馬田田 綜述 王秀梅 審校
口腔扁平苔蘚(oral lichen planus,OLP)是口腔黏膜的一種慢性非特異性炎性疾病,多數(shù)學(xué)者認(rèn)為該疾病是T淋巴細(xì)胞介導(dǎo)的一種免疫相關(guān)性疾病,在口腔黏膜病中其復(fù)發(fā)程度僅次于復(fù)發(fā)性阿弗他潰瘍。OLP發(fā)展的特征為大多數(shù)情況下是由Th1/Th2免疫平衡與其他的CD4+T細(xì)胞亞群共同調(diào)節(jié)。
中藥黃芪根據(jù)中醫(yī)的理論其具有扶正補(bǔ)氣,利水退腫、托毒排膿、生肌等功效。而現(xiàn)代藥學(xué)的研究也已經(jīng)證實(shí),黃芪有增強(qiáng)機(jī)體免疫功能、保肝、利尿、抗衰老、抗氧化、降壓和較廣泛的抗菌作用。黃芪多糖(Astragalus polysaccharide,APS)作為從黃芪中提取的一種主要生物活性成分,是目前臨床應(yīng)用比較廣泛、研究較為深入的中藥成分之一。本文特綜述APS的免疫調(diào)節(jié)活性及其他藥理作用的研究新進(jìn)展及可能應(yīng)用于口腔扁平苔蘚的調(diào)節(jié)機(jī)制。
APS作為從傳統(tǒng)中藥黃芪中提取的一種有效成分是一類生物大分子,其成分包括葡聚糖和多種單糖。其中葡聚糖又有水溶性葡聚糖和非水溶性葡聚糖,分別是 α -(1→4)(1→6)葡聚糖和 α - (1→4)葡聚糖。其單糖種類主要包括 L-鼠李糖、 L-阿拉伯糖、 D-木糖、 L-木糖、 D-核糖、 L-核糖、 D-半乳糖、D-葡萄糖和 D-甘露糖等。Jiang等[1]從黃芪水中提取4 種黃芪多糖(APS1-APS4),提取后對(duì)每種多糖用20%、 40%、 60%、 80%的乙醇沉淀法進(jìn)行純化,用硫酸-苯酚法測(cè)定所有糖含量,用用高效凝膠滲透色譜法(HPGPC)確定它們的分子量,用反相高效液相色譜分析柱前衍生色譜法測(cè)定其單糖組成,然后通過(guò)體外脾淋巴細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)評(píng)估APS的免疫生物活性。APS的4 種分子量分別為257.7 kDa、40.1 kDa,15.3 kDa和3.2 kDa。單糖組成分析表明,APS1僅包括葡萄糖,APS2包括所有阿拉伯糖,APS3包括鼠李糖、葡萄糖、半乳糖、阿拉伯糖,APS4包括半乳糖、阿拉伯糖。體外脾淋巴細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)證實(shí)APS2和APS3能有效刺激正常脾淋巴細(xì)胞在體外增殖。且APS2的濃度在6.25~800 μg/ml之間呈劑量依賴性。由此可證明分子量在15.2 kDa和40.1kDa之間組份為阿拉伯糖的APS有明顯的免疫活性。
耐受性樹(shù)突狀細(xì)胞(DCs)包含兩種細(xì)胞,一種是具有穩(wěn)定表型的CD11clowCD45RBhigh,另一種是CD11chighDCs,而后者位于脾臟和淋巴結(jié),特征是可以表達(dá)高水平的MHC-Ⅱ類分子和共刺激分子,并且CD11chighDC活化后可分泌大量的IL-12。APS可在體外誘導(dǎo)脾臟DCs轉(zhuǎn)化成CD11chighCD45RBlowDCs,因此猜測(cè)可使Th2轉(zhuǎn)化成Th1增強(qiáng)T淋巴細(xì)胞的免疫作用。為證明這一猜測(cè)Liu等[2]將小鼠脾臟制成單細(xì)胞懸液采用磁珠分選方法分離DCs, CD11chighCD45RBlowDCs,CD11clowCD45RBhighDCs和CD4+T細(xì)胞,采用ELISA和流式細(xì)胞術(shù)等實(shí)驗(yàn)方法,得出用APS誘導(dǎo)后CD11chighCD45RBlowDCs細(xì)胞百分率明顯升高,且CD11clowCD45RBhighDCs與IL-12的產(chǎn)生和APS的刺激呈現(xiàn)劑量依賴關(guān)系。證明了APS可導(dǎo)致脾臟DCs分化成CD11chighCD45RBlowDCs繼而使Th2轉(zhuǎn)化成Th1,增強(qiáng)T淋巴細(xì)胞的免疫功能。
CD4+CD25highTreg的平衡可通過(guò)抑制自身反應(yīng)性T細(xì)胞和癌細(xì)胞免疫反應(yīng)阻止自身免疫性疾病的發(fā)生。相關(guān)研究證實(shí)APS對(duì)CD4+CD25+Treg細(xì)胞的生長(zhǎng)和增殖的抑制作用呈劑量和時(shí)間依賴性,而這種抑制作用可能是通過(guò)使失衡的細(xì)胞因子恢復(fù)和使局部肝癌微環(huán)境中的FOXp3減少來(lái)實(shí)現(xiàn)的,CXC類趨化因子SDF-1在募集Treg細(xì)胞到肝癌腫瘤微環(huán)境中發(fā)揮著重要催化作用,故猜測(cè)APS可能通過(guò)CXCR4/CXCL12通路阻斷SDF-1及其受體抑制Treg細(xì)胞轉(zhuǎn)移[3]。
APS可以降低系統(tǒng)性紅斑狼瘡患者血清中IFN-γ和 IL-10的水平,改善系統(tǒng)性紅斑狼瘡患者的Thl/Th2細(xì)胞比例失調(diào)[4]。而且APS沒(méi)有激素長(zhǎng)期治療的副作用,這為自身免疫性疾病的治療提供了新的思路。
Th17細(xì)胞是一種以分泌 IL-17為特征的CD4+T輔助細(xì)胞亞群[5],主要產(chǎn)生IL-17A和 IL-17F,以及少量的腫瘤壞死因子(TNF)和IL-6,其中IL-17A是Th17細(xì)胞發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用的主要效應(yīng)因子。IL-23作為一種重要的促炎因子可以促進(jìn)激活的記憶細(xì)胞產(chǎn)生IL-17,使Th17細(xì)胞得生存。郭艷等[6]通過(guò)制備大鼠潰瘍性結(jié)腸炎模型,于造模后第3 天給予APS溶液和柳氮磺胺吡啶(SASP)混懸液的實(shí)驗(yàn)方法,發(fā)現(xiàn)APS組大鼠腸黏膜腺體增生修復(fù)明顯,肌層增厚,炎性細(xì)胞浸潤(rùn)不明顯,且APS組與SASP組大鼠血清中IL-23、IL-17、TGF-β含量均顯著降低,其中APS組降低更明顯,證明APS對(duì)IL-17有調(diào)節(jié)作用,并猜測(cè)APS可能通過(guò)調(diào)節(jié)大鼠血清中 IL- 23、TGF-β的表達(dá)來(lái)調(diào)節(jié) Th17 細(xì)胞,以減輕腸黏膜炎癥損傷。
APS能促進(jìn)巨噬細(xì)胞內(nèi)TNF-α,GM-CSF和NO的產(chǎn)生,從而提高巨噬細(xì)胞的免疫防御能力[8]。巨噬細(xì)胞作為免疫效應(yīng)細(xì)胞,參與免疫系統(tǒng)的調(diào)節(jié),是機(jī)體免疫系統(tǒng)中重要成分之一,且主要為非特異性免疫。這些細(xì)胞的功能正常關(guān)系到免疫應(yīng)答的抗原呈遞過(guò)程和抗原清除能力。因此,通過(guò)檢測(cè)巨噬細(xì)胞對(duì)異物顆粒的吞噬能力可直接評(píng)價(jià)吞噬細(xì)胞自身的功能,也可以間接評(píng)價(jià)免疫應(yīng)答能力。研究[7]發(fā)現(xiàn)免疫抑制模型小鼠給予APS后巨噬細(xì)胞對(duì)雞紅細(xì)胞的吞噬百分率和吞噬指數(shù)明顯升高,說(shuō)明APS可顯著提高小鼠的免疫功能。由此可知,APS對(duì)免疫抑制模型小鼠巨噬細(xì)胞的吞噬功能具有明顯增強(qiáng)作用。
亦有研究發(fā)現(xiàn)APS可明顯增加巨噬細(xì)胞內(nèi)蛋白激酶C(PKC)的活性和細(xì)胞內(nèi)第二信使(NO,cAMP, DAG, IP3, Ca2+)的濃度,而且經(jīng)APS作用后巨噬細(xì)胞內(nèi)NF-κB的mRNA和蛋白水平明顯增加,但經(jīng)Ca2+抑制劑NiCl2作用后卻明顯降低,同時(shí)TNF-α和IL-6也顯著降低[9]。證明Ca2+-cAMP 和 TLR4/NF-κB 信號(hào)通路參與了部分APS在巨噬細(xì)胞內(nèi)的免疫調(diào)節(jié)。
APS可明顯抑制NF-κB信號(hào)通路活性。Tao Luo等[10]將小膠質(zhì)細(xì)胞BV2經(jīng)LPS刺激后加入不同濃度的APS培養(yǎng)24h,結(jié)果發(fā)現(xiàn)TNF-α和IL-1βmRNA的表達(dá)水平呈劑量依賴性降低,IκB降低70%,磷酸化的NF-κBp65蛋白水平亦降低。NF-κB在胞漿中結(jié)合抑制劑IκB,IκB蛋白的降解是NF-κB激活的一個(gè)重要步驟。證明了APS可顯著抑制LPS誘導(dǎo)的IκB的降解,從而抑制NF-κB的活化和轉(zhuǎn)導(dǎo)。此外,亦有人通過(guò)在小鼠腹腔注射APS,檢測(cè)到NF-κB通路的標(biāo)志性因子NF-κBp65、p-NF-κB p65 及 p-IκBα表達(dá)明顯降低[11],亦證明APS可明顯抑制 NF-κB信號(hào)通路活性。
絲裂原活化蛋白激酶(MAPKs)包括p38、JNK和ERK,已被證實(shí)參與了氧化應(yīng)激和促炎信號(hào)級(jí)聯(lián)放大。PI3K/PKB調(diào)節(jié)細(xì)胞的活化、炎癥反應(yīng)和細(xì)胞凋亡。PI3K通路激活后可通過(guò)抑制細(xì)胞凋亡保護(hù)心臟功能,抑制p38MAPK減輕細(xì)胞炎癥反應(yīng)[11]。先前研究證明,PI3K/PKB和MAPK通路是APS必不可少的靶點(diǎn)。最近研究發(fā)現(xiàn)ERK、JNK、p38和PKB激酶被LPS刺激后磷酸化,與它們?cè)诮閷?dǎo)炎癥中的關(guān)鍵作用一致;然而在APS作用后僅有pPKB被選擇性抑制,故猜測(cè)這種差異的原因可能主要是由于個(gè)體的PKB基因表達(dá)與細(xì)胞類型和刺激的變化有關(guān)。 (MAPKs)信號(hào)通路可通過(guò)IκB的降解促進(jìn)NF-κB的激活。Ye等[12]研究顯示APS通過(guò)抑制基底樣乳腺癌細(xì)胞株MDA-MB-468的增殖下調(diào)PKB的磷酸化表達(dá)。如圖 1在BV2小膠質(zhì)細(xì)胞中,LPS刺激激活TLR4作用于MAPKs、PI3K/PKB, 兩者發(fā)送信號(hào)到NFκB-IκB復(fù)合物, NFκB-IκB復(fù)合物活化釋放NFκB入核,NFκB在釋放入核時(shí)即介導(dǎo)參與炎癥反應(yīng)的基因轉(zhuǎn)導(dǎo),APS選擇性阻止LPS誘導(dǎo)的PKB磷酸化從而抑制IκB降解,抑制NFκB磷酸化,降低小膠質(zhì)細(xì)胞中NO、PGE2、TNF-α和IL-1β的產(chǎn)生。
圖 1 APS對(duì)LPS介導(dǎo)的BV2小神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞炎癥反應(yīng)的影響
活性氧(ROS)水平的增加在細(xì)胞凋亡的發(fā)展中起著關(guān)鍵的作用,由ROS引起的氧化應(yīng)激通過(guò)氧化線粒體膜和線粒體的膜電位去極化產(chǎn)生大量ROS啟動(dòng)或促進(jìn)細(xì)胞凋亡和衰老[13],ROS參與了鐵過(guò)載誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡和器官老化,鐵過(guò)載可通過(guò)細(xì)胞內(nèi)ROS的增加引起骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(BMSCs)的凋亡[14];APS可降低由沙苑子黃酮(FAC)引起的BMSCs線粒體中明顯增加的ROS及細(xì)胞凋亡;提高干細(xì)胞調(diào)控因子Nanog,Sox2和Oct4的mRNA表達(dá)水平。因此APS通過(guò)阻止線粒體內(nèi)ROS的聚集進(jìn)而明顯抑制由FAC誘導(dǎo)的因鐵過(guò)載引起的BMSCs凋亡、衰老和多功能性降低。
Huang等[15]在肝癌(HCC)細(xì)胞系H22細(xì)胞中分別用CCK-8和流式細(xì)胞術(shù)等實(shí)驗(yàn)方法檢測(cè)APS對(duì)其的潛在作用,結(jié)果與正常肝組織相比發(fā)現(xiàn)HCC組織中Notch1的mRNA和蛋白表達(dá)明顯上調(diào),且用APS作用后H22細(xì)胞Notch1的mRNA和蛋白表達(dá)水平的降低呈濃度依賴性,用siRNA敲擊的Notch1可通過(guò)降低凋亡抑制基因Bcl-2的表達(dá)和增加促凋亡基因BAX的表達(dá)來(lái)降低H22細(xì)胞的活性,顯著提高H22細(xì)胞的凋亡。因此,Notch1可調(diào)節(jié)HCC細(xì)胞的生存和轉(zhuǎn)移能力,APS即通過(guò)抑制Notch1的表達(dá)誘導(dǎo)HCC細(xì)胞凋亡。
通過(guò)三偏磷酸鈉、三聚磷酸鈉(STMP-STPP)法和氯磺酸-吡啶方法來(lái)分別修飾APS可得到其磷酸(pAPS)和硫酸(sAPS)形式[16],通過(guò)觀察APS、pAPS和sAPS在細(xì)胞和血液的病毒增殖過(guò)程的抗-DHAV增殖作用,證明了pAPS在整個(gè)病毒增值過(guò)程中抑制DHAV增值的作用顯著強(qiáng)于APS和sAPS,并且能顯著提高33.5%的生存率,降低血液和肝臟病變部分的DHAV顆粒效價(jià)。因此,pAPS可有較強(qiáng)的抗-DHAV活性。
與OLP的發(fā)病機(jī)制相關(guān)的細(xì)胞主要是:角質(zhì)細(xì)胞、CD8+T淋巴細(xì)胞、CD4+T淋巴細(xì)胞、樹(shù)突細(xì)胞(DC)、Treg細(xì)胞等。DC通過(guò)抗原反應(yīng)激活T細(xì)胞,在免疫反應(yīng)中,CD4+T淋巴細(xì)胞可激活B淋巴細(xì)胞、巨噬細(xì)胞及CD8+T淋巴細(xì)胞。這些細(xì)胞可分化為3 個(gè)不同的細(xì)胞系:Th1、Th2 以及Th17。Xie等[17]的研究顯示,OLP患者Th1和Th17細(xì)胞的比例及血清中IL-17的含量較正常水平顯著升高,提示Th17是OLP促炎癥細(xì)胞因子,Th17系細(xì)胞及其相關(guān)細(xì)胞因子在OLP發(fā)病中發(fā)揮重要作用。在OLP患者中CD8+T細(xì)胞的滲透主要發(fā)生在表皮內(nèi)、基底膜破壞區(qū)及毗鄰基底角質(zhì)細(xì)胞。抗原識(shí)別、表達(dá)的基礎(chǔ)是通過(guò)角化細(xì)胞促進(jìn)趨化因子激活,最終通過(guò)活化穿孔蛋白或顆粒酶,使Fas L受體表達(dá),從而促進(jìn) TNF-α分泌,促進(jìn)角質(zhì)細(xì)胞發(fā)生凋亡。在OLP患者外周血中CD4+CD25highT 細(xì)胞、CD4+Foxp3+T細(xì)胞水平較正常對(duì)照組明顯升高;CD4+CD25highT細(xì)胞與CD4+Foxp3+T細(xì)胞水平存在正相關(guān)性,CD4+CD25+Foxp3+T細(xì)胞與CD4+Foxp3+T細(xì)胞水平存在明顯正相關(guān)性[18];Wang等[19]亦發(fā)現(xiàn)OLP患者外周血中CD4+CD25+Foxp3+Treg細(xì)胞的表達(dá)明顯增加,猜測(cè)Treg細(xì)胞的表達(dá)升高可能是OLP的發(fā)病因素之一。
近年來(lái),盡管OLP在治療上取到了良好療效,但OLP的復(fù)發(fā)率仍然很高,而且激素長(zhǎng)期治療的的副作用對(duì)患者的日后生活也造成了極大的困擾。APS作為一種研究較熱的中藥成分,有顯著的免疫活性,其主要作用可使脾臟DCs分化成CD11chighCD45RBlowDCs,繼而使Th2轉(zhuǎn)化成Th1,增強(qiáng)T淋巴細(xì)胞的免疫功能;改善失衡的Th1/Th2細(xì)胞比例;調(diào)節(jié)Th17細(xì)胞及相關(guān)細(xì)胞因子;抑制Treg細(xì)胞的免疫抑制作用;提高巨噬細(xì)胞的吞噬功能;通過(guò)NF-κB及MAPKs和PKB信號(hào)通路發(fā)揮抗炎作用;亦可通過(guò)阻止ROS的聚集防止因鐵過(guò)載引起的BMSCs凋亡、衰老、多功能降低。此外,APS還有抗腫瘤、抗病毒作用。TLRs/NF-κB信號(hào)通路的激活現(xiàn)已被本課題組證實(shí)參與了OLP的炎癥反應(yīng)及其病理過(guò)程;且TLRs/NF-κB信號(hào)通路中跨膜信號(hào)蛋白TLR4和胞內(nèi)轉(zhuǎn)錄因子NF-κBP65基因的表達(dá)水平隨OLP細(xì)胞模型炎癥反應(yīng)程度的加重而升高[20],TLR-4及NF-κBP65在OLP的病損形成中具有重要意義[21]。細(xì)胞凋亡異常及細(xì)胞免疫紊亂等在OLP的發(fā)病機(jī)制中亦具有非常關(guān)鍵的作用。因此,APS在OLP中的作用有待于研究證實(shí)。我們更應(yīng)該對(duì)該中藥進(jìn)行深入的研究,以改善Th1/Th2細(xì)胞比例失衡,通過(guò)NF-κB信號(hào)通路抗炎,抑制細(xì)胞凋亡為治療靶點(diǎn),使之成為根治OLP的藥物,造福人類。