周萬飛，黃銀久，秦中強(qiáng)，談 燚△

(1.蚌埠醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院肝膽外科，安徽蚌埠 233000；2.蚌埠醫(yī)學(xué)院生物科學(xué)系，安徽蚌埠 233000)

肝內(nèi)膽管癌(intrahepatic cholangiocarcinoma,ICC)是一種膽管上皮源性的、高度惡性的腫瘤[1]。在世界范圍內(nèi)ICC作為肝膽系統(tǒng)第2常見的原發(fā)性惡性腫瘤，其發(fā)病率與病死率在我國持續(xù)增高[2]。到目前為止，根治性手術(shù)切除是ICC惟一有效的方法。

研究ICC的發(fā)病機(jī)制及病理改變的前提是建立ICC的動物模型。迄今為止，構(gòu)建ICC動物模型的方法為化學(xué)方法或通過肝內(nèi)直接注射腫瘤細(xì)胞的方法，如以氨基比林和亞硝酸鈉溶液作為敘利亞地鼠的飲用水，每周飲用6 d，連續(xù)飲用24周，可誘發(fā)ICC，成癌率50%[3]。ZENDER等[4]研究發(fā)現(xiàn)利用含有致癌基因的慢病毒感染肝祖細(xì)胞，之后注射進(jìn)小鼠肝臟內(nèi)，8周后誘發(fā)ICC，成癌率70%。但是以上兩種方法用時長，成癌率低。BIAO等[5]研究表明，應(yīng)用水流動力學(xué)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染方法將兩種質(zhì)粒NICD1和myr-AKT通過尾靜脈注射到體內(nèi)可誘導(dǎo)ICC的發(fā)生，但是此方法無法穩(wěn)定高效地建立起ICC模型。有文獻(xiàn)報道睡美人(sleeping beauty,SB) 轉(zhuǎn)座酶結(jié)合水流動力學(xué)轉(zhuǎn)染方法可以使靶基因在肝臟中長期穩(wěn)定表達(dá)[6-7]。本研究應(yīng)用水流動力學(xué)方法并結(jié)合SB100或SB13將NICD1和myr-AKT質(zhì)粒注射到小鼠體內(nèi)，誘導(dǎo)ICC形成，進(jìn)而比較兩種轉(zhuǎn)座酶對成瘤率的影響，為研究ICC做好前期實驗基礎(chǔ)，現(xiàn)報道如下。

1 材料與方法

1.1實驗動物 健康昆明小鼠80只，6～8周齡，體質(zhì)量20～24 g，采購自蚌埠醫(yī)學(xué)院實驗動物中心[動物許可證號：SCXK(蘇)2017-0001；合格證編號：NO.201723468]。

1.2試劑 無內(nèi)毒素質(zhì)粒大提試劑盒購自天根生化科技(北京)有限公司(Lot：Q5331)，Anti-HA tag山羊單克隆抗體(Lot:CR138965-1)及Anti-Cytokeratin19 兔單克隆抗體(Lot:GR1234768-1)購自英國abcam公司；驢抗山羊IgG Alexa Fluor 488?Polyclonal(Lot:211346)及驢抗兔IgG Alexa Fluor 594?Polyclonal(Lot:134523)購自美國Jackson公司。誘癌質(zhì)粒：pT3-EF1a-NICD1，pT3-myr-AKT-HA(human AKT1)，C-luc-SB13，pCMV(CAT)T7-SB100由英國addgene公司饋贈。

1.3方法

1.3.1ICC模型的構(gòu)建 將實驗小鼠分為4組，每組20只。A組小鼠通過尾靜脈注射pT3-mry-AKT-HA和pT3-EF1a-NICD1質(zhì)粒聯(lián)合SB100。B組小鼠通過尾靜脈注射pT3-mry-AKT-HA和pT3-EF1a-NICD1質(zhì)粒聯(lián)合SB13。C組小鼠通過尾靜脈注射pT3-mry-AKT-HA和pT3-EF1a-NICD1質(zhì)粒。D組小鼠通過尾靜脈注射生理鹽水。用無內(nèi)毒素質(zhì)粒大提試劑盒提取pT3-EF1a-NICD1、pT3-myr-AKT-HA、SB100、SB13 4種質(zhì)粒。在A組中3種質(zhì)粒分別取25 μg與2 mL的0.9% NaCl溶液充分混合，通過尾靜脈在7 s內(nèi)將含有此3種質(zhì)粒的0.9% NaCl溶液注射入小鼠體內(nèi)；B組和C組用上述同種方法將含有質(zhì)粒的溶液注射入小鼠體內(nèi)；D組用上述同種方法將等量0.9% NaCl注射入小鼠體內(nèi)。在實驗期間，小鼠正常投喂飼料，隨意飲水。觀察4組小鼠生長情況，體質(zhì)量變化，精神食欲等變化。4周后小鼠全部處死。

1.3.2組織病理學(xué)檢測ICC 將實驗組中ICC組織和對照組中正常肝組織取出，用4%多聚甲醛固定，常規(guī)石蠟包埋，之后用病理組織切片機(jī)制成10 μm的連續(xù)石蠟切片。然后將切片用蘇木素-伊紅(HE)染色，在光鏡下觀察。

1.3.3采用免疫組織化學(xué)SP法檢測ICC 將石蠟組織塊切成5 μm厚切片，于二甲苯中脫蠟2次，水化，自來水沖洗。檸檬酸緩沖液93 ℃抗原修復(fù)30 min后，室溫下驢血清封閉30 min后磷酸鹽緩沖溶液(PBS)洗3次。除去PBS后，滴加一抗(1∶200稀釋)，孵化4 ℃過夜，PBS沖洗3次，每次5 min。滴加反應(yīng)增強(qiáng)液，室溫下孵育30 min，PBS沖洗3次，每次5 min。滴加抗兔/山羊IgG聚合物，室溫下孵育30 min，PBS沖洗3次，每次5 min。滴加新鮮配制的3，3-二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色試劑顯色。自來水充分沖洗，蘇木素復(fù)染，PBS返藍(lán)，乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹膠封固。以細(xì)胞質(zhì)和(或) 細(xì)胞膜上見到棕黃色顆粒分布為陽性。采用半定量方法進(jìn)行判斷：無著色細(xì)胞為陰性，著色細(xì)胞小于30%為“+”(陽性)，著色細(xì)胞30%～60%為“++”(中等陽性)，著色細(xì)胞大于60%為“+++”(強(qiáng)陽性)。選擇 5個400倍視野，計數(shù)每個視野100個瘤細(xì)胞中CK19或者HA陽性細(xì)胞數(shù)。

1.4統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS20.0 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計數(shù)資料以頻數(shù)或百分率表示，比較采用Fisher精確概率法，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1誘癌質(zhì)粒提取結(jié)果 使用酶標(biāo)儀測4種質(zhì)粒濃度均在1 μg/μL以上，A260/A280在1.8～2.0。分別取1 μL誘癌質(zhì)粒上樣1%凝膠電泳，見圖1。

M：takara DL10000 DNA Marker；1：pT3-myr-AKT-HA；2：pT3-EF1a-NICD1；3：pCMV(CAT)T7-SB100；4：C-luc-SB13

圖1 4種誘癌質(zhì)粒的DNA凝膠電泳

2.2小鼠ICC發(fā)生情況 A、B組小鼠在實驗期間均未發(fā)生死亡，隨著實驗時間的延長，實驗組小鼠逐漸出現(xiàn)精神萎靡，食欲減退，體質(zhì)量減輕，毛發(fā)失去光澤，部分呈現(xiàn)出嗜睡狀態(tài)。A組中有7只腹水明顯，B組中有4只腹水明顯，而對照組精神食欲正常，體質(zhì)量無明顯變化。4周后處死全部小鼠，對照組肝臟無

A：A組小鼠腫瘤生長情況；B：B組小鼠腫瘤生長情況；C：C組小鼠腫瘤生長情況；D：D組小鼠腫瘤生長情；E：C組小鼠腹水情況；F：A組小鼠腹水情況；G：D組小鼠腹水情況；H：B組小鼠腹水情況

圖2 ICC病理及小鼠腹水情況

A：A組肝臟組織呈多灶囊泡狀改變；B：A組肝臟組織鏡下形態(tài)；C：C組肝臟組織表面光滑未見異常改變；D：C組肝臟組織鏡下形態(tài)；E：B組肝臟組織呈多灶囊泡狀改變；F：B組肝臟組織鏡下形態(tài)；G：D組肝臟組織表面光滑未見異常改變；H：D組肝臟組織鏡下形態(tài)

圖3小鼠ICC腫瘤組織標(biāo)本及石蠟切片(HE，×400)

明顯變化。A組小鼠全部成癌，成癌率100%，B組小鼠中14只成癌，成癌率70%，兩組成癌率比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。肝臟表面可見多結(jié)節(jié)狀腫塊，切面灰白質(zhì)脆，呈魚肉狀，伴多囊形成，囊徑0.4～1.0 cm，內(nèi)含清亮液體，見圖2。

2.3組織病理學(xué)變化 經(jīng)HE染色鏡下實驗組腫瘤組織呈彌漫性生長，部分呈小片狀分布，累犯周邊肝小葉。腫瘤組織中可見形狀不規(guī)則的腺管樣結(jié)構(gòu)，部分呈乳頭狀生長。瘤細(xì)胞形狀不一，大小不等，多呈低柱狀或立方狀單層排列，部分細(xì)胞呈復(fù)層排列。細(xì)胞核大，深染，部分可見核分裂。胞質(zhì)少，染色深。局部瘤細(xì)胞間質(zhì)血管豐富，腫瘤間質(zhì)及腺管樣結(jié)構(gòu)內(nèi)可見炎性細(xì)胞浸潤。腫瘤周圍部分血管充血淤血明顯。胃、胰腺、腎等器官未見腫瘤轉(zhuǎn)移。對照組細(xì)胞結(jié)構(gòu)完整，核型一致，見圖3。

2.4免疫組織化學(xué)結(jié)果 CK19免疫組織化學(xué)定位于細(xì)胞質(zhì)，A組中ICC瘤細(xì)胞45%(9/20)中等陽性表達(dá)，55%(11/20)強(qiáng)陽性表達(dá)；B組中ICC瘤細(xì)胞40%(8/20)中等陽性表達(dá)，60%(12/20)強(qiáng)陽性表達(dá)；C組、D組無陽性表達(dá)。AKT-HA定位于細(xì)胞質(zhì)及細(xì)胞膜，A組中ICC瘤細(xì)胞60%(12/20)強(qiáng)陽性表達(dá)，40%(8/20)中等強(qiáng)陽性表達(dá)；B組中ICC瘤細(xì)胞35%(7/20)中等陽性表達(dá)，65%(13/20)強(qiáng)陽性表達(dá)；C組、D組中無陽性表達(dá)，見圖4。

A：A組 ICC肝臟組織CK19蛋白表達(dá)于腫瘤細(xì)胞細(xì)胞質(zhì)中顯示是膽管細(xì)胞分化；B：A組 ICC肝臟組織中HA蛋白表達(dá)于腫瘤細(xì)胞細(xì)胞膜、細(xì)胞質(zhì)；C：B組肝臟組織中CK19蛋白表達(dá)于腫瘤細(xì)胞細(xì)胞質(zhì)中顯示是膽管細(xì)胞分化；D：B組肝臟組織中HA蛋白表達(dá)于腫瘤細(xì)胞細(xì)胞膜、細(xì)胞質(zhì)；E：C組肝臟組織中CK19免疫組織化學(xué)表達(dá)陰性；F：C組肝臟組織中HA免疫組織化學(xué)表達(dá)陰性；G：D組肝臟組織中CK19免疫組織化學(xué)表達(dá)陰性；H：D組肝臟組織中HA免疫組織化學(xué)表達(dá)陰性

圖4小鼠ICC實驗組及對照組免疫組織化學(xué)結(jié)果(×400)

3 討 論

EVERT等[8]研究發(fā)現(xiàn)單獨(dú)激活Notch信號通路雖然可以單獨(dú)促進(jìn)ICC的發(fā)展，但周期較長，一般為20～25周。ZENDER等[9]發(fā)現(xiàn)Notch信號通路和AKT信號通路在ICC形成和發(fā)展中具有重要作用，二者結(jié)合可以加速ICC發(fā)展。水流動力學(xué)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染方法是一種全新的體內(nèi)基因轉(zhuǎn)移技術(shù)。ZHANG等[10]認(rèn)為，水流動力學(xué)注射是一個物理過程，肝內(nèi)皮細(xì)胞窗在高壓情況下增大，導(dǎo)致肝細(xì)胞膜產(chǎn)生了孔隙，從而質(zhì)粒DNA可通過孔隙進(jìn)入肝細(xì)胞。BIAO等[5]利用表達(dá)NICD1的轉(zhuǎn)座子誘導(dǎo)小鼠ICC的形成，其周期為5個月。AMMRA等[11]發(fā)現(xiàn)SB轉(zhuǎn)座酶是第1個可以在脊椎動物細(xì)胞中進(jìn)行基因轉(zhuǎn)移的轉(zhuǎn)座子，并且支持脊椎動物全面遺傳工程，包括轉(zhuǎn)基因、插入突變和治療性體細(xì)胞基因。HUDECEK等[6]發(fā)現(xiàn)SB轉(zhuǎn)座酶結(jié)合水流動力學(xué)轉(zhuǎn)染方法可以使靶基因在肝臟中長期穩(wěn)定表達(dá)。因此本研究利用水流動力學(xué)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染方法，將誘癌質(zhì)粒pT3-myr-AKT-HA (humanAKT1)、pT3-EF1a-NICD1，分別與SB100和SB13混合后通過尾靜脈快速注射入小鼠體內(nèi)，建立ICC模型。以此來觀察結(jié)合兩種轉(zhuǎn)座酶后對ICC模型成瘤率的影響。實驗發(fā)現(xiàn)結(jié)合SB100的成瘤率高于SB13。對于未結(jié)合SB轉(zhuǎn)座酶的C組，與文獻(xiàn)報道一致[9]，D組無明顯異常改變。

綜上所述，利用水流動力學(xué)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染法并結(jié)合SB轉(zhuǎn)座酶構(gòu)建小鼠ICC動物模型具有以下優(yōu)點(diǎn)：(1)操作簡單，成瘤概率高，可以大量制備ICC動物模型。(2)癌變過程與人類ICC發(fā)生相似，可以用于ICC發(fā)病機(jī)制，病因和治療的研究。(3)由于是無創(chuàng)操作，實驗動物耐受性好，病死率低，實用性強(qiáng)。本實驗充分比較了兩種SB轉(zhuǎn)座酶對于構(gòu)建ICC模型的影響，結(jié)果表明SB100在成瘤率上顯著優(yōu)于SB13。