徐萬幫，林鐵豪，譚昌成

(廣東省藥品檢驗所，廣州 510180)

按照《中華人民共和國藥典》2015年版和國家藥典委員會的要求，中藥中有害元素控制項目主要包括鉛、鎘、汞、銅、砷等的總量。但有害元素的毒性并不直接取決于該元素的含量，而在于這些元素的化學(xué)形態(tài)以何種形式進入人體以及其生物有效性和被人體吸收與利用的程度。因此，用有害元素總量來評價中藥毒性與風(fēng)險存在很大缺陷。由于中藥中有害元素屬于痕量分析范疇，基質(zhì)復(fù)雜且涉及的各形態(tài)含量更低，元素形態(tài)在分析過程中可能發(fā)生轉(zhuǎn)變等，導(dǎo)致中藥中有害元素形態(tài)分析成為中藥質(zhì)量控制中亟待解決的問題。

目前元素形態(tài)分析在環(huán)境科學(xué)和食品科學(xué)已取得了較大發(fā)展，常見技術(shù)為色譜與質(zhì)譜技術(shù)聯(lián)用。目前研究較多的有害元素主要包括砷(As)和鉻(Cr)。如趙彤等[1]通過離子色譜和電感耦合等離子體質(zhì)譜聯(lián)機法測定稻米中砷的形態(tài)，賈娜等[2]采用離子色譜-電感耦合等離子體質(zhì)譜法測定地下水中砷的4種形態(tài)。田雨荷等[3]采用反向離子色譜法測定水中痕量Cr(VI) 和Cr(Ⅲ)，其他學(xué)者在采用色譜與質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)上也做了大量工作[4-6]。但是將色譜與質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)用于中藥材、中藥飲片以及中成藥中有害元素測定的報道筆者較少見到[7]。筆者在本實驗中對沉香化氣丸中不同形態(tài)As和Cr(VI)進行分析，以期為科學(xué)評價中成藥中砷和鉻限量提供參考。

1 儀器與試藥

1.1儀器 iCAP Qc ICP/MS電感耦合等離子質(zhì)譜儀(美國賽默飛世爾科技有限公司)，ICS5000離子色譜儀(美國賽默飛世爾科技有限公司)，ME204電子天平(梅特勒-托利多公司，感量：0.1 mg)。

1.2試藥 亞砷酸根標(biāo)準(zhǔn)溶液[As(III)，含量：1 mg·L-1，批號：1707]、砷酸根標(biāo)準(zhǔn)溶液[As(V)，含量：1 mg·L-1，批號：1707]、砷膽堿標(biāo)準(zhǔn)溶液[AsC，含量：1 mg·L-1，批號：1607]、砷甜菜堿標(biāo)準(zhǔn)溶液(AsB，含量：1 mg·L-1，批號：1707)、一甲基砷標(biāo)準(zhǔn)溶液(MMA，含量：1 mg·L-1，批號：1707)、二甲基砷標(biāo)準(zhǔn)溶液(DMA，含量：1 mg·L-1，批號：1707 )以及六價鉻標(biāo)準(zhǔn)溶液[Cr(VI)，含量：0.2 mg·L-1，批號：d1725072]均購自上海安譜實驗科技股份有限公司。

砷標(biāo)準(zhǔn)溶液(批號：17041063，含量：1 mg·L-1)，鉻標(biāo)準(zhǔn)溶液(批號：17051163，含量：1 mg·L-1)購自國家鋼鐵材料測試中心鋼鐵研究總院；硝酸(優(yōu)級純，批號：UN2031，濃度：69%)購自默克公司；過氧化氫(分析純，批號：20171030，濃度：30%)購自國藥集團，水為本實驗室自制去離子水，本實驗中其他所用到的試藥，除特別指出外，均為優(yōu)級純。

沉香化氣丸樣品來源于2016年國家基本藥物評價性抽樣，分別選取A公司和B公司部分樣品。

2 方法與結(jié)果

2.1不同梯度對照溶液的配制 分別移取6種砷標(biāo)準(zhǔn)儲備液1.00 mL于10 mL塑料量瓶，用超純水稀釋至10.00 mL，搖勻待用。配成100 μg·L-1砷6種不同形態(tài)標(biāo)準(zhǔn)儲備混合液。采用逐步稀釋法，準(zhǔn)確量取適量標(biāo)準(zhǔn)儲備混合液于5 mL量瓶，配制成濃度為0，1，2，5，10 μg·L-1混合對照品溶液。

移取Cr(VI)標(biāo)準(zhǔn)儲備液1.00 mL于10 mL塑料量瓶，超純水稀釋至10.00 mL，搖勻待用。配成100 μg·L-1Cr(VI)標(biāo)準(zhǔn)儲備混合液。采用逐步稀釋法，準(zhǔn)確量取適量標(biāo)準(zhǔn)儲備混合液于5 mL量瓶，配制0，0.5，1，2，5，10 μg·L-1混合對照溶液。

2.2樣品的處理 砷形態(tài)分析：取樣品適量，粉碎，過內(nèi)徑180 μm篩(80目，《中華人民共和國藥典》五號標(biāo)準(zhǔn)篩)。準(zhǔn)確稱取1.0 g經(jīng)粉碎后的樣品于50 mL塑料離心管，加入0.15 mol·L-1硝酸溶液20 mL，室溫放置12 h，80 ℃恒溫箱中熱浸提1.5 h，每0.5 h振搖1 min。提取完畢，取出冷卻至室溫，采用8 000 r·min-1離心15 min，取上清液，經(jīng)孔徑0.45 μm有機濾膜濾過后進樣測定。按同一操作方法作空白實驗。

六價鉻形態(tài)分析：準(zhǔn)確稱取樣品0.5 g置于50 mL離心管，加入(磷酸氫二鉀-磷酸二氫鉀)緩沖溶液0.5 mL，六水合氯化鎂0.4 g，加入堿性提取液(氫氧化鈉、碳酸鈉)2.5 mL，加水至25 mL，渦旋混合器上混勻。振蕩器上振蕩60 min，4 ℃下6500 r·min-1離心6 min。上清液用孔徑0.45 μm濾膜濾過后進樣測定。同一操作方法作空白實驗。

總砷總鉻分析：準(zhǔn)確稱取經(jīng)粉碎后的樣品0.5 g于聚四氟乙烯的消解罐中，加入硝酸5.0 mL，去離子水3.0 mL，設(shè)置程序升溫程序，于微波消解儀中消解。冷卻后轉(zhuǎn)移并最后定容至50 mL量瓶，同法制備空白溶液。

2.3色譜條件 As形態(tài)分析參數(shù)如下：色譜柱：AS7陰離子色譜柱(4 mm×250 mm)；流動相：5 mmol·L-1碳酸銨(A)100 mmol·L-1碳酸銨(B)，采用梯度洗脫方式，0～2.0 min，100%A；>2.0～5.5 min，100%B；>5.5～10 min，100%A，流速：1.0 mL·min-1，進樣量：25 μL。

Cr(VI)分析參數(shù)，色譜柱：AG7陰離子色譜柱(4 mm×50 mm)；流動相：0.76 mmol·L-1硝酸銨(pH值9.3)，流速：1.0 mL·min-1，進樣量：25 μL。

2.4沉香化氣丸中不同形態(tài)As的方法建立

2.4.1標(biāo)準(zhǔn)曲線及其檢出限 按照“2.3”項儀器條件，將“2.1”項所配制常見6種砷的化學(xué)形態(tài)對照溶液注入離子色譜儀進行分離后進入ICP-MS。依據(jù)響應(yīng)值和濃度，得到相應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)曲線圖。檢出限以3倍20次空白標(biāo)準(zhǔn)偏差響應(yīng)值對應(yīng)的濃度計算。由表1可知，As不同形態(tài)在上述色譜條件下具有良好線性關(guān)系，符合檢測基本要求，相應(yīng)檢出限0.011～0.108 μg·L-1。

2.4.2方法準(zhǔn)確度 取沉香化氣丸樣品 6 份，加入砷混標(biāo)溶液適量，按照“2.3”項儀器條件與供試品制備方法和條件進行萃取并測定。結(jié)果見表2。

由表2可知，采用上述方法所得AsB、DMA、As(Ⅲ)、AsC、MMA、As(V)等6種不同形態(tài)砷的平均回收率為92.4%～105.8%，RSD分別為4.3%，4.1%，4.5%，3.7%，4.5%，3.9%。符合相關(guān)測試要求。

表1 線性方程和檢出限

表2沉香化氣丸種6種不同形態(tài)砷的回收率實驗結(jié)果

Tab.2ResultsofrecoverytestonsixdifferentAs-speciesinChenxiangHuaqipill

砷的形態(tài)取樣量/g樣品量加入量測得量ng回收率平均值RSD%AsB1.00338.835055.7893.91.00638.865055.0192.31.00278.825059.62101.693.84.31.00268.825054.6791.71.00858.875056.7795.81.01028.895052.5987.4DMA1.00334.825050.7791.91.00634.835056.63103.61.00274.815053.2196.898.24.11.00264.815056.21102.81.00854.845052.5495.41.01024.855054.2098.7As(Ⅲ)1.003351.875096.2288.71.006352.035096.6389.21.002751.8450101.4999.392.44.51.002651.8350100.7397.81.008552.145096.0987.91.010252.235098.0391.6AsC1.00330.005047.8595.71.00630.005044.5589.11.00270.005046.7093.494.23.71.00260.005048.2596.51.00850.005050.001001.01020.005045.3090.6MMA1.00337.225053.5792.71.00637.255052.9091.31.00277.225053.8293.296.74.51.00267.225058.07101.71.00857.265056.8699.21.01027.275058.42102.3As(V)1.0033122.6050178.95112.71.0063122.9750173.37100.81.0027122.5350176.28107.5105.83.91.0026122.5250175.67106.31.0085123.2450176.04105.61.0102123.4550174.25101.6

2.5沉香化氣丸中Cr(VI)的分析方法建立

2.5.1標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制及檢出限的確定 按照“2.3”項儀器條件，將“2.1”項所配制Cr(VI)對照溶液注入離子色譜儀進行分離后進入ICP-MS。依據(jù)相應(yīng)值和濃度，得到相應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)曲線。檢出限以3倍20次空白標(biāo)準(zhǔn)偏差響應(yīng)值對應(yīng)的濃度計算。

此時，得到Cr(VI)在0～10 μg·L-1濃度范圍內(nèi)滿足線性方程Y=30 251.085X+7762.017(r=0.999)，在該條件下，檢測限0.035 μg·L-1，線性關(guān)系符合檢測基本要求。

2.5.2方法準(zhǔn)確度 取沉香化氣丸公司A樣品 6 份，加入Cr(VI)對照溶液適量，由于樣品中Cr(VI)含量極低，為減少實驗誤差，本實驗Cr(VI)加入量按照10.0 μg·kg-1標(biāo)準(zhǔn)加入，并按照“2.3”項儀器條件與供試品制備方法和條件進行萃取并測定。結(jié)果表明該方法準(zhǔn)確度較好。由表3可知，采用上述方法所得Cr(VI)的平均回收率101.29%，RSD為2.2%。符合相關(guān)測試要求。

表3沉香化氣丸中Cr(VI)的回收率實驗結(jié)果

Tab.3ResultsofrecoverytestonCr(VI)inChenxiangHuaqipill

取樣量/g樣品量加入量測得量ng回收率平均值RSD%0.505 40.444 710.0010.312 398.680.496 20.436 610.0010.625 2101.890.507 10.446 210.0010.847 2104.01101.292.20.504 10.443 610.0010.723 6102.800.503 10.442 710.0010.660 5102.180.504 70.444 110.0010.265 898.22

2.6不同形態(tài)As的測試 按照“2.2”項方法，提取沉香化氣丸中AsB、DMA、As(Ⅲ)、AsC、MMA、As(V)等6種不同形態(tài)As。按照“2.3”項色譜條件，分別將“2.1”項混合對照品以及樣品注入離子色譜-電感耦合等離子質(zhì)譜儀，按照“2.5.1”項所得標(biāo)準(zhǔn)曲線法獲得檢測數(shù)據(jù)。典型色譜圖見圖1。

由圖1B可知，按照“2.3”項色譜條件，AsB、DMA、As(Ⅲ)、AsC、MMA、As(V)等6種不同形態(tài)As能良好分離。

溶液通過離子色譜儀分離后，進入ICP-MS，記錄信號強度，依據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線，獲得樣品中砷含量，結(jié)果見表4。

由表4可知，4批樣品中，AsB、DMA、As(Ⅲ)、MMA、As(V)等5種不同形態(tài)As均檢出，AsC未檢出?？偵榱砍^本實驗中6種不同形態(tài)砷量之和，可能還存在其他形式的砷或其他原因所致。具體原因需要進一步研究。

A.空白溶液；B.標(biāo)準(zhǔn)溶液；C.樣品溶液；1.AsB；2.DMA;3.As(Ⅲ)；4.AsC；5.MMA；6.As(V)

圖13種溶液中6種不同形態(tài)砷色譜圖

A.blank solution；B.standard solution；C.sample solution；1.AsB；2.DMA;3.As(Ⅲ)；4.AsC；5.MMA；6.As(V)

Fig.1ChromatogramofsixdifferentAs-speciesinthreekindsofsolution

表4樣品中不同形態(tài)砷含量

Tab.4ContentofdifferentAs-speciesinsamples

μg·kg-1

2.7Cr(VI)的測定 按照“2.2”項方法，提取沉香化氣丸中Cr(VI)。按照“2.3”項色譜條件，分別將“2.1”項Cr(VI)以及樣品注入離子色譜-電感耦合等離子質(zhì)譜儀，按照“2.5.1”項所得到的標(biāo)準(zhǔn)曲線法獲得檢測數(shù)據(jù)。典型色譜圖見圖2。

由圖2可知，按照“2.3”項色譜條件，Cr(VI)色譜峰對稱性良好，分離度良好。

由圖2可知，樣品中Cr(VI)含量極低，基本處于空白附近。說明沉香化氣丸中鉻的化學(xué)形態(tài)主要以毒性較弱的形式存在。也進一步印證了以元素總量來評判元素危害性的局限性。通過對樣品進行測定，獲得樣品中Cr(VI)含量，為了更好對比，本實驗將總鉻進行測定，結(jié)果見表5。

A.標(biāo)準(zhǔn)溶液；B.供試品溶液；a.Cr(VI) ；1.加標(biāo)10 ppb樣品；2.樣品；3.空白

圖2標(biāo)準(zhǔn)溶液和供試品溶液中Cr(VI)色譜圖

A.standard；B.rest solution；a.Cr(VI) ；1.10 ppb，add-standard；2.sample；3.blank

Fig.2ChromatogramofCr(VI)standardsolutionandsamplesolution

表5樣品中不同形態(tài)Cr含量

Tab.5ContentofdifferentCr-speciesinsamples

μg·kg-1

由表5可知，樣品中Cr(VI)含量極低。鉻元素存在形式主要以低生物毒性的其他形式存在。但不可忽視的是，低毒性形態(tài)在一定條件下也可以轉(zhuǎn)化為高生物毒性Cr(VI)形態(tài)。

3 討論

3.1不同形態(tài)砷萃取條件的優(yōu)化 砷形態(tài)分析的難點是如何有效將目標(biāo)物中的不同形態(tài)As提取出來。砷的化學(xué)形態(tài)主要有亞砷酸根[As(III)]、砷酸根[As(V)]、砷膽堿標(biāo)準(zhǔn)溶液[AsC]、砷甜菜堿[AsB]、一甲基砷標(biāo)準(zhǔn)溶液[MMA]、二甲基砷 [DMA]等。不同條件下容易相互轉(zhuǎn)化。為確保不同形態(tài)As的萃取，對沉香化氣丸中不同形態(tài)As的萃取條件進行優(yōu)化具有極其重要的作用與意義。

3.1.1萃取溶劑的選擇 目前As的形態(tài)分析萃取溶劑主要有鹽酸(0.12 mol·L-1)、硝酸(0.15 mol·L-1)等。鹽酸較溫和，多種形態(tài)砷化合物在該體系中發(fā)生相互轉(zhuǎn)移和變化的可能性較小，具有較好的穩(wěn)定性，但由于鹽酸溶液中氯離子的大量存在，在質(zhì)譜中會形成明顯的多原子離子(ArCl -75)，對砷(As-75 )離子有強烈的干擾。因此筆者在本實驗采用硝酸提取方式。

采用硝酸提取時，如果硝酸濃度較高，容易氧化低價砷，導(dǎo)致砷化學(xué)形態(tài)變化，影響真實測定效果。因此需適度降低硝酸濃度，經(jīng)考察，0.15 mol·L-1硝酸溶液適合沉香化氣丸中不同化學(xué)形態(tài)砷的提取。

3.1.2萃取溫度的選擇 分別比較70，75，80，85，90 ℃等5個萃取溫度，發(fā)現(xiàn)提高溫度對五價砷影響較大，當(dāng)萃取溫度低于85 ℃時，五價砷增長緩和。繼續(xù)提高溫度，五價砷增長較快。因此，萃取溫度以<80 ℃為佳。筆者將該條件應(yīng)用于菟絲子藥材中不同形態(tài)砷的分析，亦獲得類似的結(jié)果。

3.1.3萃取時間的選擇 分別選擇30，60，80，90，100，120 min等6個時間段對樣品萃取情況進行比較。萃取后，減壓抽濾處理經(jīng)過提取后的殘渣。

按照傳統(tǒng)微波消解方式對殘渣進行消化處理并測定殘渣中總砷含量來判斷樣品中As的萃取情況。結(jié)果表明，上述條件下萃取≥90 min，能有效將沉香化氣丸中不同形態(tài)砷萃取完全。筆者將該條件應(yīng)用于菟絲子藥材中不同形態(tài)砷的分析，亦獲得相同的結(jié)果。

3.2Cr(VI)萃取條件來源 中藥中Cr(VI)萃取的難點就是盡可能保證Cr(VI)不轉(zhuǎn)化為Cr(Ⅲ)。目前Cr(VI)形態(tài)分析的文獻不多，大部分Cr(VI)的萃取主要采用1998年美國環(huán)境保護局(EPA)頒布的3060A法和濁點萃取法[8-11]。本實驗采用美國環(huán)境保護局頒布的提取方法，用0.28 mol·L-1碳酸鈉(Na2CO3)與0.5 mol·L-1氫氧化鈉(NaOH)做萃取劑，90～95 ℃加熱1 h。此時水溶性和非水溶性Cr(VI)全部提取完畢。由于該方法已經(jīng)形成標(biāo)準(zhǔn)，故不再對其進行優(yōu)化處理，筆者在本實驗依據(jù)沉香化氣丸特性，加入緩沖液(磷酸氫二鉀—磷酸二氫鉀緩沖溶液)和穩(wěn)定劑(六水合氯化鎂，)直接將美國環(huán)境保護局(EPA)方法應(yīng)用于沉香化氣丸中Cr(VI)的提取。

總之，筆者在本實驗建立了IC-ICP-MS聯(lián)用技術(shù)在沉香化氣丸中測定AsB、DMA、As(Ⅲ)、AsC、MMA、As(V)等6種不同形態(tài)As和Cr(VI)。實驗結(jié)果表明，測試分離度良好，方法準(zhǔn)確可靠。通過本實驗可知，沉香化氣丸中砷、鉻存在多種形態(tài)，而不同化學(xué)形態(tài)的生理毒性均不相同。因此，僅對樣品中總砷和總鉻含量進行測定不能有效反應(yīng)樣品毒性。建議國家食品藥品監(jiān)督管理局進一步強化有害元素的形態(tài)分析，制定更合理的重金屬限度標(biāo)準(zhǔn)。

志謝：1.感謝賽默飛世爾科技(中國)有限公司王艷萍在本實驗初期的指導(dǎo)；2.2016年我單位承擔(dān)國家基本藥物評價性抽驗沉香化氣丸和菟絲子的評價工作，兩個品種的形態(tài)分析同步進行，在總結(jié)報告中共用部分色譜圖