楊曉娟，高覺民，張 寧，楊詩錦，楊東清，于 明，田 婷，李國春＊＊

（1.南京中醫(yī)藥大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)系 南京 210023；2.南京中醫(yī)藥大學(xué)附屬江蘇省中醫(yī)院神經(jīng)外科南京 210029；3.邳州市中醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科 徐州 221300；4.江蘇大學(xué)附屬江濱醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科 鎮(zhèn)江 212001：5.南京中醫(yī)藥大學(xué)附屬南京市中醫(yī)院急診科 南京 210001）

腦出血是指腦動脈、靜脈或毛細(xì)血管破裂導(dǎo)致腦實(shí)質(zhì)內(nèi)的出血[1]。因其高發(fā)病率、高致殘率及高病死率，已成為危害人類健康最主要的疾病之一[2]。根據(jù)2018 年中國腦血管病防治指南，每年新發(fā)腦卒中200萬人，死于腦血管疾病150萬人。急性腦出血占中國腦卒中的17.1-55.4%，發(fā)病率遠(yuǎn)高于西方國家[3]。目前，手術(shù)治療雖可取得一定療效，但患者預(yù)后仍不佳。腦出血因其復(fù)雜未知的發(fā)病機(jī)制和迅疾的發(fā)病速度，加之缺乏有效治療手段，其致殘率、死亡率始終居高不下[4]。瘀熱是腦出血急性期以“瘀”與“熱”兩種病理因素互相膠結(jié)而成的具有新特質(zhì)的復(fù)合病理因素[5]。國醫(yī)大師周仲瑛教授認(rèn)為“瘀熱”是腦出血急性期首要的核心病理機(jī)轉(zhuǎn)，風(fēng)、痰、火、虛，皆因“瘀熱”而起。因此，“瘀熱阻竅”是腦出血急性期的基本病機(jī)[6]。根據(jù)腦出血“瘀熱”病機(jī)理論進(jìn)行論治，能夠取得顯著療效[7][8]。腦出血急性期“瘀熱”深淺與患者預(yù)后密切相關(guān)，但對于“瘀熱”病機(jī)的診斷目前基于專家經(jīng)驗(yàn)和主觀指標(biāo)構(gòu)成的量表，尚缺乏客觀量化和敏感的特異性指標(biāo)。

代謝組學(xué)屬于系統(tǒng)生物學(xué)的新興發(fā)展領(lǐng)域，旨在測定盡可能多的小分子代謝物，這些代謝物多處于生命活動調(diào)控的末端，可對相關(guān)細(xì)胞的整體生命活動和疾病的狀態(tài)有一個清晰全面的闡述[9]。已有研究表明，腦出血后的繼發(fā)性損傷由血紅素氧化酶-1通過多種代謝物發(fā)揮作用，但相關(guān)代謝物的具體作用途徑仍復(fù)雜不明[10]。同時，腦出血的病理變化與氨基酸代謝、糖異生、脂肪酸代謝等通路息息相關(guān)[11]。先前也有學(xué)者做過腦出血與腦梗死的代謝組學(xué)鑒別，并證實(shí)其為預(yù)測腦出血的快速、及時的工具[12，13]。本研究以圖6實(shí)驗(yàn)流程所示，采用差異代謝組學(xué)的方法篩選和評價急性腦出血“瘀熱”病機(jī)的生物標(biāo)志物，并探討基于瘀熱病機(jī)的腦出血體內(nèi)動態(tài)變化。

1 資料和方法

1.1 樣本收集

患者資料來源于江蘇省中醫(yī)院神經(jīng)外科和江蘇大學(xué)附屬鎮(zhèn)江市江濱醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科。納入本研究的ICH急性期患者（n=80）年齡40-80 歲，男女不限；符合西醫(yī)腦出血急性期診斷標(biāo)準(zhǔn)，中醫(yī)辨證分型參照《瘀熱病機(jī)證候量化診斷標(biāo)準(zhǔn)評分表》，若量表評分總分大于10分即診斷為瘀熱型，其中瘀熱型和非瘀熱型各40例；患者發(fā)病48 小時內(nèi)入院。同時收集健康志愿者(n=40)血樣作為對照。瘀熱型、非瘀熱型和健康組按照年齡、性別進(jìn)行匹配。本研究得到了南京中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院倫理委員會審批（No.2014NL-037-02），且所有研究對象必須簽署知情同意書。急性腦出血患者于入院次日上午7:00 時抽取空腹靜脈血2 mL，于EDTA抗凝管中，室溫靜置2 h 后，4℃，1 000 r·min-1離心20 min，用加樣器吸取血漿，按每管300 μL 分裝成數(shù)管，-80℃冷凍備用，健康對照組血樣采集和處理同上。

1.2 儀器和試劑

Q-Exactive 高分辨質(zhì)譜系統(tǒng)（美國Thermo 公司）；配UPLC 超高效液相系統(tǒng)（美國Waters 公司）；Xcalibur數(shù)據(jù)采集軟件（美國Thermo 公司）；Centrifuge 5424R離心機(jī)（德國Eppendorf 公司）；CentriVap 離心濃縮儀（美國Labconco 公司）；Kylin-bell VORTEX-5 渦旋振蕩器（海門市其林貝爾儀器制造有限公司）；乙腈、甲醇、色譜純（德國Merck 公司）；蒸餾水（香港屈臣氏公司）；甲酸、碳酸氫銨（美國Sigma公司）。

1.3 樣品準(zhǔn)備

將上述血漿樣本解凍，冰上操作，移取血漿樣品100 μL于1.5 mL Ep管中，加400 μL冷乙腈（含內(nèi)標(biāo)），渦旋振蕩1 min，室溫下靜置10 min，4℃條件下以14 000 g 離心15 min。取上清液，凍干，-20℃保存。QC樣品由每個實(shí)際樣品取10 μL 混合制得，將血漿凍干提取液復(fù)溶于100 μL 的20%甲醇/水溶液中，然后進(jìn)行色譜分析。

1.4 LC/MS條件

反相色譜-正離子質(zhì)譜模式如下：色譜柱為BEH C8 柱（1.7μm，2.1×100 mm）；柱溫50℃；進(jìn)樣體 積10 μL；流動相：A 相，水（含0.1%甲酸）；B 相，乙腈（含0.1%甲酸）；流速0.35 mL/min；5% B 為起始濃度(1～24 min)，B 相升為100%，平衡至27.5 min，27.6 min 時B相降為5%，平衡至30 min；質(zhì)譜條件：采用加熱電噴霧離子源HESI-Positive 模式，一級全掃描+DDA 二級子離子掃描模式；反相色譜-負(fù)離子質(zhì)譜模式如下：色譜柱為BEH T3 柱（1.8 μm，2.1×100 mm，美國Waters 公司）；柱溫50℃；進(jìn)樣體積10 μL；流動相：A 相，水（含6.5 mM 碳酸氫銨）；B 相，95%甲醇/水（含6.5 mM 碳酸氫銨）；流速0.35 mL/min；5%B為起始濃度（1-18 min），B 相升為100%，平衡至22 min，22.1 min 時B 相降為5%，平衡至25 min；質(zhì)譜條件：采用加熱電噴霧離子源HESI-Negative 模式，一級全掃描+DDA 二級子離子掃描模式。在以70-1 000 m/z于擴(kuò)展的動態(tài)范圍（2 Ghz）的全掃描模式下，以氮?dú)鉃殪F化氣體（8 L/min，350℃），用正電噴霧模式采集數(shù)據(jù)。毛細(xì)管電壓為3 800 V，毛細(xì)管溫度為320℃。

1.5 代謝物鑒定與通路分析

采用Xcalbur 數(shù)據(jù)分析軟件收集結(jié)果，運(yùn)用OSI/SMMS 定性分析軟件（大連達(dá)碩信息技術(shù)有限公司）、HMDB 和Metabolites Biological Role 對提取的分子特征進(jìn)行非靶向代謝組學(xué)分析。

1.6 數(shù)據(jù)處理和統(tǒng)計分析

采用SIMCA 軟件（版本14.0）進(jìn)行多變量統(tǒng)計分析,包括主成分分析（PCA），偏最小二乘判別分析（PLS-DA）和正交偏最小二乘判別分析（OPLS-DA），提供模型參數(shù)和VIP 值。運(yùn)用R 語言（版本3.6）進(jìn)行火山圖、熱圖、t-test 單變量統(tǒng)計分析，采用SPSS 軟件（版本21.0，IBM）以ROC 曲線評價代謝物的靈敏度和特異性，應(yīng)用Logistic回歸分析對篩選的代謝物進(jìn)行綜合評價。

2 結(jié)果

2.1 健康組、非瘀熱組與瘀熱組之間得分比較 2.1.1 PCA得分

圖1 健康組、ICH急性期非瘀熱組和ICH急性期瘀熱組的多變量統(tǒng)計分析

采用PCA 降維方法對健康組、非瘀熱組和瘀熱組之間的差異代謝物進(jìn)行分析。結(jié)果如圖1A所示，PCA模型在第4 個主成分達(dá)到最大（R2X=0.384，Q2=0.299），結(jié)果顯示ICH 患者和健康受試者分布于兩個獨(dú)立區(qū)域，表明ICH 患者與健康組之間存在顯著代謝差異。

2.1.2 PLS-DA得分與置換檢驗(yàn)

圖2 OPLS-DA評分圖

圖3 ICH急性期非瘀熱組和ICH急性期瘀熱組之間的多變量統(tǒng)計分析

PLS-DA 分析結(jié)果如圖1B 所示，模型在第5 個主成分達(dá)到最大，（R2Y=0.826，Q2=0.691）顯示非瘀熱組和瘀熱組之間輪廓分離逐漸明顯。ICH患者和健康人的置換檢驗(yàn)驗(yàn)證模型（圖1C、圖1D、圖1E），確保模型未過擬合。圖3A（R2Y=0.61，Q2=0.61）顯示非瘀熱組與瘀熱組趨勢分離，表明當(dāng)前模型可用于解釋和預(yù)測。

2.1.3 OPLS-DA得分與置換檢驗(yàn)

OPLS-DA 得分圖顯示健康組、瘀熱組、非瘀熱組三者呈現(xiàn)完全獨(dú)立的區(qū)域（圖1F，R2Y=0.944，Q2=0.745）。兩個獨(dú)立的監(jiān)督模型（OPLS-DA）證明瘀熱組與健康組之間以及非瘀熱組與健康組之間各自存在顯著差異（圖2A，R2Y=0.91，Q2=0.93；圖2B，R2Y=0.92，Q2=0.92）。非瘀熱組和瘀熱組兩個群體亦基本分布于PC1兩側(cè)（圖3B，R2Y=0.73，Q2=0.63），置換檢驗(yàn)結(jié)果為R2=0.33，Q2=-0.55（圖3C）。

2.2 差異代謝物及涉及通路

2.2.1 瘀熱組與健康組、非瘀熱組與健康組

OPLS-DA 的VIP 值（＞1.5）與學(xué)生t檢驗(yàn)結(jié)果相結(jié)合，初篩與腦出血相關(guān)的代謝產(chǎn)物（表1）。得出瘀熱組與健康組之間差異代謝物27個，非瘀熱組與健康組之間差異代謝物23 個。二者共有代謝產(chǎn)物20 個，其中酯類以上調(diào)為主，如異紫花前胡內(nèi)酯、沒食子酸酯、10-脫氧甲炔內(nèi)酯；類固醇激素類及其中間產(chǎn)物上調(diào)，如19-羥基-17-氧代雄甾-5-烯-3-β-基硫酸鹽、孕酮。此外，SP 600125、甲基異丙胺磷、麥角硫氨酸顯著上調(diào)；油基乙醇胺顯著下調(diào)。若只考慮統(tǒng)計意義可見大量脂肪酸下調(diào)（表S1），有戊烯酸、異甘草酸、7-氧代十二烷酸、9-癸烯酸、DL-2-氨基辛酸等。

2.2.2 非瘀熱組與瘀熱組

非瘀熱組與瘀熱組之間的血漿差異代謝物為14個（表2），主要與氧化應(yīng)激、促凝作用、細(xì)胞凋亡、抗炎效應(yīng)相關(guān)。上調(diào)產(chǎn)物有間苯二酚，下調(diào)產(chǎn)物有燕麥蒽酰胺E、可的松21-乙酸酯、丙基三甲基甜菜堿、淫羊藿苷A、酸甲酯、甘油三酯等。代謝產(chǎn)物所涉及的通路有類固醇激素合成、組氨酸代謝和半乳糖代謝等（表3、圖4）。

表1 急性ICH瘀熱組、急性ICH非瘀熱組分別與健康組之間的血漿差異代謝物

表2 急性ICH非瘀熱組與瘀熱組的血漿差異代謝物

表3 非瘀熱組與瘀熱組之間血漿差異代謝物涉及的代謝途徑

圖4 代謝通路

2.3 ICH瘀熱病機(jī)的潛在生物標(biāo)志物

對非瘀熱組與瘀熱組的三個差異代謝物可的松21-乙酸酯、酸甲酯和甘油三酯進(jìn)行聯(lián)合ROC 曲線分析得出：曲線面積為0.91，敏感度85%，特異性82.5%（圖5），可作為瘀熱病機(jī)急性ICH的組合診斷因子。

3 討論

本研究運(yùn)用非靶向代謝組學(xué)的研究方法，建立了急性腦出血瘀熱病機(jī)相關(guān)的一系列差異代謝物，包括酯類、脂肪酸類、酚類等化合物?，F(xiàn)就其進(jìn)行進(jìn)一步探討，并尋找與瘀熱發(fā)病機(jī)制相關(guān)的潛在生物標(biāo)志物。

3.1 酯類

圖5 可的松21-乙酸酯、酸甲酯、甘油三酯的聯(lián)合ROC曲線（聯(lián)合因子）

圖6 急性腦出血瘀熱病機(jī)生物標(biāo)志物研究流程圖

酯是羧酸或無機(jī)含氧酸與醇發(fā)生酯化而成的產(chǎn)物，與健康組相比，ICH 患者酯類多為上調(diào)，且瘀熱組更為顯著。非瘀熱組/瘀熱組中的酯類化合物多為下調(diào)，說明酯類合成增強(qiáng)不僅與ICH 急性期有關(guān)還可能與此期間的瘀熱產(chǎn)物相關(guān)。不同的是，沒食子酸酯卻在非瘀熱組上調(diào)更為顯著，它可以降低IL-6、TNF-α和Aβ對神經(jīng)細(xì)胞的毒性作用，并升高IL-2 水平[14]，同時激活細(xì)胞的抗氧化防御系統(tǒng)，減少Aβ引起的細(xì)胞氧化損傷和細(xì)胞凋亡[15]，故抑制炎癥因子趨化和誘導(dǎo)抗氧化物合成可能有助于減少瘀熱相關(guān)產(chǎn)物的生成。異紫花前胡內(nèi)酯顯著抑制VEGF-A 誘導(dǎo)的血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖、遷移、侵襲和微血管生成[16]，以抑制活躍的血管內(nèi)皮生長因子進(jìn)一步阻止血管通透性增強(qiáng)。與健康組相比，它在瘀熱組上調(diào)更高，提示瘀熱病機(jī)面臨的腦血管損傷威脅更大。但同時異紫花前胡內(nèi)酯對NE、KCl 收縮的血管環(huán)有舒張作用，且去除內(nèi)皮后舒張作用不受影響[17]。說明異紫花前胡內(nèi)酯還有直接作用于血管平滑肌的非內(nèi)皮依賴性舒張作用，這又會增加二次出血的可能性，因此瘀熱病機(jī)的腦出血更為兇險，且該代謝物在急性ICH 中的利弊尚待研究?？傻乃?1-乙酸酯是氫化可的松合成過程中的中間產(chǎn)物，它的出現(xiàn)提示體內(nèi)糖皮質(zhì)激素的分泌。氫化可的松可介導(dǎo)內(nèi)米松N 抑制hPDL 細(xì)胞分泌IL-6 和腫瘤壞死因子-α[18]，又可在大葉性性肺炎中直接降低血清IL-6 的水平[19]。作為非瘀熱與瘀熱組間的差異代謝物，其下調(diào)說明瘀熱狀態(tài)存在更劇烈的炎癥反應(yīng)，或許可以考慮作為反映瘀熱病機(jī)炎癥因子趨化動態(tài)的生物標(biāo)志物。丙基三甲基甜菜堿作為膽堿的氧化代謝產(chǎn)物，其去甲基后生成甘氨酸。甘氨酸是抑制性神經(jīng)遞質(zhì)，也是還原性谷胱甘肽的組成氨基酸，發(fā)生嚴(yán)重應(yīng)激時常用于機(jī)體補(bǔ)充[20]，故甘氨酸代謝可能是ICH 瘀熱病機(jī)涉及的通路之一。同時，甜菜堿可有效降低小鼠血漿高S-腺苷同型半胱氨酸水平，升高S-腺苷蛋氨酸水平，從而緩解高S-腺苷同型半胱氨酸誘導(dǎo)的動脈粥樣硬化[21]。又可降低氧化損傷的HUVEC 細(xì)胞IL-6、IL-8 和TNF-α等炎癥因子的含量，甚至高脂小鼠的肝臟比率、總膽固醇和甘油三酯含量[22，23]。因此，除了抗炎作用外，甜菜堿含量下降反映瘀熱病機(jī)可能還與腦血管硬化程度及血脂水平有關(guān)。5-羥色胺是一種由腦部5-HT 神經(jīng)元、胃腸道的胃竇細(xì)胞、肺部或其他一些外圍器官產(chǎn)生的活性物質(zhì)，也是在大腦皮層質(zhì)與神經(jīng)突觸內(nèi)分布較多的抑制性神經(jīng)遞質(zhì)，它在外周組織可刺激血管和平滑肌強(qiáng)烈收縮[24]。利血平的一種衍生物即是酸甲酯[25]，而利血平可抑制5-羥色胺在血小板和肥大細(xì)胞顆粒中的儲存[26]。故酸甲酯可能是5-羥色胺上游產(chǎn)物并有助于釋放該神經(jīng)遞質(zhì)，并根據(jù)調(diào)節(jié)5-羥色胺的釋放進(jìn)一步調(diào)控cAMP和JNK信號通路。酸甲酯的下調(diào)說明5-羥色胺釋放減少并伴隨腦血管收縮能力減弱，同時也意味減少了JNK 介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡，從舒縮腦血管和細(xì)胞凋亡角度可以考慮作為ICH 瘀熱病機(jī)的某一標(biāo)志物。血漿甘油三酯是促進(jìn)動脈粥樣硬化的風(fēng)險因子[27]，主要存在于富含甘油三酯脂蛋白中[28]，脂蛋白脂酶會進(jìn)入血液循環(huán)形成二聚體，后落于毛細(xì)血管腔面發(fā)揮水解甘油三酯的作用，繼而降低循環(huán)中甘油三酯脂蛋白水平[29]。相較于瘀熱組，甘油三酯在非瘀熱組顯著下降，提示基于瘀熱病機(jī)的腦出血機(jī)體脂蛋白脂酶活性受到一定程度的抑制，甘油三酯或可從預(yù)示腦血管硬化角度作為瘀熱病機(jī)的潛在標(biāo)志物。

3.2 脂肪酸類

脂肪酸在生理狀態(tài)下是脂肪代謝的中間產(chǎn)物，可為人體提供重要能源。實(shí)驗(yàn)證明血漿脂肪酸濃度升高可通過蛋白激酶介導(dǎo)的炎性反應(yīng)信號通路引發(fā)內(nèi)皮損傷[30]，且血清脂肪酸的濃度也是誘發(fā)高血壓的重要危險因素[31]。與健康組相比，DL-2-氨基-3-膦丙酸、戊烯酸、冬青葉豚草酸等含量均下調(diào)，說明ICH 急性期機(jī)體處于應(yīng)激狀態(tài)，糖供能不足后脂肪酸被大量使用，生成乙酰CoA 進(jìn)入三羧酸循環(huán)進(jìn)行氧化供能。訶子次酸能阻止甘油糖基化終產(chǎn)物并誘導(dǎo)LX2 細(xì)胞生成活性氧，也能防止ERK-磷酸化介導(dǎo)Nrf2 核易位導(dǎo)致的膠原蛋白積聚，以此提高抗氧化蛋白的產(chǎn)生[32]。它作為只出現(xiàn)在瘀熱組/健康組中的酚酸，含量顯著上調(diào)提示瘀熱機(jī)體存在更嚴(yán)重的氧化應(yīng)激，針對其治療或許可將抗氧化蛋白作為一個切入點(diǎn)。丙酸氧化生成丙酰CoA，經(jīng)羧化及異構(gòu)酶作用轉(zhuǎn)為琥珀酰CoA，最后參加三羧酸循環(huán)而被氧化。在非瘀熱組/瘀熱組中丙酸含量明顯降低，提示瘀熱病機(jī)下產(chǎn)生的瘀血、痰濁、內(nèi)風(fēng)等病理產(chǎn)物可能阻礙了三羧酸循環(huán)的某一環(huán)節(jié)，從而降低丙酸利用率。噻唑烷羧酸類的合成多以半胱氨酸為前體[33]，血漿同型半胱氨酸水平與高血壓腦出血的發(fā)生、高血壓級別密切相關(guān)，其水平與高血壓腦出血患者血壓分級呈正相關(guān)[34]，4-噻唑烷羧酸在非瘀熱組下調(diào)提示ICH 瘀熱機(jī)制下的半胱氨酸降解可能被抑制。

3.3 酚類

γ-生育酚的抗炎和抗氧化是由其代謝產(chǎn)物γ-CEHC 介導(dǎo)，尤其在高糖環(huán)境中，γ-CEHC 通過保留NO 生物利用度而改善由高血糖引發(fā)的血管功能障礙[35]。γ-CEHC 是瘀熱/健康組的差異代謝物，其下調(diào)說明瘀熱病機(jī)與機(jī)體NO 的堆積有關(guān)。而NO 利用度降低又會通過氧化應(yīng)激、脂質(zhì)浸潤、炎癥因子及血管改變等參與動脈粥樣硬化[36]。苯乙基間苯二酚能夠?qū)辜?xì)胞的氧化損傷[37]，或許間苯二酚與之具有類似作用。其在ICH 急性期下降，尤在瘀熱組更為顯著，故腦出血初始階段可能面臨廣泛的細(xì)胞損傷，且瘀熱發(fā)病機(jī)制加大該損傷力度。燕麥蒽酰胺E作為食源性代謝物是燕麥中特有的抗氧化酚類化合物[38]，通過降低IL-1 刺激的ICAM-1、VCAM-1、IL-6、IL-8 和MCP-1等黏附分子的分泌來抑制內(nèi)皮細(xì)胞間作用，證明參與抗炎和抗動脈粥樣硬化[39]。結(jié)果中燕麥蒽酰胺E 下調(diào)且表現(xiàn)出較高的AUC 值，說明非瘀熱型的機(jī)體氧化應(yīng)激和腦血管粥樣硬化病變程度相對瘀熱型較為輕緩。

3.4 其他

腦組織幾乎完全靠葡萄糖供能進(jìn)行神經(jīng)活動，血糖供應(yīng)不足會使神經(jīng)功能受損。葡萄糖可經(jīng)過糖酵解、三羧酸循環(huán)或生物氧化過程生成CO2和水，釋放出更多能量。DTDP-4-脫水-6-脫氧-α-D-葡萄糖顯著降低，說明葡萄糖分解增強(qiáng)，瘀熱組耗能更多。腦出血后由于機(jī)體代謝異常會產(chǎn)生多種生物活性物質(zhì)如內(nèi)皮素、NO、組胺、花生四烯酸及毒性產(chǎn)物氧自由基。麥角硫氨酸直接受EGT 2 的調(diào)控參與組氨酸代謝，是一種屬于非酶抗氧化系統(tǒng)的親水性氨基酸，在人體內(nèi)可以對細(xì)胞起到保護(hù)作用[40]。有研究表明，麥角硫氨酸在體外對靠FFA 誘導(dǎo)其脂質(zhì)毒性的C2C12 細(xì)胞具有保護(hù)作用[41]，并發(fā)現(xiàn)麥角硫氨酸降低MAPK 級聯(lián)活性，對IL-6 有抗炎作用。在與健康組的比較中，麥角硫氨酸在瘀熱與非瘀熱組均大幅上調(diào)，尤在瘀熱組表達(dá)更高，再次說明瘀熱往往伴隨更劇烈的氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)。同時，在更重要的神經(jīng)保護(hù)方面，Yang 等人證明麥角硫氨酸對β淀粉樣蛋白誘導(dǎo)的小鼠神經(jīng)元損傷起保護(hù)作用[42]；還能明顯提高D-半乳糖處理的C57BL/6J 小鼠的學(xué)習(xí)記憶能力[43]，顯著降低海馬β-淀粉樣蛋白的積累，并能明顯抑制脂質(zhì)過氧化。甚至，通過Thr 389 磷酸化激活S6K1 和誘導(dǎo)NT5 激活TrkB信號，進(jìn)而促使體外培養(yǎng)的NSCs神經(jīng)元分化[44]。由此看來，麥角硫氨酸顯著上調(diào)，除了抗炎外，更主要的可能是參與急性期腦組織損傷后神經(jīng)細(xì)胞的再生和腦活動的網(wǎng)絡(luò)重建，或許可作為未來神經(jīng)組織再生方面研究的切入點(diǎn)。淫羊藿苷A 屬于植物淫羊藿中的黃酮類組分，淫羊藿苷參與降血壓、減輕脂質(zhì)過氧化及通過血腦屏障發(fā)揮抗神經(jīng)炎癥作用[45][46][47]，可抑制炎性介質(zhì)如TNF-α、IL-1β、COX-2 的mRNA 和蛋白的表達(dá)，從而減輕大腦神經(jīng)炎癥[48]。另淫羊藿苷減少大鼠大腦皮質(zhì)Caspase-3蛋白表達(dá)[49]，提示有助于抑制神經(jīng)細(xì)胞凋亡。但其體內(nèi)來源尚不清楚，在非瘀熱組/瘀熱組中含量的下降反映了與血壓下降、凋亡減少、過氧受限、炎癥減輕等多方面相關(guān)。

3.5 通路分析

氨基?；?tRNA 生物合成的通路變化意味瘀熱病機(jī)下機(jī)體內(nèi)氨基酸合成的改變。生物體內(nèi)的轉(zhuǎn)錄翻譯由tRNA 分子與相應(yīng)氨基酸結(jié)合，并運(yùn)送至核糖體進(jìn)行蛋白質(zhì)合成。氨基酸與tRNA 形成的氨酰-tRNA 鍵，對蛋白質(zhì)合成的轉(zhuǎn)運(yùn)過程起關(guān)鍵作用[50]。若氨基酰基-tRNA 生物合成受阻，則會引起相關(guān)蛋白合成障礙。非瘀熱組/瘀熱組中的代謝通路變化涉及亮氨酸、異亮氨酸、組氨酸、甘氨酸、脯氨酸等多種氨基酸，提示急性ICH 瘀熱病機(jī)可能涉及大范圍蛋白轉(zhuǎn)錄翻譯過程的改變。

4 結(jié)論

國醫(yī)大師周仲瑛教授認(rèn)為，瘀熱阻竅是腦出血急性期的基本病機(jī)病證，是由瘀血和火熱兩種病理因素共同參與，以致瘀熱相搏，沖激上逆，損傷脈絡(luò)，絡(luò)破血溢，腦中蓄血，是導(dǎo)致風(fēng)、火、痰、虛等多種病理因素的基礎(chǔ)，多出現(xiàn)在疾病的危重階段。本研究通過對急性腦出血的瘀熱病機(jī)進(jìn)行血漿代謝組學(xué)分析，發(fā)現(xiàn)瘀熱病機(jī)往往伴隨程度更嚴(yán)重的氧化應(yīng)激、炎癥反應(yīng)、血管硬化、細(xì)胞凋亡。得到的可的松21-乙酸酯、酸甲酯和甘油三酯可作為一組急性腦出血瘀熱病機(jī)的生物標(biāo)志物。這些差異代謝物的發(fā)現(xiàn)不僅為基于瘀熱病機(jī)的腦出血提供了針對治療和有效預(yù)防，也為揭示瘀熱病機(jī)的發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)歸提供了新的依據(jù)。但本研究也有局限性：①血液樣本僅收集于急性期，后期可對恢復(fù)期進(jìn)行分析，從而揭示其生物標(biāo)志物的動態(tài)變化；②單純進(jìn)行了血漿的代謝組學(xué)分析，后期可進(jìn)行腦脊液、血清和腦組織樣本的研究，以更全面準(zhǔn)確揭示ICH瘀熱病機(jī)的分子機(jī)制。