張 宇，蒙 軒，王 勛

肝細(xì)胞癌(hepatocellular carcinoma，HCC)是一種臨床上高死亡率的原發(fā)性肝癌[1-2]。癌細(xì)胞的失控生長是癌癥高致死率的主要原因，探討肝癌發(fā)生發(fā)展分子機(jī)制，尋找肝細(xì)胞癌惡性增殖的生物標(biāo)志和干預(yù)治療靶點(diǎn)，已成為近年來肝癌研究的熱點(diǎn)[3]。研究[4]表明己糖激酶(hexokinase, HK)是生物糖酵解途徑限速酶，己糖激酶2(HK2)與諸多惡性腫瘤發(fā)生存在關(guān)系。目前HK2與肝癌發(fā)生發(fā)展的關(guān)系少見報(bào)道，通過高通量測序發(fā)現(xiàn)其可能高表達(dá)，但缺乏深入的研究[5]。該研究旨在探討HK2在肝癌中的表達(dá)特點(diǎn)并分析其表達(dá)與臨床特征參數(shù)的關(guān)系，檢測其對人肝癌高轉(zhuǎn)移細(xì)胞株HepG2細(xì)胞增殖、周期、凋亡的影響。

1 材料與方法

1.1組織樣本及主要試劑

1.1.1病例資料及實(shí)驗(yàn)細(xì)胞 選取2015年6月～2018年10月中國人民解放軍總醫(yī)院肝膽外科、中國人民解放軍第302醫(yī)院肝膽外科肝細(xì)胞肝癌手術(shù)患者，共計(jì)48例，取肝癌組織(非壞死區(qū)腫瘤組織)及癌旁組織(距腫瘤邊緣2 cm肝硬化組織，約0.5 cm×0.5 cm×0.5 cm)。所有新鮮組織獲取后立即轉(zhuǎn)入液氮固定。人肝癌高轉(zhuǎn)移細(xì)胞株HepG2細(xì)胞購自北京協(xié)和基礎(chǔ)研究所細(xì)胞中心 。

1.1.2主要試劑 蛋白提取RIPA裂解液、BCA蛋白濃度測定試劑盒、SDS-PAGE凝膠配制試劑、細(xì)胞周期檢測碘化丙啶染色試劑購自江蘇碧云天公司；細(xì)胞轉(zhuǎn)染試劑Lipo 3000購自美國Invitrogen公司；Annexin V-FITC/PI雙染細(xì)胞凋亡檢測試劑盒購自江蘇凱基生物公司；HK2抗體、GAPDH抗體購自英國abcam公司。

1.2方法

1.2.1免疫組化檢測肝癌組織HK2表達(dá)量 所有組織標(biāo)本(48例肝癌組織，48例癌旁組織)常規(guī)甲醛固定及石蠟包埋，將蠟塊切成5 um厚的組織切片，覆蓋于預(yù)先經(jīng)過防脫處理的載玻片上，經(jīng)過烤片、水化、抗原修復(fù)，分別滴加一抗和二抗，DAB顯色，中性樹膠封片。光學(xué)顯微鏡拍照，采用IPP軟件對圖片進(jìn)行積分光密度(integrated option density，IOD)值。

1.2.2HK2 shRNA載體構(gòu)建 設(shè)計(jì)并合成4對小發(fā)卡RNA(short hairpin RNA, shRNA)序列，分別命名為shRNA_1、shRNA_2、shRNA_3、shRNA_4，其序列見表1?？寺∵B接實(shí)驗(yàn)室改造的pLKO.1-GFP質(zhì)粒。測序驗(yàn)證后，轉(zhuǎn)染至HepG2細(xì)胞。

表1 4對候選HK2 shRNA序列

1.2.3Western blot檢測HK2表達(dá) 收集人正常肝細(xì)胞L-02、人肝癌細(xì)胞HepG2；以及control RNA、shRNA_1、shRNA_2、shRNA_3、shRNA_4組HepG2細(xì)胞，RIPA細(xì)胞蛋白裂解液提取蛋白，BCA法用于蛋白定量。SDS-PAGE凝膠電泳后NC膜恒流濕法進(jìn)行轉(zhuǎn)膜。轉(zhuǎn)膜成功的NC膜轉(zhuǎn)移到5%脫脂奶粉-TBST封閉液于室溫封閉l h。再將NC膜分別加入稀釋的HK2和GADPH一抗，4 ℃輕搖過夜；隨后加入相應(yīng)的二抗(1 ∶100稀釋)，37 ℃恒溫?fù)u床孵育1 h。蛋白的相對表達(dá)量用待測蛋白與GADPH的灰度值比值計(jì)算。

1.2.4MTT法檢測細(xì)胞增殖 將空白組(正常培養(yǎng)、未轉(zhuǎn)染質(zhì)粒)、control shRNA組(轉(zhuǎn)染control shRNA)、HK2 shRNA組(轉(zhuǎn)染shRNA_3)HepG2細(xì)胞穩(wěn)定培養(yǎng)后傳代于96孔板，完全培養(yǎng)基培養(yǎng)，分別于第0、24、36、72小時(shí)進(jìn)行MTT檢測。每組4個(gè)復(fù)孔。96孔板每孔加入20 μl MTT(5 mg/ml PBS溶解)，孵育4 h然后棄除上清液。每孔里面再加入150 μl Formazan溶解液，振蕩10 min，充分溶解結(jié)晶物。酶標(biāo)儀(570 nm)測定吸光度(optical density, OD)值。

1.2.5流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞周期 各組細(xì)胞完全培養(yǎng)基培養(yǎng)，用胰酶消化收集細(xì)胞，加入1 ml 75%預(yù)冷乙醇中，吹打均勻，4 ℃固定12 h以上，再加入PBS洗滌，1 000 r/min離心5 min，清洗2次。重懸細(xì)胞用0.5 ml PBS，每孔加入PI和 RNaseA至終濃度50 μg/ml，37 ℃溫浴30 min。流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞周期。

1.2.6Annexin V-FITC/PI雙標(biāo)記法檢測細(xì)胞凋亡 收集各組細(xì)胞，置于100目銅網(wǎng)上輕搓，生理鹽水沖洗，2 500 r/min離心棄去上清液及細(xì)胞碎片，收集細(xì)胞懸液。參照Annexin V-FITC/PI雙染細(xì)胞凋亡檢測試劑盒說明，通過流式細(xì)胞儀進(jìn)行分析。

2 結(jié)果

2.1HK2在肝癌中差異表達(dá)免疫組化結(jié)果顯示：相對于癌旁組織，HK2在肝癌組織中表達(dá)顯著升高；IOD值量化結(jié)果表明肝癌組織中HK2相對表達(dá)值為(643.00±79.17)，癌旁組織中HK2相對表達(dá)值為(441.80±31.32)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見圖1A。Western blot結(jié)果顯示：相對于人正常肝細(xì)胞L-02，HK2在人肝癌細(xì)胞HepG2中表達(dá)顯著升高；灰度值量化結(jié)果表明L-02細(xì)胞HK2相對表達(dá)值為(1.08±0.14)，HepG2中HK2相對表達(dá)值為(1.46±0.18)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見圖1B。

2.2HK2表達(dá)與肝癌臨床病理特征關(guān)系48例肝組織中HK2表達(dá)與患者性別、年齡、血清甲胎蛋白(alpha-feto protein, AFP)含量、乙肝表面抗原(Hepatitis B surface antigen, HBsAg)感染差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，與腫瘤直徑、TNM分期、組織病理分級差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見表2。

2.3HepG2細(xì)胞中HK2沉默表達(dá)與效率評價(jià)Western blot檢測HK2 shRNA_1、shRNA_2、shRNA_3、shRNA_4轉(zhuǎn)染HepG2細(xì)胞后HK2蛋白表達(dá)情況：HK2 shRNA_3沉默效率最佳，其HK2蛋白表達(dá)均顯著低于control shRNA組。建立穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的細(xì)胞株HK2 shRNA、control shRNA，熒光顯微鏡檢測轉(zhuǎn)染效率，用于后面實(shí)驗(yàn)檢測。見圖2。

2.4沉默HK2表達(dá)對肝癌HepG2細(xì)胞增殖的影響MTT法檢測各組細(xì)胞增殖活性：48 h起，HK2 shRNA組細(xì)胞增殖活性明顯低于control shRNA組和空白組，72 h時(shí)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=55.6，P<0.01)，空白組HepG2細(xì)胞和control shRNA組細(xì)胞增殖活性差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見圖3。表明HK2表達(dá)的降低可顯著降低HepG2細(xì)胞增殖活性。

圖1 HK2在肝癌中差異表達(dá)

2.5沉默HK2表達(dá)對肝癌HepG2細(xì)胞周期的影響流式細(xì)胞儀檢測各組細(xì)胞周期：HK2 shRNA組、control shRNA組、空白組S期細(xì)胞百分比分別為(24.48%±4.25%)、(32.32%±3.98%)、(38.68%±5.17%)，經(jīng)單因素方差分析，組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=7.51，P<0.05)。表明HK2 shRNA組細(xì)胞更少停滯在S期，細(xì)胞周期發(fā)生明顯轉(zhuǎn)變，見圖4。

表2 HK2表達(dá)與肝癌臨床病理特征關(guān)系(n)

圖2 HepG2細(xì)胞中HK2沉默表達(dá)與效率評價(jià)

2.6沉默HK2表達(dá)對肝癌HepG2細(xì)胞凋亡的影響Annexin V-FITC/PI雙標(biāo)記法檢測各組細(xì)胞凋亡：HK2 shRNA組、control shRNA組、空白組的細(xì)胞總凋亡率分別為分別為(17.74±2.67)%、(8.97±1.02)%、(6.83±0.95)%，經(jīng)單因素方差分析，組間差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=33.16，P<0.01)。HK2表達(dá)的降低可顯著升高HepG2細(xì)胞凋亡率，且與control shRNA組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，空白組HepG2細(xì)胞和control shRNA組細(xì)凋亡率差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),見圖5。提示HK2可能通過抑制凋亡促進(jìn)腫瘤生長。

圖3 沉默HK2表達(dá)對肝癌HepG2細(xì)胞增殖的影響

與空白組比較：*P<0.05；與control shRNA組比較：#P<0.05

3 討論

HK2作為機(jī)體糖酵解途徑的第一個(gè)關(guān)鍵限速酶，其與線粒體外膜電壓依賴性陰離子通道蛋白相結(jié)合促進(jìn)糖酵解的發(fā)生和腫瘤細(xì)胞的形成[6]，HK2在腫瘤發(fā)生進(jìn)展中的作用及如何抑制HK2成為了當(dāng)前研究的熱點(diǎn)。研究[7]表明HK2的表達(dá)與喉鱗癌腫瘤部位、臨床分期有關(guān)，在聲門上型喉鱗癌標(biāo)本中HK2多呈高表達(dá)，而在聲門型喉鱗癌中多呈中到低度表達(dá)，HK2表達(dá)隨腫瘤分期的升高而增加。此外，多項(xiàng)研究[8-9]表明應(yīng)用HK2抑制劑如3-溴丙酮酸(3-Bromopyruvic acid, 3BrPA)、2-脫氧-D-葡萄糖，在腫瘤細(xì)胞和動(dòng)物模型中有效干預(yù)了腫瘤的進(jìn)程。研究[10]表明3-BrPA可以削弱HepG2細(xì)胞有氧糖酵解相關(guān)基因及關(guān)鍵酶的表達(dá)，抑制葡萄糖下游步驟和谷氨酰胺代謝，發(fā)揮抗腫瘤作用。

隨著分子生物學(xué)技術(shù)的迅猛發(fā)展，一些新手段用于靶向干預(yù)HK2，如shRNA技術(shù)。shRNA由于其髙度的序列專一性，可以實(shí)現(xiàn)特異性沉默特定基因的表達(dá)，已被廣泛用于探索基因功能及惡性腫瘤基因治療領(lǐng)域[11-12]。有學(xué)者[13]針對己糖激酶基因(HK1、HK2、HK3)在結(jié)直腸癌(HT-29、SW 480、HCT-15、RKO、HCT 116)和黑色素瘤(MDA-MB-435S和SK-MEL-28)細(xì)胞系中使用shRNA病毒載體沉默，分別轉(zhuǎn)染或共轉(zhuǎn)染后結(jié)果顯示HK2沉默失活與結(jié)直腸癌細(xì)胞系中HK1的表達(dá)增加有關(guān)，HK1和HK2同時(shí)表達(dá)衰減導(dǎo)致細(xì)胞活力下降，共轉(zhuǎn)染HK1、HK2和HK3 shRNA可導(dǎo)致細(xì)胞迅速凋亡，提示HK1和HK2同時(shí)失活足以減少黑色素瘤和結(jié)直腸癌細(xì)胞的增殖和存活，其可作為癌癥潛在治療靶點(diǎn)。張丹 等[14]觀察shRNA沉默HK2對乳腺癌細(xì)胞MDA-MB231放療敏感性的影響，結(jié)果表明給予不同劑量的X線照射后，細(xì)胞存活率呈劑量依賴性遞減的趨勢，且shRNA處理組的存活率較對照組明顯下降，細(xì)胞凋亡率明顯高于對照組，表明沉默乳腺癌細(xì)胞HK2基因可增加其對放療的敏感性。

圖4 沉默HK2表達(dá)對肝癌HepG2細(xì)胞周期的影響

圖5 沉默HK2X表達(dá)對肝癌HepG2細(xì)胞凋亡的影響

由于當(dāng)前尚無有關(guān)HK2與肝細(xì)胞肝癌發(fā)生發(fā)展關(guān)系的研究報(bào)道，本研究通過沉默HK2研究其在人肝癌高轉(zhuǎn)移細(xì)胞株HepG2中功能。首先，通過檢測肝癌組織和細(xì)胞中HK2蛋白表達(dá)，結(jié)果顯示HK2在肝癌組織中表達(dá)顯著升高，與Zhang et al[5]通過高通量測序手段發(fā)現(xiàn)HK2可能在肝細(xì)胞腫瘤中高表達(dá)結(jié)論一致。臨床病理特征統(tǒng)計(jì)分析顯示HK2表達(dá)與腫瘤直徑、TNM分期、組織病理分級存在相關(guān)性，與HK2在其它腫瘤中表達(dá)意義一致。隨后，建立穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的細(xì)胞株HK2 shRNA，檢測細(xì)胞周期變化可以看出HK2沉默干擾使得細(xì)胞周期發(fā)生明顯轉(zhuǎn)變，更少停滯在S期。此外，沉默HK2表達(dá)可顯著降低HepG2細(xì)胞增殖活性，顯著升高HepG2細(xì)胞凋亡率，與HK2在結(jié)直腸癌[13]、喉鱗狀細(xì)胞癌[15]等腫瘤中作用機(jī)制一致。細(xì)胞凋亡是細(xì)胞生長分化調(diào)節(jié)的重要手段，又是機(jī)體免受腫瘤危害的重要保護(hù)機(jī)制，癌變了的細(xì)胞發(fā)生凋亡的能力通常極低，而增殖能力則相應(yīng)增強(qiáng)，這直接導(dǎo)致了瘤細(xì)胞快速而病態(tài)的分裂增殖，暗示HK2可能通過抑制凋亡促進(jìn)腫瘤生長。

以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示HK2具有抗腫瘤潛能，為肝細(xì)胞癌患者的腫瘤靶向治療提供理論基礎(chǔ)，并為后續(xù)的肝細(xì)胞癌侵襲轉(zhuǎn)移機(jī)制研究提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。但是本研究還沒有從動(dòng)物水平探討沉默HK2對裸鼠移植瘤可能的影響及治療作用，有待在后續(xù)實(shí)驗(yàn)中完善，有關(guān)HK2在肝癌中作用的詳細(xì)機(jī)制有待更加深入的探討。