王仲霞，桑秀秀，余思邈，許文濤，蘇鵬宇，牛 明，王睿林

（解放軍總醫(yī)院第五醫(yī)學(xué)中心/中西醫(yī)結(jié)合診療與研究中心 北京 100039）

對(duì)呼吸“氣味”的辨識(shí)作為一種關(guān)鍵的疾病診斷方法—“聞診”，已在中醫(yī)診療中應(yīng)用了一千多年，同時(shí)西方學(xué)者如希波克拉底對(duì)此也有類似的認(rèn)知[1]。現(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，某些病患的典型氣味可能與其呼吸中特定的揮發(fā)性有機(jī)化合物（VOC）有關(guān)，例如糖尿病患者散發(fā)的腐爛蘋(píng)果的氣味被確認(rèn)為丙酮，腎衰竭患者的魚(yú)味由氨過(guò)量所引起的[2，3]。近代呼出氣分析開(kāi)始于1970年代，Pauling等利用氣相色譜技術(shù)分離檢測(cè)到呼出氣中約200 種揮發(fā)性有機(jī)化合物（VOCs）[4]。隨著分析技術(shù)的不斷進(jìn)步，呼出氣中更多的VOCs 被進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)和確認(rèn)[5]。目前用于呼出氣分析的技術(shù)包括：氣相色譜（gas chromatography,GC），氣相色譜-質(zhì)譜（gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS），離子遷移譜（ion mobility spectroscopy，IMS），選擇性離子流管質(zhì)譜（selected-ion flow-tube mass spectrometry,SIFT-MS），在線揮發(fā)性有機(jī)化合物監(jiān)測(cè)檢測(cè)分析質(zhì)譜儀（proton transfer reaction mass spectrometry,PTRMS），傳感器和激光光譜等[6]。其中GC-MS 是目前尋找呼出氣生物標(biāo)志物最基本的方法之一[7]。隨著分析技術(shù)的進(jìn)步，越來(lái)越多的呼出氣化合物被發(fā)現(xiàn)可作為潛在的疾病特異性生物標(biāo)志物，目前這一方法已逐步應(yīng)用于腫瘤早期診斷的探索性研究，成為國(guó)際研究的熱點(diǎn)[8-10]。比如氧化應(yīng)激增加產(chǎn)生的烷烴和甲基烷烴是乳腺癌婦女的潛在生物標(biāo)志物，2-丁烷酮和1-丙醇被認(rèn)為是最有前景的肺癌檢測(cè)呼吸生物標(biāo)志物[11-12]。英國(guó)一項(xiàng)最新研究表明，帕金森病臨床癥狀出現(xiàn)之前能夠聞到相應(yīng)氣味，并由此研發(fā)了基于VOC 的帕金森病無(wú)創(chuàng)呼出氣診斷測(cè)試方法，該測(cè)試可以識(shí)別該病早期階段的患者[13]。上述這些研究表明，無(wú)創(chuàng)呼出氣檢測(cè)可以為臨床實(shí)踐和診斷提供有價(jià)值的信息。

乙型肝炎病毒（hepatitis B virus，HBV）感染是當(dāng)今世界重要的公共衛(wèi)生問(wèn)題，乙肝患者高達(dá)2.57 億人，每年約有78.6 萬(wàn)人死于HBV 相關(guān)疾病[14]。尤其慢性HBV 感染可導(dǎo)致肝硬化、肝衰竭或肝細(xì)胞癌，而肝硬化進(jìn)展為肝衰竭和肝癌是導(dǎo)致HBV 感染患者死亡的重要原因之一[15-17]。肝臭是嚴(yán)重肝病的一個(gè)典型臨床癥狀，且與疾病的進(jìn)展密切相關(guān)，如肝衰竭[18]。肝衰竭是多種因素引起的肝臟合成、解毒、排泄和生物轉(zhuǎn)化等功能發(fā)生嚴(yán)重障礙或失代償，臨床可出現(xiàn)肝臭、出血、肝性腦病等癥候[19]。其中“肝臭”的形成，是因?yàn)楦闻K不能將含硫氨基酸等代謝的中間產(chǎn)物清除而進(jìn)入血液中，通過(guò)肺部呼出體外，就會(huì)產(chǎn)生特殊的氣味。目前已發(fā)現(xiàn)肝臭與肝病的嚴(yán)重程度存在關(guān)聯(lián)[20]。

中醫(yī)根據(jù)望、聞、問(wèn)、切四診收集的診察資料對(duì)肝衰竭進(jìn)行辨證論治，提高了肝衰竭的治療效果。在肝病中醫(yī)診療過(guò)程中，“肝臭”是中醫(yī)嗅診的必須診察要素，對(duì)其進(jìn)行中醫(yī)嗅診辨證，有利于病位、病性的判斷，是肝病中醫(yī)辨證論治不可或缺的組成部分。而已有報(bào)道也證實(shí)，呼吸氣中VOCs 的濃度也與某些肝?。ㄈ缇凭愿窝譡21，22]）的嚴(yán)重程度有關(guān)。由此可見(jiàn)，檢測(cè)患者呼出氣的VOCs 對(duì)于了解肝?。ㄓ绕涫菄?yán)重肝病）的進(jìn)程具有較好的應(yīng)用前景。因此，本研究采用GC×GC-TOF-MS技術(shù)對(duì)呼出氣冷凝液進(jìn)行分析，通過(guò)測(cè)定呼出氣中明顯與特定疾病相關(guān)的揮發(fā)物，鑒別呼出氣VOC 在HBV 相關(guān)失代償期肝硬化和慢性肝衰竭中的差異，展示中醫(yī)肝病嗅診辨證的客觀內(nèi)涵，為無(wú)創(chuàng)技術(shù)評(píng)估、預(yù)測(cè)慢性嚴(yán)重肝病的進(jìn)展及預(yù)后，進(jìn)而進(jìn)行中西醫(yī)結(jié)合早期干預(yù)治療，提供了理論支持和物質(zhì)基礎(chǔ)。

1 研究對(duì)象和方法

1.1 研究對(duì)象和臨床數(shù)據(jù)

研究方案經(jīng)解放軍總醫(yī)院第五醫(yī)學(xué)中心（原解放軍302醫(yī)院）倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，并在中國(guó)臨床試驗(yàn)注冊(cè)處注冊(cè)，注冊(cè)號(hào)為CHICTR-ROC-17010345。

2017年4月至2017年10月，解放軍總醫(yī)院第五醫(yī)學(xué)中心（原解放軍302 醫(yī)院）招募了18 至80 歲的健康對(duì)照14 人（C 組），以及乙型肝炎失代償性肝硬化患者18 人（HLC 組）、乙型肝炎所致慢性肝衰竭患者13 人（HLF 組），診斷依據(jù)為《慢性乙型肝炎防治指南》（2015更新版）[23]及肝衰竭診治指南（2012年版）[24]。排除其他慢性肝病患者，如原發(fā)性肝癌、自身免疫性肝病、丙型肝炎病毒合并感染以及其他嚴(yán)重并發(fā)疾?。ㄈ缧锞?、未控制的糖尿病或癌癥），或不愿簽署知情同意的患者。在收集呼出的空氣之前，進(jìn)行了實(shí)驗(yàn)室檢驗(yàn)，并記錄總膽紅素（TBIL）、丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶（ALT）、天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶（AST）等臨床資料。

1.2 呼出氣冷凝液樣品采集與分析

要求所有受試者禁食至少2 h，并8 h 內(nèi)未使用任何藥物，且采樣前2 h 內(nèi)不刷牙，24 h 不要飲酒、吸煙。在采集呼出氣冷凝液（exhaled breath condensate,EBC）樣本之前，用純凈水漱口2次。

在帶有冷卻套的RTube 呼氣冷凝液收集器（美國(guó)Respiratory Research,Inc.,RRI）中收集EBC 樣品，然后冷凍在-20°C 實(shí)驗(yàn)室冷凍室中。受試者被要求至少呼吸2 min正常呼吸，為測(cè)試提供足夠的液體量。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

使用安捷倫7890 氣相色譜系統(tǒng)（安捷倫技術(shù)公司，美國(guó)加利福尼亞州圣克拉拉市），在DB-5ms 柱（30 m×250 μm×0.25 μm,USA）上分離所收集樣品中的所有檢測(cè)分析物。培養(yǎng)時(shí)間和溫度分別為15 min及50°C。攪拌器轉(zhuǎn)速為500 rpm，萃取時(shí)攪拌器轉(zhuǎn)速為100 rpm。樣品提取時(shí)間為30 min，解吸時(shí)間為10 min，以氦氣為載氣，前入口吹掃流速為3 ml·min-1。通過(guò)柱的氣體流速為1 ml·min-1。初始溫度保持在50°C 下1 min，然后以4°C·min-1的速率增加到150°C，隨后以8°C·min-1的速率增加到210°C，并在210°C 下保持5.5 min。注射、傳輸線和離子源溫度分別為240、280 和220°C。在電子碰撞模式下，能量為70 eV。在溶劑延遲0.3 min 后，以每秒50 個(gè)光譜的速率以33-500 m/z 范圍的全掃描模式獲取質(zhì)譜數(shù)據(jù)。將所有樣品各取10 μl進(jìn)行混合作為QC 樣品，且每檢測(cè)10個(gè)樣品，增加一個(gè)QC樣本檢測(cè)。

表1 HLC和HLF兩組患者的臨床及生物學(xué)特征

1.4 質(zhì)譜數(shù)據(jù)分析

使用ChromaTOF 軟件（V 4.3x,LECO）對(duì)質(zhì)譜數(shù)據(jù)進(jìn)行了峰提取、基線矯正、解卷積、峰積分、峰對(duì)齊等分析，最后將QC 樣本中檢出率50%以下或RSD ＞30% 的峰去除。采用代謝組學(xué)分析在線工具M(jìn)etaboanlyst 對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，篩選變化倍數(shù)（fold change,FC）＞2，P＜0.05 的差異化合物。采用Simca 13.0對(duì)歸一化的數(shù)據(jù)進(jìn)行PCA和OPLS-DA分析，并根據(jù)OPLS-DA 分析中VIP value ＞1，|p(corr)≥0.5對(duì)上述差異化合物進(jìn)行篩選，篩選結(jié)果作為潛在生物標(biāo)記物，并通過(guò)與NIST數(shù)據(jù)庫(kù)中的已知化合物譜圖進(jìn)行比對(duì)鑒定。

1.5 統(tǒng)計(jì)方法

使用IBM SPSS statistics 21.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析和ROC 曲線分析。計(jì)量資料以中位數(shù)±四分位間距表示。定性資料和分類參數(shù)分析采用Fisher's 檢驗(yàn)或Mann-Whitney 檢驗(yàn)。P＜0.05 差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P＜0.01時(shí)差異有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 臨床特征

本研究共招募了45 名受試者，包括14 名健康受試者、18名失代償性肝硬化（HLC組）和13名慢性肝衰竭（HLF 組）患者。統(tǒng)計(jì)了HLC、HLF 兩組患者的臨床特征包括血清總蛋白（TP）、白蛋白（ALB）、TBIL、直接膽紅素（DBIL）、ALT、AST、γ-谷氨酰轉(zhuǎn)移酶（γ-GGT）、膽堿酯酶（CHE）、堿性磷酸酶（ALP）、乳酸脫氫酶（LDH）、尿素氮（BUN）、凝血酶原時(shí)間（PT）、凝血酶原時(shí)間活性（PTA）、國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)化比率（INR）、纖維蛋白原（FIB）、總膽固醇（TC）、高密度脂蛋白膽固醇（HDLC）、低密度脂蛋白（LDL-C）和甲胎蛋白（AFP）。患者信息和臨床數(shù)據(jù)見(jiàn)表1。結(jié)果顯示為中位數(shù)±四分位間距。

2.2 呼出揮發(fā)性有機(jī)化合物的多變量分析及差異

針對(duì)45 例受試者的呼出氣冷凝物進(jìn)行GC×GCTOF-MS 檢測(cè)，根據(jù)譜庫(kù)比對(duì)結(jié)果共鑒定出668 種化合物，化合物經(jīng)峰提取、歸一化等預(yù)處理后，采用simca13.0進(jìn)行多元統(tǒng)計(jì)分析。PCA分析結(jié)果如圖1所示，質(zhì)控組（QC）樣本聚集度較好，表明檢測(cè)方法較為穩(wěn)定；C、HLC 和HLF 三組具有一定的區(qū)分能力，表明組間存在明顯的代謝差異。圖2聚類分析圖也驗(yàn)證了C、HLC 和HLF 三組間的代謝差異。為了進(jìn)一步篩選與HLC 進(jìn)展到HLF 相關(guān)的差異代謝標(biāo)志物，采用OPLS-DA 對(duì)HLC 與HLF 組間差異代謝物進(jìn)行分析。圖3A 的HLC 與HLF 組間OPLS-DA 分析得分圖，以及圖3B 的HLC 與HLF 組間OPLS-DA 分析S-plot 圖，均表明差異代謝標(biāo)志物可很好的區(qū)分兩組患者。我們篩選VIP value ＞1，|p(corr)|≥0.5、P＜0.05 的化合物作為特異性代謝標(biāo)志物，結(jié)果如表2所示。

圖1 C、HLC、HLF和QC組的PCA評(píng)分圖

圖2 C、HLC、HLF和QC組的聚類分析圖

圖3 基于OPLS-DA分析的HLC與HLF組間差異VOCs篩選

表2 HLC與HLF組的差異代謝產(chǎn)物

2.3 ROC分析

將HLC 和HLF 組代謝產(chǎn)物進(jìn)行比較，以探索可能作為HBV 所致失代償期肝硬化進(jìn)展為慢性肝衰竭的風(fēng)險(xiǎn)預(yù)測(cè)因子的化合物。對(duì)5 種化合物（P＜0.01）的進(jìn)一步分析顯示（圖4）：當(dāng)十二烷醇（1-Dodecanol）≥0.321 可鑒別CLF，AUC 為0.825（95%置信區(qū)間0.675-0.975），特異性99.23%，敏感性77.8%。1-1-甲基乙氧基-2-丙酮（1-1-methylethoxy-2-propanone））≥0.597預(yù)測(cè)CLF 的AUC 為0.821（95%置信區(qū)間0.6663-0.978），特異性84.6%，敏感性77.8%。二氧化碳（carbon dioxide）、1-1-環(huán)己烯-1-基乙酮（1-1-cyclohexen-1-yl-ethanone）和鄰環(huán)己烯（o-cymene）的AUC 分別為0.85、0.838 和0.833，靈敏度分別為83.3%、72.2%和77.8%，特異性分別為84.6%、76.9%和84.6%。十二烷醇的ROC 曲線表明（圖5），HLC 組和HLF 組樣品分離良好，十二烷醇的預(yù)測(cè)能力最強(qiáng)。

圖4 區(qū)分HLC和HLF的不同揮發(fā)性有機(jī)化合物的柱狀圖

表3 區(qū)分HLC和HLF的不同揮發(fā)性有機(jī)化合物AUC

3 討論

圖5 1-dodecanol、1-1-methylethoxy-2-propanone、carbon dioxide、1-1-cyclohexen-1-yl-ethanone和o-cymene的ROC曲線圖。

“聞診”是中醫(yī)臨床疾病診斷的重要途徑之一，肝臭中醫(yī)嗅診辨證是依據(jù)機(jī)體臟腑、氣血、津液受病，會(huì)導(dǎo)致氣味異常改變，而氣味的改變與人體內(nèi)臟腑生理病理狀態(tài)存在對(duì)應(yīng)關(guān)系?！峨y經(jīng)》中明確記載了依據(jù)嗅診進(jìn)行辨證，如“五臟各有聲色臭味，當(dāng)與寸口尺內(nèi)相應(yīng)，其不相應(yīng)者病也。”（《難經(jīng)?十三難》）；肝“其臭臊”，心“其臭焦”，脾“其臭香”，肺“其臭腥”，腎“其臭腐?！保ā峨y經(jīng)?三十四難》）；“何以知傷暑得之?然，當(dāng)惡臭。何以言之?心主臭，自入為焦臭，入脾為香臭，入肝為臊臭，入腎為腐臭，入肺為腥臭，故知心病傷暑得之，當(dāng)惡臭?！保ā峨y經(jīng)?四十九難》），據(jù)此可進(jìn)行中醫(yī)嗅診來(lái)判別病位、病性。目前在肝病中醫(yī)臨床辨證過(guò)程中，對(duì)氣味“臊”、“焦”、“香”、“腥”、“腐”的診察判斷過(guò)程主觀性強(qiáng)，難以客觀量化。常根據(jù)“氣味酸腐臭穢或氣味不重、微有腥臭”判定“實(shí)熱”或“虛寒”，未明確與中醫(yī)辨證分型進(jìn)行對(duì)應(yīng)，難以體現(xiàn)肝臭中醫(yī)嗅診對(duì)辨證論治的貢獻(xiàn)度，也未將其與預(yù)后判定、療效評(píng)估關(guān)聯(lián)起來(lái)?，F(xiàn)有的《病毒性肝炎中醫(yī)辨證標(biāo)準(zhǔn)（試行）》明確了辨證標(biāo)準(zhǔn)，但未納入“肝臭”中醫(yī)嗅診辨證的內(nèi)容，限制了肝臭中醫(yī)嗅診辨證的臨床應(yīng)用?，F(xiàn)代研究也證實(shí)，人體呼出氣中的揮發(fā)性化合物（VOCs）常可反應(yīng)人體生理過(guò)程和新陳代謝的變化，并可作為疾病非侵入性檢測(cè)的生物標(biāo)志物[25，26]。慢性肝衰竭是臨床病死率較高的一種肝病，在我國(guó)由乙型肝炎病毒長(zhǎng)期感染導(dǎo)致失代償期肝硬化是該病發(fā)生的主要原因之一，且患者常伴有一定的肝臭，因此，通過(guò)檢測(cè)呼出氣反映肝臭的發(fā)生，具有良好的物質(zhì)發(fā)現(xiàn)潛力，將其與中醫(yī)嗅診理論相結(jié)合，能夠闡釋肝臭中醫(yī)嗅診的科學(xué)內(nèi)涵，實(shí)現(xiàn)肝衰竭肝臭中醫(yī)嗅診辨證的客觀化，闡釋肝臭中醫(yī)嗅診的科學(xué)內(nèi)涵，實(shí)現(xiàn)肝衰竭肝臭中醫(yī)嗅診的客觀量化，提高肝衰竭中醫(yī)辨證論治的精準(zhǔn)度，并與臨床生化指標(biāo)相結(jié)合，建立肝臭中醫(yī)嗅診與病情輕重、疾病進(jìn)程的關(guān)聯(lián)。有助臨床及早診斷慢性肝衰竭的進(jìn)展，提前采取合理的臨床干預(yù)措施。

氣相色譜（GC）和氣相色譜質(zhì)譜（GC-MS）是目前用于VOCs 的分離和鑒定的有效途徑，特別是近年來(lái)，全二維氣相色譜-串聯(lián)飛行時(shí)間質(zhì)譜（GC×GC-TOFMS）的應(yīng)用，對(duì)于VOCs中低含量特征化合物的識(shí)別發(fā)揮了重要作用[27-30]。為此，本研究采用GC×GC-TOFMS 技術(shù)測(cè)定患者呼出氣冷凝物，篩選乙型肝炎導(dǎo)致的失代償期肝硬化和慢性肝衰竭中差異的VOCs，并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。

本研究分析結(jié)果表明，5 種具有顯著差異（P＜0.01）的VOCs對(duì)乙型肝炎失代償期肝硬化與慢性肝衰竭的鑒別能力較好，包括十二烷醇、1-1-甲基乙氧基-2-丙酮、二氧化碳、1-1-環(huán)己烯-1-基乙酮和鄰環(huán)己烯。其中，十二烷醇預(yù)測(cè)效果最好，當(dāng)其≥0.321 可鑒別失代償期肝硬化與慢性肝衰竭，AUC 為0.825（95%置信區(qū)間0.675-0.975），特異性99.23%，敏感性77.8%。十二烷醇又名正十二醇、月桂醇，是脂肪醇的一種，具有弱而持久的油脂氣味。十二烷醇在人體生理病理中相關(guān)作用的研究較少，曾有對(duì)蛙肝微粒體的研究表示，CO 對(duì)十二烷醇羥基化的抑制強(qiáng)烈，且其羥基化過(guò)程中涉及了一種以上的細(xì)胞色素P-450[31]。故慢性肝衰竭患者呼出氣代謝產(chǎn)物中十二烷醇的增多，可能與內(nèi)源性CO 及P-450 變化有關(guān)，繼而影響肝臟的血液循環(huán)及膽紅素代謝。最近的研究表明，十二烷醇可以在大腸桿菌中通過(guò)全細(xì)胞生物轉(zhuǎn)化產(chǎn)生[32]，其在肝病進(jìn)展中升高，可能與腸道菌群的影響有關(guān)。

慢性嚴(yán)重肝病患者，尤其進(jìn)展到失代償期肝硬化特別是慢性肝衰竭階段，定期復(fù)查以監(jiān)測(cè)病情變化至關(guān)重要，而目前監(jiān)測(cè)手段以抽取靜脈血為主，增加患者痛苦及往來(lái)醫(yī)院的時(shí)間精力消耗，導(dǎo)致患者的依從性較差，因此，患者對(duì)于無(wú)創(chuàng)檢查和監(jiān)測(cè)手段更加渴求。我們的初步研究，不僅表明呼出氣中的十二烷醇可以作為區(qū)分HBV 所致失代償期肝硬化和慢性肝衰竭患者的潛的生物標(biāo)志物，同時(shí)也證實(shí)了呼出氣VOC確與肝病進(jìn)展相關(guān)，為日后無(wú)創(chuàng)呼出氣分析技術(shù)用于評(píng)估、預(yù)測(cè)慢性嚴(yán)重肝病的進(jìn)展提供了理論支持及物質(zhì)基礎(chǔ)，也為進(jìn)一步揭示疾病進(jìn)展機(jī)制及研發(fā)無(wú)創(chuàng)、簡(jiǎn)便、廉價(jià)的診斷、監(jiān)測(cè)手段提供理論依據(jù)。