袁巧云 孫悅 張跡

摘要：從多菌靈生產(chǎn)廢水處理系統(tǒng)中，通過富集和選擇性培養(yǎng)，分離得到1株能高效降解多菌靈的細(xì)菌，并將其命名為djl-10。根據(jù)菌株的菌落形態(tài)，生理生化特性及基于16S rDNA序列的系統(tǒng)發(fā)育分析等，初步將菌株鑒定為分枝桿菌屬。該菌株能利用多菌靈作為唯一碳源、氮源進(jìn)行生長并基本徹底礦化多菌靈。2-氨基苯并咪唑和2-羥基苯并咪唑?yàn)榫杲到舛嗑`的中間代謝產(chǎn)物。菌株能夠在較寬溫度和pH值范圍內(nèi)有效降解多菌靈，其降解多菌靈的最適溫度和pH值分別為37 ℃、7.0。裝液量試驗(yàn)結(jié)果表明，菌株djl-10對(duì)多菌靈的降解明顯依賴氧氣。Ca2+、Mg2+、Fe3+等離子能夠明顯促進(jìn)菌株djl-10對(duì)多菌靈的降解。此外，本研究克隆和表達(dá)菌株djl-10的多菌靈水解酶基因mhe。酶促反應(yīng)結(jié)果表明，純化的重組酶Mhe對(duì)多菌靈具有明顯的催化活性。

關(guān)鍵詞：分枝桿菌;多菌靈;生物降解;廢水處理系統(tǒng)

中圖分類號(hào)：X172 文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A 文章編號(hào)：1002-1302（2019）23-0284-05

多菌靈是一種廣譜、內(nèi)吸性殺菌劑，廣泛應(yīng)用于防控各種農(nóng)作物的真菌病害[1]。許多苯并咪唑類和托布津類殺菌劑均可在作物體內(nèi)轉(zhuǎn)化為多菌靈而起作用[2]。多菌靈同時(shí)還是一種持久性環(huán)境污染物，其半衰期在表層土壤中約為3～15周[3-4]。值得注意的是多菌靈在土壤和水體中長期殘留會(huì)進(jìn)一步污染食品，危害人們身體健康[5-6]。研究表明，多菌靈對(duì)動(dòng)物的肝臟和內(nèi)分泌系統(tǒng)有害，是一種“三致”物質(zhì)，既使在較低濃度下也會(huì)對(duì)生物體造成傷害[7-8]。我國每年多菌靈的生產(chǎn)量已超過10 000 t[9]。經(jīng)生產(chǎn)和使用途徑多菌靈進(jìn)入環(huán)境中，并在土壤、河流中殘留，對(duì)各種生物的生長繁殖以及人們的食品安全和身體健康造成潛在的危害。目前，已經(jīng)報(bào)道多種多菌靈降解菌株[7-12]。本研究分離得到1株能高效降解多菌靈的分枝桿菌菌株，并對(duì)其降解特性進(jìn)行初步研究，以期進(jìn)一步豐富高效多菌靈降解菌株的資源庫。

1 材料與方法

1.1 化學(xué)試劑與培養(yǎng)基

多菌靈（純度>98.0%），由江蘇新沂農(nóng)藥廠贈(zèng)送;用于高效液相色譜分析的色譜純甲醇，購自江蘇漢邦科技股份有限公司。其他化學(xué)試劑均為普通國產(chǎn)分析純?cè)噭?/p>

基礎(chǔ)鹽（MSM）培養(yǎng)基配方：1.0 g/L NaCl，1.0 g/L NH4NO3，1.5 g/L K2HPO4，0.5 g/L KH2PO4，0.2 g/L MgSO4·7H2O，1 000 mL 去離子水;富集分離培養(yǎng)基：在基礎(chǔ)鹽培養(yǎng)基中添加0.01%的多菌靈原藥作為唯一碳氮源;LB培養(yǎng)基配方：10.0 g/L 胰蛋白胨，5.0 g/L酵母粉，5.0 g/L NaCl，1 000 mL 去離子水。

1.2 菌株的富集與分離

取多菌靈生產(chǎn)廢水處理系統(tǒng)中的5 mL活性污泥加入到100 mL富集培養(yǎng)基中，在30 ℃，180 r/min條件下振蕩培養(yǎng)。每隔4 d取5 mL富集培養(yǎng)物接種至100 mL新鮮富集培養(yǎng)基中。經(jīng)連續(xù)3代富集后，取富集液梯度稀釋涂布到含過飽和多菌靈的基礎(chǔ)鹽瓊脂平板上，30 ℃培養(yǎng)3 d。周圍有透明圈的菌落即為疑似多菌靈降解菌，將這些菌株用固體LB培養(yǎng)基平板劃線分離，純化后進(jìn)一步驗(yàn)證其多菌靈降解能力。

1.3 菌株鑒定

采用高鹽法提取菌株基因組DNA作為模板，以細(xì)菌16S rDNA通用引物PCR擴(kuò)增菌株16S rDNA序列。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物TA克隆后，轉(zhuǎn)化大腸桿菌 DH5α菌株感受態(tài)細(xì)胞，挑選陽性轉(zhuǎn)化子送至生工生物工程（上海）股份有限公司進(jìn)行測(cè)序。將測(cè)序序列提交到NCBI（www.ncbi.nlm.nih.gov）上進(jìn)行在線分析，利用Blast軟件在GenBank中與其他菌株16S rDNA序列進(jìn)行同源性比對(duì)。采用軟件Mega 6.0，通過鄰結(jié)法構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹。菌株djl-10 16S rDNA序列的GenBank登錄號(hào)為KX509812。

1.4 多菌靈降解及檢測(cè)

1.4.1 菌懸液制備 接種菌株dj1-10至液體LB培養(yǎng)基中，在30 ℃，180 r/min條件下振蕩培養(yǎng)3 d，離心收集菌體，用MSM培養(yǎng)基洗滌并重懸菌體至D600 nm≈1.0。

1.4.2 降解體系構(gòu)建 以1%的接種量，接種菌懸液至MSM液體培養(yǎng)基中，并添加終濃度為100 mg/L的多菌靈作為唯一碳源和能源。當(dāng)以多菌靈為唯一氮源時(shí)，向降解體系中添加100 mg/L葡萄糖。所有處理均設(shè)置3次重復(fù)，在30 ℃，180 r/min 條件下振蕩培養(yǎng)，按特定時(shí)間間隔取樣待測(cè)。

1.4.3 樣品處理 向待測(cè)樣品中加入等體積二氯甲烷，劇烈振蕩2 min，靜置分層后吸出水相，有機(jī)相在通風(fēng)櫥中充分揮發(fā)后加甲醇重新溶解定容，用0.22 μm一次性有機(jī)相過濾器過濾后進(jìn)行高效液相色譜（high performance liquid chromatography，簡稱HPLC）分析。

1.4.4 樣品檢測(cè) 樣品中多菌靈殘留濃度采用HPLC法檢測(cè)，色譜條件為Agilent 1260高效液相色譜儀，Kromasil 100-5 C18反向柱（4.6 mm×25.0 cm），流動(dòng)相為甲醇與0.02 mol/L醋酸銨體積比為65 ∶ 35，流速為1 mL/min，檢測(cè)波長為 286 nm，室溫檢測(cè)。

1.5 環(huán)境條件對(duì)菌株降解多菌靈的影響

1.5.1 溫度的影響 將降解體系分別置于20、25、30、37、40、45 ℃條件下振蕩培養(yǎng)24 h，取樣測(cè)定不同溫度下菌株 djl-10對(duì)多菌靈的降解率。

1.5.2 初始pH值的影響 根據(jù)“1.5.1節(jié)”中試驗(yàn)選擇溫度為 37 ℃。分別用鹽酸溶液和氫氧化鈉溶液將MSM培養(yǎng)基的初始pH值調(diào)為5、6、7、8、9后構(gòu)建“1.4.2節(jié)”中的降解體系。在37 ℃，180 r/min 條件下振蕩培養(yǎng)24 h，取樣測(cè)定不同pH值條件下菌株djl-10對(duì)多菌靈的降解率。

1.5.3 裝液量的影響 在100 mL三角瓶中構(gòu)建降解體系，并設(shè)置10、20、30、40、50 mL等5個(gè)裝液量處理組。在37 ℃，180 r/min條件下振蕩培養(yǎng)24 h，取樣測(cè)定不同裝液量條件下菌株djl-10對(duì)多菌靈的降解率。

1.5.4 不同金屬離子的影響 分別向多菌靈降解體系中添加MgCl2、CuSO4、CaCl2、MnSO4、ZnSO4、FeCl3、CoCl2等溶液，設(shè)置0.1、1.0、 10.0 mmol/L等3個(gè)處理濃度。在37 ℃，180 r/min 條件下振蕩培養(yǎng)24 h，取樣測(cè)定不同金屬離子處理?xiàng)l件下菌株djl-10對(duì)多菌靈的降解率。以不加金屬離子的多菌靈降解體系為對(duì)照。

1.6 多菌靈水解酶基因mhe的克隆與表達(dá)

1.6.1 mhe基因的PCR擴(kuò)增與序列分析 參照文獻(xiàn)[8]設(shè)計(jì)合成多菌靈水解酶基因的PCR引物MheI-F和MheI-R。以菌株基因組DNA為模板，PCR擴(kuò)增菌株mhe基因片段。PCR產(chǎn)物TA克隆后，挑選陽性轉(zhuǎn)化子送至生工生物工程（上海）股份有限公司進(jìn)行測(cè)序。測(cè)序序列提交GenBank進(jìn)行Blast同源性比對(duì)分析。

1.6.2 重組表達(dá)載體構(gòu)建 通過引物設(shè)計(jì)，在mhe基因片段PCR產(chǎn)物的上下游分別引入限制性酶切位點(diǎn)Nde Ⅰ和 Xho Ⅰ，并通過載體構(gòu)建的方式將mhe基因片段連接到表達(dá)載體pET29a的相應(yīng)位點(diǎn)上，構(gòu)建成重組表達(dá)載體pET29a-mhe，隨后轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21（DE3）菌株。

1.6.3 蛋白Mhe誘導(dǎo)表達(dá)及純化 在含50 mg/L卡那抗生素的LB液體培養(yǎng)基中，將重組表達(dá)菌株于37 ℃，200 r/min條件下振蕩培養(yǎng)至菌體濃度達(dá)到D600 nm≈0.5時(shí)，加入終濃度為1 mmol/L的異丙基-β-D-硫代半乳糖苷（isopropyl-β-D-thiogalactopyranoside，簡稱IPTG），在18 ℃、180 r/min 條件下振蕩培養(yǎng)24 h，以誘導(dǎo)蛋白Mhe表達(dá)。采用Ni柱親和層析策略，參照產(chǎn)品說明步驟純化目標(biāo)蛋白Mhe。純化的目標(biāo)蛋白透析脫鹽后進(jìn)行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）分析。

1.6.4 Mhe酶活力檢測(cè) 構(gòu)建酶促反應(yīng)體系：500 μL 20 mmol/L Tris-HCl （pH值為8.0），25 μL Mhe酶液，5 μL多菌靈母液（終濃度為10 mg/L），37 ℃恒溫水浴。平行操作15個(gè)反應(yīng)體系，分為5組，每組3次重復(fù)，分別在0、2、4、6、8 h 取樣，加入等體積的二氯甲烷終止酶促反應(yīng)并萃取體系中殘留的多菌靈，用HPLC檢測(cè)分析各組樣品中多菌靈的殘留濃度。

2 結(jié)果與分析

2.1 多菌靈降解菌株的富集與分離

從處理多菌靈生產(chǎn)廢水的活性污泥中分離得到1株高效多菌靈降解菌株，命名為djl-10。菌株革蘭氏染色為陽性，在LB固體平板上經(jīng)30 ℃，2～3 d培養(yǎng)后形成黃色菌落。菌株能在以過飽和多菌靈為唯一碳氮源的渾濁基礎(chǔ)鹽瓊脂平板上生長，并在菌落周圍和下方形成清晰的透明水解圈（圖1）。

2.2 菌株djl-10的鑒定

菌株djl-10的16S rDNA序列同源性比對(duì)分析顯示其與分枝桿菌屬（Mycobacterium sp.）菌株有較高的同源性，達(dá)99%。分枝桿菌屬與諾卡氏菌屬、紅球菌屬等在親緣關(guān)系上相近，同時(shí)為考察菌株djl-10與其他已報(bào)道的多菌靈降解菌株之間的進(jìn)化關(guān)系，從GenBank中調(diào)取它們的16S rDNA序列進(jìn)行聚類分析，構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。結(jié)果表明，其與Mycobacterium sp.親緣關(guān)系最近（圖2）。據(jù)此，將菌株djl-10初步鑒定為分枝桿菌屬菌株。

2.3 菌株對(duì)多菌靈的降解及代謝產(chǎn)物鑒定

菌株djl-10對(duì)多菌靈的降解及生長情況如圖3所示，菌株能夠以多菌靈為唯一碳氮源生長，并降解多菌靈。當(dāng)以多菌靈為唯一氮源時(shí)菌株的生長和降解均相對(duì)較好，菌株能在24 h內(nèi)將100 mg/L的多菌靈幾乎徹底降解。而以多菌靈為唯一碳源或唯一碳氮源時(shí)，菌株需要近36 h才能將多菌靈基本徹底降解。以多菌靈為唯一氮源時(shí)，體系中添加了葡萄糖，能夠促進(jìn)菌體的快速增加和對(duì)多菌靈的降解。因此，葡萄糖的存在應(yīng)是以多菌靈為唯一氮源時(shí)菌株生長和降解更快的原因。

根據(jù)文獻(xiàn)[7-8]報(bào)道，2-氨基苯并咪唑（2-AB）和 2-羥基苯并咪唑（2-HB）是多種微生物菌株降解多菌靈的中間代謝產(chǎn)物。在菌株djl-10降解多菌的過程中，通過HPLC分析也檢測(cè)到了2個(gè)中間代謝產(chǎn)物。由圖4可知，這2個(gè)代謝產(chǎn)物分別與2-AB、2-HB標(biāo)準(zhǔn)品有相同的保留時(shí)間，基于此并結(jié)合文獻(xiàn)報(bào)道，將這2個(gè)代謝產(chǎn)物初步鑒定為 2-AB 和2-HB，這也說明菌株djl-10降解多菌靈的代謝途徑與文獻(xiàn)[7-8]報(bào)道的多菌靈降解菌株基本相同。

2.4 環(huán)境條件對(duì)菌株djl-10降解多菌靈的影響

2.4.1 溫度和初始pH值對(duì)降解率的影響 由圖5可知，在溫度低于37 ℃時(shí)，多菌靈降解率隨著溫度升高而升高，但當(dāng)溫度高于37 ℃時(shí)，降解率隨著溫度升高略有下降。因此，菌株 djl-10降解多菌靈的最適溫度為37 ℃。由圖6可知，菌株djl-10降解多菌靈的最適pH值為7.0，培養(yǎng)基初始pH值偏酸和偏堿均會(huì)抑制多菌靈的降解。

2.4.2 裝液量對(duì)降解率的影響 由圖7可知，在100 mL三角瓶中裝液量為10、20 mL時(shí)多菌靈的降解率明顯高于裝液量為30、40、50 mL時(shí)，且隨著裝液量的增加，降解率逐漸下降，表明菌株djl-10降解多菌靈對(duì)氧氣有明顯的需求。

2.4.3 金屬離子對(duì)降解率的影響 由圖8可知，Mg2+和Ca2+能夠明顯促進(jìn)菌株djl-10對(duì)多菌靈的降解;Mn2+、Zn2+、Co2+在試驗(yàn)濃度為0.1、1.0 mmol/L時(shí)對(duì)降解有明顯促進(jìn)作用，但濃度為10.0 mmol/L時(shí)對(duì)降解作用強(qiáng)烈抑制;Cu2+對(duì)降解有明顯的抑制作用;值得注意的是，F(xiàn)e3+在低濃度（01、1.0 mmol/L）時(shí)對(duì)菌株降解多菌靈的影響不大，但在試驗(yàn)濃度為10.0 mmol/L時(shí)對(duì)多菌靈的降解有強(qiáng)烈的促進(jìn)作用。

2.5 菌株多菌靈水解酶mhe基因的克隆和表達(dá)

從菌株dj1-10的基因組DNA中，PCR擴(kuò)增得到1個(gè)特異條帶，測(cè)序分析表明其為長度為729 bp，起始密碼子為ATG終止密碼子為TGA，編碼242個(gè)氨基酸殘基的開放式閱讀框（ORF）。序列同源性比對(duì)分析表明其與已報(bào)道的菌株R. erythropolis dj1-11[13]和Nocardioides sp. SG-4G[8]中的多菌靈水解酶基因mhe/mheI的序列相似性分別達(dá)到100%、99%。據(jù)此，推測(cè)該ORF就是菌株djl-10中負(fù)責(zé)編碼多菌靈水解酶Mhe的基因。

利用大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)并純化菌株djl-10的多菌靈水解酶Mhe，SDS-PAGE分析結(jié)果（圖9）顯示，純化的Mhe為單一條帶，分子量約為26 ku，與基于氨基酸序列推測(cè)的理論值（26 251.93 u）相符。酶促反應(yīng)試驗(yàn)顯示純化的

Mhe對(duì)多菌靈具有催化活性，如圖10所示，在Mhe的催化下，反應(yīng)體系中多菌靈的殘留濃度隨時(shí)間推移逐步降低。這進(jìn)一步說明該ORF是菌株djl-10中負(fù)責(zé)編碼多菌靈水解酶的mhe基因。

3 結(jié)論

從多菌靈廢水處理系統(tǒng)活性污泥中分離得到1株高效多菌靈降解菌株djl-10，初步鑒定為分枝桿菌屬菌株。該菌株能以多菌靈為唯一碳源、氮源和唯一碳氮源生長并基本徹底降解多菌靈。進(jìn)一步豐富了多菌靈降解菌株的資源庫。

菌株djl-10降解多菌靈的最適溫度和初始pH值分別為37 ℃、7.0。裝液量試驗(yàn)結(jié)果表明，菌株降解多菌靈時(shí)須要好氧環(huán)境。Mg2+和Ca2+等多種金屬離子對(duì)菌株降解多菌靈有明顯促進(jìn)作用;Cu2+對(duì)降解有明顯的抑制作用;高濃度（10.0 mmol/L）的Fe3+對(duì)降解有強(qiáng)烈的促進(jìn)作用。

2-AB和2-HB是菌株djl-10降解多菌靈的中間代謝產(chǎn)物。菌株中負(fù)責(zé)催化多菌靈降解的第一步反應(yīng)的編碼基因是多菌靈水解酯酶基因mhe，該基因表達(dá)的產(chǎn)物對(duì)多菌靈有明顯的催化活性。

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收稿日期：2018-09-03

基金項(xiàng)目：國家自然科學(xué)基金（編號(hào)：31300099）。

作者簡介：袁巧云（1981—），女，江蘇鹽城人，碩士，主要從事微生物學(xué)研究。E-mail：qiaoyunyuan@163.com。

通信作者：張 跡，博士，講師，主要從事環(huán)境微生物學(xué)研究。E-mail：zhangjihnu@163.com。