惠小娜，張晨寧，雷震，楊洋，馬衛(wèi)東，蘭鴻，羅斌，楊光義

(1.十堰市太和醫(yī)院藥學(xué)部，十堰 442000；2.湖北世元杜仲保健酒業(yè)有限公司，十堰 442000；3.廣東省深圳市寶安中醫(yī)院，深圳 518000)

杜仲(Eucommiaulmoides)為杜仲科植物杜仲(EucommiaulmoidesOliver)的干燥樹皮，又名思仙、思仲、木棉，為我國名貴滋補藥材[1]。杜仲作為中藥在我國已有2000多年的藥用歷史，具有補肝腎、強筋骨、降血壓、抗腫瘤、安胎等諸多功效[2-3]。杜仲酒由干燥杜仲皮泡制而成，具有調(diào)節(jié)血壓、降低血脂、滋陰補腎、強身健體、增強免疫力等功效[4-5]。文獻表明杜仲中的活性成分松脂醇二葡萄糖苷、桃葉珊瑚苷、紫丁香苷、京尼平、京尼平苷、京尼平苷酸、咖啡酸、綠原酸、原兒茶酸等具有降血壓、抗腫瘤、抗氧化、抗衰老等藥理作用[6-8]，筆者通過對不同批次杜仲酒中各類活性成分的調(diào)查和研究，建立超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜(UPLC-MS/MS)法同時測定杜仲酒中9種成分含量，可用于杜仲酒的質(zhì)量控制，為其進一步開發(fā)和利用提供理論參考依據(jù)。

1 儀器與試藥

1.1儀器 WATERS XEVO TQ UPLC-MS/MS超高效液相色譜儀串聯(lián)三重四級桿質(zhì)譜儀，色譜工作站ACQUITY UPLC系統(tǒng)(美國WATERS公司)，GWA-UN超純水機(北京普析通用有限公司)，AUW-120D分析天平(日本島津公司，感量：0.01 mg)，Centrifuge 5427R冷凍離心機(德國Eppendorf公司)，VORTEX-6微型渦旋混合儀(海門市其林貝爾儀器制造有限公司)。

1.2試藥 杜仲酒(湖北世元杜仲保健酒業(yè)有限公司，批號：20160704，20160910，20161103)，對照品松脂醇二葡萄糖苷(批號：MUST-16062204，含量：98.8%)、桃葉珊瑚苷(批號：MUST-16052017，含量：99.3%)、京尼平(批號：MUST-16042018，含量：99.7%)、京尼平苷(批號：MUST-16062016，含量：99.8%)、京尼平苷酸(批號：MUST-16042003，含量：99.7%)、咖啡酸(批號：MUST-16060613，含量：99.7%)、原兒茶酸(批號：MUST-16032112，含量：99.5%)均購于成都曼思特生物科技有限公司，紫丁香苷(批號：111574-200502，含量：99.6%，中國食品藥品檢定研究院)、綠原酸(批號：0753-200111，含量：99.8%，中國食品藥品檢定研究院)；乙腈(色譜級，德國Merck KGaA，批號：JA031530)；甲醇(色譜級，德國Merck KGaA，批號：1746607431)；甲醇(分析級，武漢市中天化工有限責(zé)任公司，批號：20160705)；其他試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1UPLC-MS/MS條件

2.1.1色譜條件 色譜系統(tǒng)：色譜柱：Waters HSS T3超高效液相色譜柱(50 mm×2.1 mm，1.8 μm)，流動相：甲醇(含0.1%甲酸，A)-水(含0.1%甲酸，B)為流動相，梯度洗脫，洗脫程序見表1，流速為0.4 mL·min-1，柱溫為40 ℃；進樣體積5 μL。

表19種待測化合物洗脫程序表

Tab.1Elutionprogramforninecompoundsundertest

時間/min流動相A流動相B% 0595 ～0.5595>0.5～6.05→5595→45>6.0～7.555→545→95>7.5～8.0595

2.1.2質(zhì)譜條件 Waters三重四級桿串聯(lián)質(zhì)譜儀(Waters Xevo TQ Triple Mass Spectrometer，Acquity UPLC，XEVO TQ)，電噴霧離子源(Electrospray ionization，ESI)，MassLynxV4.1工作站；毛細管電壓3.8 kV；離子源溫度150 ℃；脫溶劑氣溫度500 ℃；噴霧氣1000 L·h-1氮氣(N2)；碰撞氣0.16 mL·min-1氬氣(Ar2)；掃描方式多反應(yīng)正負離子同時監(jiān)測模式(Multiple Reaction Monitoring，MRM)。9種待測化合物質(zhì)譜條件見表2。

表29種待測化合物質(zhì)譜條件

Tab.2MSparametersforninecompoundsundertest

成分母離子子離子(m/z)駐留時間/s錐孔電壓碰撞電壓V松脂醇二葡萄糖苷705.15543.160.026038桃葉珊瑚苷369.09203.010.023822紫丁香苷395.11232.770.023620京尼平225.05122.950.02146京尼平苷411.11217.000.023028京尼平苷酸373.15211.030.022812咖啡酸179.01106.890.022224綠原酸353.06190.980.022812原兒茶酸152.9980.890.022220

2.2溶液的制備

2.2.1對照品溶液的制備 精密稱取松脂醇二葡萄糖苷、桃葉珊瑚苷、紫丁香苷、京尼平、京尼平苷、京尼平苷酸、咖啡酸、綠原酸、原兒茶酸9種標(biāo)準(zhǔn)品各5.00 mg，分別置于5 mL量瓶中，加入甲醇溶解，混勻，定容，分別制成1 mg·mL-1對照品儲備液備用。

2.2.2供試品溶液的制備 分別取杜仲酒樣品適量置于EP管中，14 000 r·min-1高速離心10 min，取上清液，經(jīng)孔徑0.45 μm微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液置EP管中，備用。

2.3HPLC定量分析方法學(xué)考察

2.3.1標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備 取等體積對照品儲備液混合，加甲醇定容，線性梯度稀釋后，取5 μL按上述UPLC-MS/MS條件進樣，記錄峰面積。以溶液質(zhì)量濃度(X)橫坐標(biāo)，峰面積(Y)為縱坐標(biāo)，進行線性回歸，結(jié)果見表3，表明各成分在各自范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。色譜圖見圖1。

2.3.2精密度實驗 取同一供試品溶液，進樣5 μL，在“2.1”項色譜條件下連續(xù)測定6次，測得峰面積RSD分別為松脂醇二葡萄糖苷2.82%、桃葉珊瑚苷3.59%、紫丁香苷3.11%、京尼平4.38%、京尼平苷4.26%、京尼平苷酸3.75%、咖啡酸2.99%、綠原酸2.64%、原兒茶酸4.12%，結(jié)果顯示其RSD均小于5%，表明儀器精密度良好。

2.3.3重復(fù)性實驗 按“2.2.2”項下方法制備6份供試品溶液，進樣5 μL，測得峰面積RSD分別為松脂醇二葡萄糖苷3.02%、桃葉珊瑚苷3.59%、紫丁香苷2.47%、京尼平3.06%、京尼平苷4.13%、京尼平苷酸2.58%、咖啡酸3.79%、綠原酸2.96%、原兒茶酸4.52%，結(jié)果顯示其精密度RSD<5%，表明該方法重復(fù)性良好。

表39種成分標(biāo)準(zhǔn)曲線、相關(guān)系數(shù)、線性范圍及檢測限

Tab.3Linearequation,correlationcoefficient,linearrangeandlimitofquantitationofninecompounds

成分標(biāo)準(zhǔn)曲線r線性范圍檢測限(ng·mL-1)松脂醇二葡萄糖苷Y=97.31X+3142.70.99937.68～4920.08桃葉珊瑚苷Y=76.03X+373.10.99976.75～4320.45紫丁香苷Y=215.67X+9376.30.99908.13～5200.07京尼平Y(jié)=121.31X+445.70.99927.62～4880.30京尼平苷Y=14.16X+118.50.99946.44～4120.52京尼平苷酸Y=256.64X+6828.40.99968.69～5560.17咖啡酸Y=22.39X+673.70.99936.06～3880.63綠原酸Y=499.06X+2788.90.99987.88～5040.29原兒茶酸Y=36.98X+439.00.99917.81～5000.38

2.3.4穩(wěn)定性實驗 按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，于0，2，4，8，12 h進樣5 μL，根據(jù)峰面積計算RSD，考察樣品穩(wěn)定性。樣品中9種被測成分的峰面積RSD分別為松脂醇二葡萄糖苷3.54%、桃葉珊瑚苷2.38%、紫丁香苷4.91%、京尼平3.88%、京尼平苷2.73%、京尼平苷酸1.98%、咖啡酸3.26%、綠原酸2.85%、原兒茶酸4.03%，結(jié)果顯示RSD均<5%，表明供試品溶液于12 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.3.5加樣回收率實驗 精密量取已知含量的杜仲酒樣品9份，每份1.0 mL，分別準(zhǔn)確加入樣品含量的80%，100%，120%的對照品，混勻，按照“2.1”項下色譜方法進樣測定，計算低、中、高濃度水平的回收率實驗，結(jié)果見表4。結(jié)果顯示，9種成分在低濃度回收率為98.33%～100.02%，RSD<4.88%，中濃度回收率為97.83%～101.45%，RSD<4.76%，高濃度回收率為98.58%～100.36%，RSD<4.79%，表明本法有良好的準(zhǔn)確性。

A.空白樣品；B.對照品；C.供試品

Tab.4Resultsofrecoverytestofnineconstituents%，n=3

成分低濃度回收率RSD中濃度回收率RSD高濃度回收率RSD平均RSD松脂醇二葡萄糖苷99.632.05101.451.49100.361.981.84桃葉珊瑚苷98.894.88100.884.7699.374.794.81紫丁香苷100.023.3099.753.0799.653.353.24京尼平99.493.3498.733.2698.583.093.23京尼平苷98.784.1198.634.0299.043.783.97京尼平苷酸99.902.2699.691.9999.392.202.15咖啡酸99.272.5897.832.4998.942.912.66綠原酸98.330.7599.670.6799.620.770.73原兒茶酸99.912.6598.942.9798.882.872.83

2.3.6樣品含量測定 取杜仲酒樣品3批，批號20160704，20160910，20161103，分別編號1-1，1-2，1-3，按“2.2.2”項下制備供試品溶液，分別進樣5 μL，測定峰面積，代入回歸方程，計算待測物中9種成分在杜仲酒中的含量，結(jié)果見表5。

表5杜仲酒中9種指標(biāo)成分的含量測定結(jié)果

Tab.5ResultsofcontentdeterminationonnineingredientsinEucommiawine

μg·mL-1，n=3

3 討論

3.1檢測方法選擇 筆者在本實驗曾采用HPLC-UV法測定，但由于部分成分的含量較低，響應(yīng)信號不明顯，而且復(fù)雜多樣，各成分間相互干擾嚴重，多種成分含量同時測定色譜條件摸索困難，以致該方法的靈敏度和選擇性都不足以同時定量分析[9-10]。故在查閱文獻[11-14]的基礎(chǔ)上，采用UPLC-MS/MS法進行測定，由于質(zhì)譜采用特定離子對掃描模式，樣品中雜質(zhì)不會對待測成分產(chǎn)生干擾，并且克服了液相色譜分離度差的問題，在短時間內(nèi)即可達到有效分離，又能保證待測成分快速檢測。

3.2色譜、質(zhì)譜條件選擇 筆者在本實驗考察了甲醇-水、乙腈-水、0.1%甲酸-乙腈，發(fā)現(xiàn)采用甲醇(含0.1%甲酸)-水(含0.1%甲酸)為流動相時，各成分均顯示出較高的檢測靈敏度和較好的峰形。同時，采用梯度洗脫程序可大大提高了分離速度和效率，在7 min內(nèi)即可實現(xiàn)9種成分的有效分離。

本實驗建立了一種UPLC-MS/MS的檢測方法，能夠同時檢測杜仲酒中松脂醇二葡萄糖苷、桃葉珊瑚苷、紫丁香苷、京尼平、京尼平苷、京尼平苷酸、咖啡酸、綠原酸、原兒茶酸這9種目標(biāo)化合物的含量。利用標(biāo)準(zhǔn)樣品建立的標(biāo)準(zhǔn)曲線相關(guān)性系數(shù)0.9990～0.9998，說明對9種目標(biāo)化合物的定量可靠，最低檢測限為0.07～0.63 ng·mL-1，說明該檢測方法靈敏度高。實驗采用的UPLC-MS/MS法利用其能夠快速簡便的對樣品進行定性及定量研究的特點，對不同批次杜仲酒中有效成分的含量進行測定，操作簡單且靈敏度高。在本實驗色譜條件下可快速、準(zhǔn)確地同時測定出杜仲酒中多種主要成分的含量，可為該酒的質(zhì)量控制提供有效的檢測手段，并為其質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的建立奠定基礎(chǔ)。