǎn)免疫經(jīng)檢驗(yàn)合格的馬匹，間隔21 d，免疫4 次，免疫劑量分別為2、4、8、16 mg。當(dāng)免疫動(dòng)物ELISA 效價(jià)不低于2000 U/mL 時(shí)采集血漿，-70℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.5 馬抗SEB 免疫球蛋白F（ab'）2成品制備及檢定

在上海賽倫生物技術(shù)有限公司GMP 廠房，按照我們建立的馬抗免疫球蛋白F（ab'）2生產(chǎn)工藝進(jìn)行，制備馬抗SEB 免疫球蛋白F（ab'）2成品[8]。按照建立的制品質(zhì)量規(guī)程測(cè)定馬抗SEB 免疫球蛋白成品F（ab'）2各項(xiàng)指標(biāo)，合格的產(chǎn)品命名為SEB 精制免疫球蛋白。

1.6 動(dòng)物法測(cè)定SEB 精制免疫球蛋白對(duì)天然SEB的中和效果

選用 小鼠45只，5只/組，共9 組。用0.01 mol/L PBS 分別將SEB 精制免疫球蛋白稀釋至58.0、67.6、77.2、87.0、96.6、106.2、116.0、125.6 μg/0.2 mL 為實(shí)驗(yàn)組，并用0.01 mol/L PBS 將正常馬免疫球蛋白稀釋至125.6 μg/0.2 mL 為對(duì)照組。將實(shí)驗(yàn)組、對(duì)照組各劑量組加入等體積用0.01 mol/L PBS 配制的5 μg/0.2 mL（10 LD50）天然SEB混勻，37℃放置1 h。將中和后的各組混合液分別腹腔注射小鼠0.4 mL/只，4 h后各組小鼠再腹腔注射用0.01 mol/L PBS 配制的LPS 50 μg/kg（0.2 mL），連續(xù)7 d 觀察小鼠的存活情況，記錄存活率。以小鼠體內(nèi)中和抗體活性作為SEB 精制免疫球蛋白中和抗體效價(jià)換算活性單位，以在小鼠體內(nèi)中和1 LD50的天然SEB 蛋白所需SEB 精制免疫球蛋白的量為1個(gè)用藥單位（U）。

1.7 SEB 精制免疫球蛋白制品在動(dòng)物體內(nèi)有效性研究

1.7.1 動(dòng)物法測(cè)定天然SEB 合用LPS 對(duì)小鼠致病性LD50取 小 鼠35只，分 為7 組，5只/組。用0.01 mol/L PBS 稀 釋 天 然SEB 為0.156、0.312、0.625、1.25、2.5、5 μg/0.2 mL 6個(gè)劑量組，腹腔注射小鼠作為實(shí)驗(yàn)組，以0.2 mL 0.01 mol/L PBS 腹腔注射小鼠為對(duì)照組，4 h后各劑量組每只小鼠再腹腔注射LPS 50 μg/kg（0.2 mL），連續(xù)觀察7 d 并記錄小鼠的存活率。根據(jù)Reed-Muench 公式計(jì)算天然SEB 合用LPS 對(duì)小鼠致病性LD50。

1.7.2 小鼠體內(nèi)治療試驗(yàn) 選用小鼠25只，分為5 組，5只/組。用0.01 mol/L PBS 將天然SEB 稀釋至5 μg/0.2 mL（10 LD50），每只小鼠腹腔注射，隨后分別于0、1、2、3 h 每只小鼠靜脈注射用0.01 mol/L PBS 稀釋至570 μg/0.2 mL的制品，4 h后每只小鼠腹腔注射LPS 50 μg/kg（0.2 mL），以0.2 mL 0.01 mol/L PBS在0 h后肌肉注射小鼠作為對(duì)照，觀察小鼠的存活情況，并記錄存活率。

1.8 安全性檢測(cè)

按照現(xiàn)行《中國(guó)藥典》要求，對(duì)制品進(jìn)行無(wú)菌試驗(yàn)、熱原檢查、異常毒性試驗(yàn)、一般藥理試驗(yàn)、急性毒性試驗(yàn)、免疫毒性試驗(yàn)、溶血和血管刺激性試驗(yàn)[7-8]。

2 結(jié)果

2.1 重組SEB 純品的制備及檢定

對(duì)制備的重組SEB 純品進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果見(jiàn)圖1，經(jīng)初步優(yōu)化后，純化的重組SEB 純度在90%以上，腹腔注射對(duì)小鼠的LD50約為50 μg/kg。

2.2 天然SEB 純品的制備及檢定

對(duì)制備的天然SEB 純品進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果見(jiàn)圖2，經(jīng)初步優(yōu)化后，純化的天然SEB 純度在90%以上，腹腔注射對(duì)小鼠的LD50約為0.5 μg/kg。

2.3 SEB 精制免疫球蛋白的純度

對(duì)制備的成品進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果見(jiàn)圖3，純化的成品F（ab'）2純度在80%以上。

2.4 動(dòng)物法測(cè)定SEB 精制免疫球蛋白對(duì)天然SEB的中和抗體效價(jià)

圖1 重組SEB檢測(cè)結(jié)果

研制的SEB 精制免疫球蛋白（表1）在4 μL（116.0 μg）以上時(shí)小鼠能夠完全存活，而正常馬免疫球蛋白對(duì)照組小鼠全部死亡，表明研制的SEB 精制免疫球蛋白具有很好的中和SEB 中毒的作用。以在小鼠體內(nèi)中和1 LD50的天然SEB 蛋白所需SEB 精制免疫球蛋白的量為1 U，則每1 mL（28.5 mg）SEB 精制免疫球蛋白活性為2500 U。

2.5 SEB 精制免疫球蛋白小鼠體內(nèi)救治效果

圖2 天然SEB檢測(cè)結(jié)果

圖3 SEB 精制免疫球蛋白成品檢定結(jié)果

表1 SEB精制免疫球蛋白對(duì)10 LD50天然SEB致小鼠模型的中和抗體活性

各時(shí)間點(diǎn)注射SEB 精制免疫球蛋白（表2）的小鼠全部存活，小鼠給藥后體重雖有下降，但于給藥后的第3 d 均恢復(fù)至注射天然SEB 毒素前的體重，而沒(méi)有用SEB 精制免疫球蛋白對(duì)照組小鼠則48 h 內(nèi)全部死亡。由此可見(jiàn)，研制的SEB 精制免疫球蛋白在小鼠體內(nèi)具有很好的治療作用。

2.6 SEB 精制免疫球蛋白的安全性

按照現(xiàn)行《中國(guó)藥典》要求，委托北京昭衍新藥研究中心，開(kāi)展了無(wú)菌試驗(yàn)、熱原檢查、異常毒性試驗(yàn)、急性毒性試驗(yàn)、免疫毒性試驗(yàn)、溶血和血管刺激性試驗(yàn)，結(jié)果見(jiàn)表3，均符合現(xiàn)行《中國(guó)藥典》要求，具有良好的安全性。

3 討論

金黃色葡萄球菌引起人類(lèi)化膿性感染、創(chuàng)傷后膿毒敗血癥、食物中毒等不同綜合征，引起動(dòng)物乳房炎、腹瀉、化膿等疾病。在后抗生素時(shí)代，臨床耐藥金黃色葡萄球菌的防治日益嚴(yán)峻[9]。SEB 作為一種外毒素，是金黃色葡萄球菌致病的關(guān)鍵因子之一，是造成嘔吐、腹瀉、腹痛、休克的核心因素，自身可成為失能性生物武器[10]。因此，金黃色葡萄球菌及SEB 防治研究迫在眉睫。

表2 SEB精制免疫球蛋白在小鼠體內(nèi)的治療效果

表3 SEB精制免疫球蛋白成品安全性檢定結(jié)果

SEB 預(yù)防性疫苗在美國(guó)已完成Ⅰ期臨床試驗(yàn)，安全、有效[11]，在中國(guó)還未見(jiàn)報(bào)道。目前，我國(guó)陸軍軍醫(yī)大學(xué)團(tuán)隊(duì)的金黃色葡萄球菌疫苗已進(jìn)入臨床研究階段，其中就含有SEB 關(guān)鍵抗原成分[12]。雖然已有報(bào)道SEB 中和性單抗、拮抗劑，但均處于實(shí)驗(yàn)室研究階段。鑒于對(duì)SEB 中毒至今沒(méi)有有效的防治手段，憑借毒素抗血清研發(fā)歷史經(jīng)驗(yàn)，利用當(dāng)代馬抗生產(chǎn)技術(shù)研制SEB 治療性抗體，是很有前景的一種手段。

馬抗血清制品歷史悠久，尤其新一代高純度F（ab'）2抗體仍具有頑強(qiáng)的生命力[13]。本研究研發(fā)的SEB 精制免疫球蛋白，從檢測(cè)結(jié)果看，安全、有效、穩(wěn)定，有望為SEB 中毒提供應(yīng)急救治措施，目前已進(jìn)入臨床研究階段。

治療性馬抗研發(fā)最核心的環(huán)節(jié)之一是制備免疫原。我們根據(jù)SEB的性質(zhì)，借鑒現(xiàn)有技術(shù)經(jīng)驗(yàn)，工程性表達(dá)、純化重組SEB，獲得了純度90%以上的純品，在保存免疫原性的基礎(chǔ)上，大幅度降低了SEB 毒性，為免疫動(dòng)物用抗原提供了物質(zhì)基礎(chǔ)[14]。

抗體研發(fā)最關(guān)鍵的環(huán)節(jié)之一是治療性抗體的評(píng)價(jià)。本研究提純了天然SEB 并建立了SEB 中毒細(xì)胞和小、中型動(dòng)物模型[15]。在3個(gè)模型中，我們均證明了制品的有效性，為臨床試驗(yàn)奠定了藥理學(xué)基礎(chǔ)，也為藥效學(xué)評(píng)價(jià)中細(xì)胞替代動(dòng)物的研究奠定了基礎(chǔ)。細(xì)胞模型是利用SEB 超抗原的特性，能非特異性刺激細(xì)胞增殖，抗體中和后，細(xì)胞增殖減少（數(shù)據(jù)未給出）；小鼠動(dòng)物模型是利用LPS 激活機(jī)體條件下，SEB 致小鼠發(fā)生腹瀉等嚴(yán)重脫水癥狀，最終導(dǎo)致死亡；猴子動(dòng)物模型是利用SEB 致腹瀉、中毒等癥狀，最終導(dǎo)致瀕死（數(shù)據(jù)未給出）?？紤]到成本和便于試驗(yàn)數(shù)據(jù)從實(shí)驗(yàn)室過(guò)渡到臨床，課題組最終以小鼠動(dòng)物模型為主，進(jìn)行了SEB 精制免疫球蛋白藥效學(xué)評(píng)價(jià)，為臨床研究提供了數(shù)據(jù)支撐。

總之，利用現(xiàn)代生物制藥技術(shù)，我們制備了SEB 精制免疫球蛋白，有望成為SEB 中毒的候選藥，也為SEB 防治產(chǎn)品的升級(jí)換代提供了理論和技術(shù)支持。