張 潔，孫慧娟，嚴(yán)小軍，劉紅寧，胡星遙，盧曉南，張啟云，尚廣彬

（江西中醫(yī)藥大學(xué)/中醫(yī)基礎(chǔ)理論分化發(fā)展研究中心 南昌 330004）

隨著社會和經(jīng)濟(jì)的發(fā)展，人類的飲食結(jié)構(gòu)發(fā)生巨大的改變，朝著快速、營養(yǎng)、美味、多元化等方向發(fā)展?，F(xiàn)代的高脂、高糖的飲食習(xí)慣導(dǎo)致營養(yǎng)性肥胖日益增多[1]。據(jù)研究統(tǒng)計發(fā)現(xiàn)，我國肥胖人數(shù)高達(dá)9 000 萬，超重人數(shù)超過兩億[2，3]。肥胖癥是一種由多因素引起的慢性代謝性疾病，其中營養(yǎng)過剩造成的營養(yǎng)性肥胖占多數(shù)[4]，它是高脂血癥、心腦血管疾病、2 型糖尿病、高血壓、高尿酸血癥、關(guān)節(jié)炎、癌癥、骨端軟骨癥等慢性病的重要誘導(dǎo)因素，肥胖癥的存在增加了患病風(fēng)險，危害著人類健康[5-7]。

中醫(yī)認(rèn)為營養(yǎng)性肥胖是由于人們喜食肥甘厚膩之品、恣食生冷、內(nèi)傷脾胃、脾失健運(yùn)、濕濁生于內(nèi)、痰濕積聚過多而形成的。肥胖的主要病理因素是“內(nèi)濕”，治宜芳香化濕。

藿香是臨床上常用的芳香化濕藥，其味辛，溫，歸脾、胃、肺經(jīng)，化濕醒脾，辟穢和中，解暑?！侗静菡x》中記載“藿香，清芬微溫，善理中州濕濁痰涎，為醒脾快胃，振動清陽妙品”?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究表明：藿香及其揮發(fā)油可以增加胃酸的分泌，調(diào)節(jié)胃腸道功能[8，9]；有調(diào)節(jié)免疫的作用[10]；有抗菌抗炎、鎮(zhèn)痛作用[11]；有止咳、化痰的作用[12]。但對藿香的芳香化濁、化痰降脂的作用研究較少。

表1 梯度洗脫條件

代謝組學(xué)檢測方法是通過在生物系統(tǒng)受到干預(yù)后測量體液中代謝產(chǎn)物的變化，可以識別和反映在疾病和藥物影響下代謝網(wǎng)絡(luò)的變化。它是從整體“生化表型”中掌握生物體的功能狀態(tài)，并且與中醫(yī)的“整體概念”本質(zhì)上相容[13，14]。本研究運(yùn)用代謝組學(xué)的方法研究芳香化濕藥藿香干預(yù)的由飲食肥甘厚膩之品導(dǎo)致濕濁內(nèi)生、痰濕積聚形成的營養(yǎng)性肥胖的降脂作用，從系統(tǒng)的角度分析藿香干預(yù)營養(yǎng)性肥胖大鼠的內(nèi)源性物質(zhì)代謝的變化并分析其代謝途徑，應(yīng)用現(xiàn)代科學(xué)語言闡述“內(nèi)濕”的表征，對內(nèi)濕證進(jìn)行初步探索，為臨床營養(yǎng)性肥胖防治提供實驗依據(jù)，為內(nèi)濕證提供理論支撐。

1 材料與方法

1.1 實驗藥物

藿香（江中中藥飲片有限公司，批號：160317）。藥物鑒定由本校中藥鑒定教研室按2015版《中華人民共和國藥典》標(biāo)準(zhǔn)鑒定，取藿香飲片500 g，加入5 L 的水，浸泡2 h，連接揮發(fā)油提取裝置，大火煮沸后轉(zhuǎn)小火煮15min，煮2 次，合并藥汁，濃縮為1 g·mL-1，接取揮發(fā)油4℃保存。

1.2 實驗動物

SPF 級雄性SD 大鼠，體質(zhì)量120 ±10 g（湖南斯萊克景達(dá)實驗動物有限公司，許可證號:SCXK(湘)2016-0002）。

1.3 實驗材料

高脂飼料購自美國Research Diets 公司（貨號：D12492），膽固醇（CHOL）、甘油三酯（TG）、高密度脂蛋白（HDL-C）、低密度脂蛋白（LDL-C）、葡萄糖（GLU）試劑盒購自南昌百特生物公司（批號:160201），甲醇（德國默克公司，貨號：67-56-9），乙腈(德國默克公司，貨號：JA031331)。

1.4 主要儀器設(shè)備

安捷倫高效液相質(zhì)譜（美國Agilent，6538），全自動生化分析儀(美國Beckmancoulter，AU480)，臺式離心機(jī)(美國thermo，LYNX-6000)，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（瑞士BUCHI，RE-220 SE）。

1.5 方法

1.5.1 建立模型、分組及給藥

30 只雄性SD 大鼠，按體重隨機(jī)分為正常組10 只喂以普通飼料、造模組20 只喂以高脂飼料，動態(tài)檢測大鼠體重和Lee's 指數(shù)，Lee's 指數(shù)是目前在評價成年大鼠肥胖程度方面的有效指數(shù)計算，公式為LEE'S INDEX=3√（體重x1000）/體長。造模4 周后，檢測大鼠生化指標(biāo)。根據(jù)大鼠體重、Lee's指數(shù)和TG 含量，建立營養(yǎng)性肥胖大鼠模型[15，16]，造模成功后，以造模組大鼠血清中TG 含量和體重為參考指標(biāo)，將造模組隨機(jī)平均分為模型組和藿香給藥組。藿香干預(yù)4 周，用移液槍將藿香揮發(fā)油混懸液均勻加入每次灌胃劑量藥汁中搖晃均勻，藥物劑量為每天3 g.kg-1（根據(jù)體表面積方法換算大鼠劑量），加熱至37℃進(jìn)行灌胃。正常組、模型組喂每天3 g.kg-1的生理鹽水。給藥4周后檢測大鼠血清中TG、CHOL、HDL-C、LDL-C、GLU含量。

1.5.2 血清代謝組學(xué)檢測

取樣品50 μL于1.5 mL離心管中，加甲醇150 μL，渦旋1 min，4℃靜置3 h，4℃離心10 min?15 000 rpm-1，取上清，氮吹，加入15%甲醇溶液100 μL 復(fù)溶，渦旋1 min，4℃離心15min?18 000 rpm-1，取上清液檢測分析。

色譜采集:色譜柱為Poroshell 120EC-C18柱；柱溫35℃，樣品室溫4℃，流速0.4 mL?min-1，進(jìn)樣量5 μL；流動相0.1% 甲酸水溶液(A)-乙腈(B)，洗脫條件見表1。

質(zhì)譜條件：離子源：雙電噴霧離子源（Dual ESI），正離子掃描；毛細(xì)管電壓：4000 V；毛細(xì)管出口電壓：120 V；錐孔電壓：65 V；掃描范圍：100-1000 m/z；干燥氣溫度：350℃；干燥氣流速：10 L?min-1。

實驗樣品采用UPLC-Q-TOF MS 檢測分析，運(yùn)用MPP 軟件對總離子流圖分析找出精確的分子量、保留時間和峰面積。通過主成分分析法查找差異化合物。

代謝途徑分析：利用MetaboAnalyst 軟件（https://www.metaboanalyst.ca）和KEGG 數(shù)據(jù)庫（https://www.kegg.jp）對化合物進(jìn)行Pathway 分析，找出有統(tǒng)計學(xué)差異的代謝通路。

1.5.3 統(tǒng)計學(xué)方法

采用方差分析法，P＜0.05 有統(tǒng)計學(xué)意義；應(yīng)用GraphPad Prism8.0 軟件對實驗數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，計數(shù)資料用（±SD）表示。

表2 各組動物體重動態(tài)變化（±s，正常組n=10，造模組n=20）

表2 各組動物體重動態(tài)變化（±s，正常組n=10，造模組n=20）

圖1 造模4周大鼠的Lee's指數(shù)的變化（正常組n=10，造模組n=20）

2 結(jié)果

2.1 建立營養(yǎng)性肥胖大鼠模型

正常組、造模組大鼠的體重和Lee's指數(shù)動態(tài)變化（表2、圖1），結(jié)果顯示：造模1 周后，造模組的大鼠體重明顯高于正常組（P＜0.01）；造模2 周后Lee's 也顯著高于正常組（P＜0.01）。造模第4周，造模組的大鼠體重、Lee's 指數(shù)，血清TG、GHOL、HDL-C、LDL-C、GLU 的含量與正常組相比具有顯著性差異（P＜0.01），見圖2，模型建立成功。

2.2 藿香對大鼠生理生化指標(biāo)的影響

藿香給藥組藥物干預(yù)4 周，實驗結(jié)果顯示：體重、Lee's 及血清中CHOL、HDL-C、LDL-C 和GLU 無明顯改變（P＞0.05），但血清中TG 含量明顯下降（P＜0.01）（圖3）。

2.3 藿香干預(yù)營養(yǎng)性肥胖大鼠的代謝組學(xué)研究結(jié)果

2.3.1 血清代謝物譜的UHPLC-Q-TOF-MS分析

圖2 造模4周正常組與模型組相比血清中TG、GHOL、HDL-C、LDL-C的含量變化（正常組n=10，造模組n=20）

圖3 藿香對營養(yǎng)性肥胖大鼠血清中TG、CHOL、HDL-C、LDL-C、GLU

正離子掃描模式下，對比各組總離子流圖發(fā)現(xiàn)：3組色譜峰保留時間基本相同，峰的高度具有顯著性差異，大鼠血清中代謝模式發(fā)生了顯著性的變化；與正常組相比，模型組的相同時段峰的高度多處高于正常組，在11-17.5 s 之間最為明顯；藿香給藥組與模型組相比，在11.2 -13.9 s 時間段峰的高度降低最為顯著，顯示各組間代謝物質(zhì)發(fā)生了顯著性的改變。各組大鼠血清總離子流圖譜見圖4。

2.3.2 PCA聚類分析

主成分分析法（Principal Component Analysis，PCA），將多個變量通過線性變換以選出較少個數(shù)重要變量的一種多元統(tǒng)計分析方法。將復(fù)雜數(shù)據(jù)降維，揭示隱藏在復(fù)雜數(shù)據(jù)背后的簡單結(jié)構(gòu)[17]，通過PCA 分析發(fā)現(xiàn)：各組自聚成一類，區(qū)分明顯，說明造模及給藥之后，大鼠血清中內(nèi)源性代謝產(chǎn)物發(fā)生了顯著變化（圖5）。

圖4 各組動物血清UHPLC-Q-TOF正模式掃描總離子流圖

圖5 各組動物血清代謝數(shù)據(jù)分析的PCA得分圖（n=10）

2.3.3 潛在生物標(biāo)記物的分析

對各組大鼠的血清中代謝物檢測所得的總離子流圖進(jìn)行分析查找差異性化合物，結(jié)果顯示：藿香干預(yù)4 周后，營養(yǎng)性肥胖大鼠血清中查找出10 種3 組共有的內(nèi)源性差異化合物（表3）。

2.3.4 代謝通路分析

分析差異化合物，匹配出11 條代謝途徑，如圖6所示：圖中圓圈代表發(fā)揮作用的通路，顏色越深則P值越小。根據(jù)P＜0.05 篩選出4 條有統(tǒng)計學(xué)差異的代謝途徑，分別是：氨?；?tRNA 生物合成、苯丙氨酸，酪氨酸和色氨酸生物合成、鞘脂代謝、酪氨酸代謝（表4）。

3 討論

高脂誘導(dǎo)的營養(yǎng)性肥胖大鼠模型的病理機(jī)制與臨床上“濕阻中焦、脾失健運(yùn)”營養(yǎng)性肥胖相似，治宜芳香化濕，醒脾健運(yùn)。藿香是芳香化濕類常用藥，具有化濕醒脾，辟穢和中，解暑，發(fā)表之功，既往的藥理學(xué)研究多集中在其抑菌、增強(qiáng)胃腸動力方面。本研究結(jié)果表明藿香干預(yù)營養(yǎng)性肥胖大鼠能夠降低血清中TG 含量（P＜0.01），改善了營養(yǎng)性肥胖大鼠的體內(nèi)脂質(zhì)代謝。通過血清代謝組學(xué)進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)藿香干預(yù)營養(yǎng)性肥胖大鼠4 周后，查找出10 種內(nèi)源性潛在生物標(biāo)記物，分別是：神經(jīng)酰胺、植物鞘氨醇、胞嘧啶、吲哚丙烯酸、泛酸、蛋氨酸、色氨酸、酪胺、酪氨酸、尿素等。對代謝通路分析發(fā)現(xiàn)，這10種差異化合物主要通過苯丙氨酸，酪氨酸和色氨酸生物合成、氨?；?tRNA生物合成、酪氨酸代謝、鞘脂代謝4種代謝途徑發(fā)揮降脂作用，通路關(guān)系見圖7。

表3 藿香干預(yù)營養(yǎng)性肥胖大鼠4周血清中的內(nèi)源性差異化合物

苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸生物屬于芳香族氨基酸，是人體必需氨基酸與營養(yǎng)性肥胖關(guān)系密切。在體內(nèi)經(jīng)苯丙氨酸羥化酶催化作用氧化成酪氨酸，并合成神經(jīng)遞質(zhì)和激素，干預(yù)機(jī)體的糖脂代謝[18]。酪氨酸是一種重要的營養(yǎng)必需氨基酸，Akinkunmi Paul Okekunle等研究表明酪氨酸與肥胖風(fēng)險呈負(fù)相關(guān)[19]。

酪氨酸在酪氨酸轉(zhuǎn)氨酶的催化下，生成對-羥苯丙酮酸，經(jīng)尿黑酸等中間產(chǎn)物轉(zhuǎn)變成延胡素酸和乙酰乙酸參與糖脂代謝[20]。S Bel-Serrat 等研究發(fā)現(xiàn)色氨酸、酪氨酸的攝入量與TC/HDL-c 比率之間呈負(fù)相關(guān)[21]。色氨酸的代謝產(chǎn)物5-羥色胺能夠調(diào)節(jié)下丘腦中樞，減少了動物的進(jìn)食量，減少能量的攝入，減少脂肪堆積[22，23]。

神經(jīng)酰胺在營養(yǎng)性肥胖形成過程中起到了至關(guān)重要的作用。神經(jīng)酰胺能夠介導(dǎo)的胰腺β細(xì)胞的凋亡并抑制β細(xì)胞分泌胰島素，加重肥胖[24]。減少神經(jīng)酰胺的合成，能夠干預(yù)脂代謝減少脂肪堆積[25]。

圖6 通過Metabo Analyst數(shù)據(jù)庫得到的通路分析概要圖

綜上所述，芳香化濕藥藿香干預(yù)營養(yǎng)性肥胖大鼠具有明顯降低血清TG 含量的作用，其作用機(jī)制可能是通過干預(yù)蛋白質(zhì)與氨基酸的合成代謝、脂質(zhì)代謝等代謝途徑發(fā)揮“化濕”降脂作用，從而干預(yù)營養(yǎng)性肥胖的發(fā)生、發(fā)展。本實驗研究表明機(jī)體內(nèi)的血清TG 含量是中醫(yī)“內(nèi)濕”的表征之一，芳香化濕藥藿香可能通過調(diào)節(jié)能量代謝、脂代謝發(fā)揮“化濕”作用。

表4 MetaboAnalyst通路分析結(jié)果

圖7 鞘脂代謝、苯丙氨酸，酪氨酸和色氨酸生物合成、酪氨酸代謝通路關(guān)系圖