趙麗沙，吳人照，陳 偉，柴可群，董 宇，2＊＊

（1.浙江省中醫(yī)藥研究院中藥研究中心 杭州 310007；2.浙江中醫(yī)藥大學第二臨床醫(yī)學院 杭州 310053）

一 胃癌概述

胃癌（Gastric cancer,GC）是最常見的消化道惡性腫瘤之一，是世界第三大癌癥[1]。在全球范圍內(nèi)，每年新增胃癌病例約95.16 萬例及相關(guān)死亡病例約72.31萬例[2]，對人類健康和社會發(fā)展造成嚴重危害。胃癌是一種進展性疾病，其發(fā)生一般經(jīng)歷五個階段，即慢性淺表性胃炎→慢性萎縮性胃炎→胃癌前病變（萎縮→腸化生→異型增生）→胃癌。由于胃癌早期常無特異性癥狀，多數(shù)患者就診時已至中晚期，導致預后不良。據(jù)統(tǒng)計，晚期胃癌患者的5年生存率不足20%，而早期確診并實施手術(shù)切除的患者，5 年生存率可達90%以上[3]，因此，胃癌的早期診斷并及時干預，對改善胃癌患者預后具有重要意義[4]。目前，胃癌的診斷主要是基于內(nèi)鏡和組織活檢的病理檢查，但這一方式創(chuàng)傷性大、成本高、患者依從率低，很難廣泛應用于早期胃癌的臨床篩查；而常見的胃腸道腫瘤標志物如CEA、CA72-4 和CA19-9 雖已被廣泛應用于胃癌的診斷、篩查和治療監(jiān)測，但在胃癌的早期階段診斷陽性率不足20%，不能滿足胃癌早期篩查的要求；同時，當前胃癌病程判斷及預后的主要依據(jù)依然是病理（包括組織學分型、侵襲性和轉(zhuǎn)移），影像學表現(xiàn)（用于分期），以及其他的臨床特點（年齡和基礎(chǔ)疾病等），傳統(tǒng)的臨床病例特點具有明顯的局限性且胃癌不同階段之間的生物學行為及預后存在較大差異，已不能滿足日益發(fā)展的臨床需求。因此，開發(fā)非侵襲性、靈敏度高、特異性好的胃癌診斷及預后判斷生物標志物具有重要的現(xiàn)實意義。

二 代謝組學介紹

圖1 代謝組學代表性工作流程

代謝組學是繼基因組學和蛋白質(zhì)組學之后新近迅速發(fā)展的一門學科，用于研究生物體系（生物體液、組織、細胞等）由病理或生理刺激所導致的所有代謝產(chǎn)物變化的科學[5，6]。相比于其他組學研究面臨的基因復雜性、轉(zhuǎn)錄后修飾等問題，代謝組學能夠直接、全面反映機體內(nèi)源性代謝信息改變[7-8]，并通過多元統(tǒng)計分析獲得生物體特征代謝標記，是開展疾病預測、診斷、預后判斷和藥物療效評價的先進技術(shù)手段。代謝組學研究常用的分析技術(shù)包括核磁共振（NMR[9]）、液相色譜-質(zhì)譜（LC-MS[10]）、氣相色譜-質(zhì)譜（GC-MS[11]）、毛細管電泳-質(zhì)譜（CE-MS[12]）等。NMR 是尿液和血液代謝組學分析中最常用的分析方法之一，其無損性、無偏性和代謝物識別為分子結(jié)構(gòu)提供了詳細的信息，但其靈敏度偏低，代謝物覆蓋不全；GC-MS 主要針對具有揮發(fā)性的代謝產(chǎn)物，脂肪酸、有機酸和糖等代謝物是其主要檢測對象；而CE-MS 則適合能量代謝研究，能夠同時量化帶電的低分子量化合物；相比之下，LC-MS 可以覆蓋更為廣泛的代謝物，包括揮發(fā)性和非揮發(fā)性化合物，是目前較為主流的代謝組學分析方法。

代謝組學研究一般是多組別，多中心之間的比較研究，樣本量一般要滿足大樣本統(tǒng)計學意義，因此通常會獲得大量的代謝產(chǎn)物原始數(shù)據(jù)，需要運用數(shù)據(jù)分析方法從復雜的數(shù)據(jù)中提取出有價值的信息，篩選出潛在的生物標志物。目前常用的代謝組學數(shù)據(jù)分析方法有單變量分析方法和多變量分析方法。單變量分析方法包括t檢驗、Wilcoxon秩和檢驗和Kruskal-Wallis檢驗等；多變量分析方法包括非監(jiān)督的學習方法，如PCA、非線性映射（NLM）等，以及有監(jiān)督的學習方法，如偏最小二乘判別分析（PLS-DA）、基于正交信號校正的偏最小二乘判別分析（OPLS-DA）、人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)（ANN）、支持向量機（SVM）等。其中，PCA、PLSDA和OPLS-DA是目前代謝組學領(lǐng)域中使用最為普遍的多變量統(tǒng)計分析方法。在實際應用中，通常先對數(shù)據(jù)進行預處理，包括包括歸一化（standardization）、標準化（normalization），即中心化（centering）和尺度化（scaling），以及數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)換（transformation）；接著采用非監(jiān)督模式識別方法對樣本進行初步分類，借助監(jiān)督模式方法建立預測模型，篩選差異代謝物；繼而運用邏輯回歸，將判別分析獲得的差異代謝物進一步通過單因素和多因素邏輯回歸，獲取具有獨立危險因素的差異代謝產(chǎn)物，并通過HMDB、Metlin、MetFrag、MassBank、XCMS online 等進行差異代謝物鑒定，或進一步采用Metaboanalyst 4.0、KEGG、BioCyc 等進行相關(guān)代謝通路分析。代謝組學主要流程見圖1。

目前，代謝組學已廣泛應用于多個研究領(lǐng)域[13-15]。在疾病早期診斷研究中，Lin Sun等[16]建立了基于NMR的血漿代謝組學和分類回歸樹（CART）分析方法的兒科結(jié)核病聯(lián)合診斷模型，L-纈氨酸、丙酮酸和甜菜堿3種標志物的聯(lián)合診斷模型的特異性、靈敏度、曲線下面積分別為94.6%、85.7%、0.984，可用于兒童結(jié)核病的診斷。在疾病的分型及病程進展研究中，Yong Fan等[17]采用代謝組學和生物信息學方法，首次繪制了冠心病及其不同臨床階段（冠脈硬化癥、穩(wěn)定型心絞痛、不穩(wěn)定型心絞痛、心肌梗死）的血漿代謝組學特征譜，并篩選出12 組靈敏度＞85%、專屬性＞85%的代謝標志物群，研究結(jié)果可應用于冠心病的早期診斷及高危人群的預警。在疾病預后判斷研究中，Chen 等[18]基于靶向代謝組學技術(shù)，研究了400 名急性髓性白血?。ˋML）患者和446 名健康對照的不同葡萄糖代謝特征，揭示葡萄糖代謝相關(guān)血清代謝物標志物乳酸、2-氧戊二酸鹽、丙酮酸、2-HG、甘油-3-磷酸、檸檬酸鹽可用于AML 患者的預后判斷。在藥物靶點開發(fā)研究中，Zhang 等[19]在4 個中心的2324 份臨床血漿樣本非靶向代謝組學研究的基礎(chǔ)上，發(fā)現(xiàn)冠心病進展相關(guān)的代謝標志物N-乙酰神經(jīng)氨酸(Neu5Ac)，可作為信號分子激活了Rho-ROCK 通路從而觸發(fā)了RhoA 和Cdc42依賴性心肌損傷，證實沉默神經(jīng)氨酸酶-1可有效緩解心肌缺血損傷，為冠心病藥物研發(fā)提供了新的靶點。在中醫(yī)藥研究領(lǐng)域，Zhang 等[20]使用中醫(yī)方證代謝組學策略，系統(tǒng)地評估生脈散在治療阿爾茨海默病（AD）轉(zhuǎn)基因模型APPswe/PS1dE9（APP/PS1）的療效，從代謝層面闡明生脈散對APP/PS1 小鼠的治療作用，為揭示中醫(yī)藥治療阿爾茨海默病的機制提供了指導。

表1 代謝組學在胃癌研究中的應用文獻檢索結(jié)果

三 代謝組學在胃癌診斷及預后判斷中的應用

在本文中，作者采用6 個關(guān)鍵字“胃癌/胃腫瘤”、“代謝組學”、“診斷”、“預后”、“蛋白質(zhì)組學”、“基因組學”，檢索中國知網(wǎng)（CNKI）、Pubmed 過去10 年代謝組學技術(shù)應用于胃癌研究的文獻，檢索結(jié)果（見表1）。綜述了近10年來代謝組學技術(shù)用于胃癌臨床病人、動物和細胞模型的研究，并重點總結(jié)生物標志物在胃癌癌癥診斷及預后判斷中的應用。此外，對使用的技術(shù)、樣本類型及樣本量、統(tǒng)計分析方法等信息進行了匯總(表2)。

四 多組學聯(lián)用在胃癌診斷及預后判斷中的應用

胃癌發(fā)病機制復雜，代謝組學單個技術(shù)的使用往往不能發(fā)現(xiàn)其全部生物學信息的復雜性，將代謝組學與基因組學、蛋白質(zhì)組學、轉(zhuǎn)錄組學相結(jié)合，并進行聯(lián)合分析[49，50]，對胃癌的發(fā)生發(fā)展進行全面解讀，顯得尤為必要。Liu 等[47]采用代謝組學聯(lián)合診斷，對80 例胃癌患者和82 例健康志愿者進行血清MicroRNA 檢測、GC/MS代謝組學分析以及血清CEA、CA199含量檢測，結(jié)果表明5 個microRNAs 在胃癌患者中有有顯著性差異表達，MiR-19a和miR-92a的組合，曲線下最高面積（AUC）為0.850，靈敏度為91.3%，特異性為61.0%；GC/MS 分析具有良好的診斷價值，AUC 達到1.0；Cao等[48]采用GC-TOF/MS、RT-PCR 聯(lián)用分析方法，發(fā)現(xiàn)miR-379 中的rs61991156 通過作用于PKM2 的3 UTR區(qū)域參與胃癌的發(fā)生；臨床資料分析顯示rs187960998中的A ＞G 與較好的分化，較小的腫瘤體積，無轉(zhuǎn)移相關(guān)；miR-379 中的A ＞G SNP 可降低胃癌細胞的增殖以及PKM2 的啟動子活性和表達；經(jīng)代謝組學分析，miR-379 GG 基因型患者糖酵解明顯低于AG 和AA 基因型。AA 基因型患者PKM2 表達明顯低于G 載體，但miR-379表達無顯著性差異；AA基因型患者的生存率明顯低于G 型攜帶者。Song Y 等[51]研究了長鏈非編碼RNA (lncRNAs)，報道了賴氨酸琥珀?；亩ㄐ院投糠椒?，發(fā)現(xiàn)了一種新的機制，通過其核心酶的賴氨酸琥珀?；?，可以調(diào)控TCA 循環(huán)和戊糖磷酸途徑；然后檢測了賴氨酸琥珀?；鳛槲赴┥飿酥疚锏臐摿?，并成功地開發(fā)了一種琥珀?；蕾囆钥贵w，用于Caldesmon的K569位點；最后，研究了賴氨酸琥珀酰組與lncRNA 之間的關(guān)系，確定了兩個lncRNA 和一個琥珀?；稽c之間的潛在交叉位點。這些結(jié)果拓展了我們對腫瘤發(fā)生機制的認識，為胃癌的診斷和預后提供了新的思路和方法。

表2 代謝組學在胃癌診斷及預后判斷中的應用

續(xù)表2

續(xù)表2

五 討論

胃癌的發(fā)生、發(fā)展是一個漸進的過程，通過代謝產(chǎn)物譜的研究，在這個過程中已經(jīng)發(fā)現(xiàn)許多代謝產(chǎn)物的異常表達。本文對近10 年胃癌代謝組學相關(guān)文獻進行整理，發(fā)現(xiàn)氨基酸、脂肪酸、磷脂酰膽堿、肉堿等生物標志物對胃癌的早期診斷可能具有重要意義，其中支鏈氨基酸(亮氨酸，異亮氨酸，纈氨酸)，谷氨酰胺、精氨酸、鳥氨酸、組氨酸、色氨酸、苯乙酰谷氨酸等在胃癌早期預測中有重要意義。但由于代謝組學本身的復雜性，目前仍處于不斷發(fā)展和逐步完善的階段，代謝組學在胃癌診斷標志物研究中仍存在一些需要注意的問題。首先，因為代謝物的變化性和不穩(wěn)定性，代謝組學對樣本的數(shù)量和質(zhì)量要求較高，因此樣本數(shù)量的增大、腫瘤患者樣本采樣標準的統(tǒng)一顯得尤為重要；其次代謝組學數(shù)據(jù)復雜多樣，因此應用化學計量學與計算機生物學的融合、構(gòu)建全數(shù)據(jù)代謝網(wǎng)絡(luò)和代謝組動態(tài)校正定量數(shù)學建模是代謝組學工作者需要進一步完成的課題；另外，尋找代謝物中獨特的生物標志物是研究熱點，但尋找標志物并不是代謝組學研究的終極目標，深入挖掘其作用機理，解釋生物標志物與疾病發(fā)生發(fā)展之間存在的聯(lián)系通路是研究熱點，也是難點。代謝組學雖然已經(jīng)能在一定程度上進行生物學解釋，但在檢測過程中很容易受到背景干擾，有時無法完整解釋生物學過程，因此需要多組學方法的綜合運用[52]，以獲得更全面的結(jié)果，同時，代謝組學的發(fā)展應以臨床為導向，結(jié)合臨床實驗和動物實驗結(jié)果，聯(lián)系患者疾病表型與機體內(nèi)在實質(zhì)變化，縮短基礎(chǔ)研究與臨床治療的轉(zhuǎn)化進程，發(fā)現(xiàn)具有臨床價值的腫瘤標志物[53]。未來，隨著代謝組學、基因組學和蛋白質(zhì)組學等新興技術(shù)的發(fā)展和完善，有望篩選出敏感性高、特異性強的胃癌診斷標志物或聯(lián)合多種標志物用于胃癌的診斷與預后判斷。