李東亞，王 祎,2,*，湯繼華，許 恒，譚金芳,2，韓燕來,2,*

（1 河南農(nóng)業(yè)大學(xué)資源與環(huán)境學(xué)院，河南鄭州 450002；2 河南省糧食作物協(xié)同創(chuàng)新中心，河南鄭州 450002；3 省部共建小麥玉米國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，河南鄭州 450002）

玉米作為三大重要糧食作物之一，被廣泛應(yīng)用于工業(yè)原料、食品加工等領(lǐng)域。2012年我國玉米總產(chǎn)超過稻谷，成為總產(chǎn)和種植面積均第一的糧食作物[1]。前人研究認(rèn)為，我國人均玉米占有率越高，其生活水平及畜牧業(yè)發(fā)展水平越高[2]。我國玉米高產(chǎn)主要依賴于氮肥的大量投入，研究表明，1985至1994十年間，化肥在玉米增產(chǎn)中起到51.5%的作用[3]，并且數(shù)據(jù)顯示2008—2009年玉米的氮肥使用比例占我國主要農(nóng)作物氮肥消費(fèi)總量的19%，遠(yuǎn)高于水稻、小麥等作物的氮肥用量[4]。但是我國玉米的氮肥利用率僅有26.1%，遠(yuǎn)低于國際水平，且低于我國水稻和小麥的氮肥利用率[5]。氮肥長期大量施用已引發(fā)土壤酸化、水體富營養(yǎng)化、溫室效應(yīng)等一系列環(huán)境問題[6-8]。因此，提高玉米氮肥利用率、培育氮高效品種，對(duì)實(shí)現(xiàn)我國玉米高產(chǎn)高效和減輕過量施氮對(duì)環(huán)境污染的壓力具有重要意義[9]。

葉片黃化是植株氮素缺乏的主要癥狀，研究表明葉片葉綠素含量與葉片氮含量顯著相關(guān)，可用來反映葉片氮營養(yǎng)水平[10]。葉片壽命與氮素水平具有密切關(guān)系，葉片光合作用的提高或降低亦與氮素的輸出有關(guān)。玉米吐絲后的光合作用對(duì)產(chǎn)量的形成具有決定作用，其中穗位葉對(duì)籽粒碳水化合物的供應(yīng)尤為重要[9]。氮素供應(yīng)不足加速穗位葉黃化，降低光合速率，最終導(dǎo)致產(chǎn)量下降[11]。Thomas等[12]研究表明，持綠性是指植物在進(jìn)入成熟期后葉片衰老延緩而保持綠色的特性，被廣泛認(rèn)定為植物的理想農(nóng)藝性狀。持綠型植株不僅持綠時(shí)間長，而且葉片顏色也相對(duì)較深。有研究發(fā)現(xiàn)，在植物成熟后期，葉片持綠每延長1天，籽粒產(chǎn)量可提高2%[13]，并且持綠性與植物保持較高光合能力、增加產(chǎn)量、提高品質(zhì)、增強(qiáng)抗逆性等密切相關(guān)[14-17]。籽粒灌漿期氮素供求關(guān)系的平衡決定著植株葉片持綠性[18]，從而影響植株氮效率和產(chǎn)量[19-21]。當(dāng)前可用于評(píng)價(jià)玉米持綠性的指標(biāo)包括綠葉面積持續(xù)期、花后絕對(duì)綠葉面積、相對(duì)綠葉面積、葉綠素含量等[22]。葉綠素含量作為與植株氮含量緊密關(guān)聯(lián)的次級(jí)指標(biāo)能夠很好地反映葉片的氮含量，并與葉片光合作用密切相關(guān)，且具有相對(duì)較高的遺傳穩(wěn)定性，可用于持綠QTL定位分析[23-25]。

前人在不同氮條件下，利用單片段代換系對(duì)玉米穗部性狀[26]、開花期相關(guān)性狀[27]、苗期根系形態(tài)及氮吸收量[28]等方面的QTL定位進(jìn)行了初步研究，但有關(guān)玉米穗位葉持綠相關(guān)性狀的QTL定位研究相對(duì)報(bào)道較少。鄭洪建[29]定位了80個(gè)與持綠相關(guān)的玉米QTL，其中包含31個(gè)主效QTL，但其研究是在正常供氮條件下進(jìn)行的，有關(guān)低氮條件下玉米持綠相關(guān)QTL的定位特征尚不清楚。本研究利用大田全生育期條件下低氮脅迫不敏感自交系許178和低氮脅迫敏感材料綜3構(gòu)建的單片段代換系作為研究對(duì)象[30-31]，對(duì)兩年大田高、低氮條件下玉米穗位葉的持綠性狀進(jìn)行了QTL定位分析，旨在為玉米持綠相關(guān)基因的精細(xì)定位奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

本研究所用的玉米單片段代換系由河南農(nóng)業(yè)大學(xué)湯繼華教授提供。此群體綜3 (氮敏感材料，SPAD值較許178低，表1) 為供體親本，許178 (氮不敏感材料) 為受體親本，經(jīng)過4個(gè)世代回交和3個(gè)世代自交，結(jié)合SSR分子標(biāo)記輔助選擇的方法構(gòu)建而成[30-31]。

1.2 田間試驗(yàn)設(shè)計(jì)

2013年和2014年的6至10月，在河南新鄭“華北小麥玉米輪作營養(yǎng)與施肥觀測(cè)試驗(yàn)站”對(duì)單片段代換系群體進(jìn)行田間試驗(yàn)。土壤基本理化性狀如下：全氮0.940 g/kg、有機(jī)質(zhì)10.4 g/ kg、堿解氮28.4 mg/kg、有效磷8.17 mg/kg、速效鉀63.0 mg/kg、pH值7.82。試驗(yàn)采取完全隨機(jī)區(qū)組設(shè)計(jì)，設(shè)置高氮 (N 240 kg/hm2) 和低氮 (N 75 kg/hm2) 兩個(gè)處理，每個(gè)處理重復(fù)三次。供試肥料為尿素和磷酸二氫銨，兩氮素處理的磷、鉀肥用量相同 (P2O5192 kg/hm2，K2O 60 kg/hm2)。灌溉、除草和防蟲等田間管理均與大田管理一致。前茬作物小麥?zhǔn)斋@后，于6月10號(hào)進(jìn)行玉米播種，播種時(shí)不施肥。拔節(jié)期(7月2日) 和大喇叭口期 (7月30日) 采用穴施方式追肥。

表1 群體SPAD值Table 1 SSSL SPAD values

1.3 測(cè)定指標(biāo)

玉米吐絲后第10天，使用SPAD 502葉綠素含量測(cè)定儀測(cè)定穗位葉葉綠素含量。測(cè)定時(shí)選取穗位葉中間部位約10 cm的區(qū)域連續(xù)測(cè)定5個(gè)點(diǎn) (避開主脈)，取平均值作為該葉片的SPAD值。每個(gè)小區(qū)選取6株長勢(shì)一致的植株進(jìn)行測(cè)定。

1.4 數(shù)據(jù)分析與QTL定位

采用SPSS 23.0和Excel 2016軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，若群體單株表型值與許178在P ＜ 0.01水平上差異顯著，則認(rèn)為該單片段代換系的代換片段上存在一個(gè)持綠QTL，并同時(shí)估算各個(gè)QTL的加性效應(yīng)值及貢獻(xiàn)率[32]。

加性效應(yīng)值 = (單片段代換系的表型值 - 許178表型值)/2；

加性效應(yīng)貢獻(xiàn)率 = 加性效應(yīng)貢獻(xiàn)值/許178表型值 × 100%。

1.5 QTL命名

根據(jù)Mccouch等[33]制定的原則對(duì)QTL命名，q為QTL的縮寫，hn表示高氮 (high nitrogen)，ln表示低氮 (low nitrogen)，SG代表持綠 (stay-green)，第一個(gè)數(shù)字為QTL所在染色體的編號(hào)，最后一個(gè)字母為此性狀在該染色體上的QTL序號(hào)。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同氮水平下親本和SSSL群體穗位葉持綠表型分析

由表1可知，高氮條件下，2013年親本許178和綜3的表型值分別是50.21和44.20，許178較綜3高13.60%；2014年兩親本的表型值分別是51.48和46.44，許178比綜3高10.85%。低氮條件下，2013年親本許178和綜3的表型值分別是47.51和41.81，許178比綜3高13.63%；2014年兩親本的表型值分別是47.33和40.91，許178較綜3高15.69%。綜上分析，兩親本在不同氮條件下穗位葉的持綠性具有顯著性差異。高氮條件下，2013年不同SSSLs的SPAD值變異范圍是36.72～57.62，平均值為48.73 ± 3.40；在2014年其變異范圍為28.73～60.90，平均值是47.37 ± 5.23。低氮條件下，不同SSSLs在2013和2014年的SPAD的變化范圍分別是23.10～63.25、33.10～62.05，平均值分別是43.89 ±5.32、48.22 ± 4.43。不同SSSLs的SPAD值在不同處理?xiàng)l件下均具有較大變異，為QTL的定位提供豐富的表型數(shù)據(jù)。

2.2 不同氮水平下玉米穗位葉持綠QTL分析

通過QTL代換作圖，對(duì)SSSL群體不同氮水平下檢測(cè)到的玉米穗位葉持綠QTL進(jìn)行分析。兩個(gè)氮水平下共檢測(cè)到53個(gè)穗位葉持綠QTL，且在10條染色體上均有分布。其中2013年，兩個(gè)氮水平下共檢測(cè)到22個(gè)QTL；2014年，兩個(gè)氮水平下共檢測(cè)到31個(gè)QTL。單個(gè)QTL的加性效應(yīng)貢獻(xiàn)率為-2.45%～-22.65% (表 2)。

高氮 (HN) 條件下，在P ＜ 0.01時(shí)，兩年共檢測(cè)到29個(gè)玉米穗位葉持綠QTL，10條染色體均有分布，其中僅2013年檢測(cè)到的QTL qhnSG1e表現(xiàn)為正

向加性效應(yīng) (貢獻(xiàn)率為4.02%)，其余QTL均表現(xiàn)為負(fù)向加性效應(yīng) (貢獻(xiàn)率為-2.45%～-13.77%) (表2)。HN條件下，有6個(gè)QTL兩年被重復(fù)檢測(cè)到，分別是qhnS1d，加性效應(yīng)貢獻(xiàn)率分別是-4.68%和-13.77%；qhnSG2a，加性效應(yīng)貢獻(xiàn)率分別是-4.80%和-11.61%；qhnSG3a，加性效應(yīng)貢獻(xiàn)率分別是-7.01%和-6.92%；qhnSG4a，加性效應(yīng)貢獻(xiàn)率分別是-7.40%和-2.45%；qhnSG8b，加性效應(yīng)貢獻(xiàn)率分別是-4.47%和-9.17%；qhnSG10c，加性效應(yīng)貢獻(xiàn)率分別是-9.46%和-5.05%。其余23個(gè)QTL僅在2013或2014年被檢測(cè)到。

表2 不同氮水平下SSSL群體穗位葉持綠QTL及其效應(yīng)值Table 2 QTL location of ear leaf stay-green in maize in the SSSL population under different nitrogen conditions

續(xù)表 2 Table 2 continued

低氮 (LN) 條件下，兩年共檢測(cè)到16個(gè)QTL (P ＜0.01)，分別分布在第1、2、3、4、5和10號(hào)染色體上，其中2013年檢測(cè)到的9個(gè)QTL均表現(xiàn)為負(fù)加性效應(yīng) (貢獻(xiàn)率為-6.99%～-22.65%)，2014年檢測(cè)到的QTL有6個(gè)正加性效應(yīng) (貢獻(xiàn)率為5.23%～12.84%)，3個(gè)負(fù)加性效應(yīng) (貢獻(xiàn)率分別為-8.51%、-12.22%和-10.85%)。有2個(gè)QTL在兩年被重復(fù)檢測(cè)到，分別是qlnSG1f和qlnSG2b。qlnSG1f位于Bin1.08區(qū)域，代換片段為umc1013～umc2047，兩年加性效應(yīng)貢獻(xiàn)率分別是-9.70%和-10.85%；qlnSG2b位于Bin2.04區(qū)域，代換片段為umc1485～bnlg1396，2013年為負(fù)加性效應(yīng) (貢獻(xiàn)率為-8.97%)，2014年為正加性效應(yīng) (貢獻(xiàn)率為8.69%)。其余14個(gè)QTL僅在2013或2014年被檢測(cè)到。

2.3 QTL在染色體上的分布

圖1所示為兩年試驗(yàn)中兩個(gè)氮水平條件下檢測(cè)到的QTL在染色體上的分布狀況。結(jié)果表明，定位到的穗位葉持綠QTL在玉米10條染色體上均有分布。其中第1染色體上檢測(cè)到的QTL數(shù)目最多(14個(gè))，而第7染色體上僅檢測(cè)到1個(gè)QTL，數(shù)目最少。通過分析QTL在染色體上的分布發(fā)現(xiàn)，多數(shù)定位到的持綠QTL在高、低氮條件下同時(shí)檢測(cè)到，表明該持綠QTL為非特異性QTL。另外，有些染色體片段僅在高氮條件下檢測(cè)到QTL，稱為高氮特異QTL，例如第1染色體的phi097～umc1269區(qū)間、第2染色體的umc1024～umc1579區(qū)間、第3染色體的umc1844～pnlg1182區(qū)間，以及第6、第8、第9和第10染色體上均有高氮特異的持綠QTL檢測(cè)到。這其中位于第8染色體的umc2075～phi100175(代換系1463的代換片段) 和第10染色體的umc1077～umc2350 (代換系1473的代換片段) 區(qū)域，在兩年試驗(yàn)中可以重復(fù)檢測(cè)到。相較于高氮特異的持綠QTL，低氮特異的持綠QTL數(shù)目較少，僅分布在第1染色體的umc1013～umc2047區(qū)間和第4染色體的phi074～umc1755區(qū)間內(nèi)。其中第1染色體的umc1013～umc2047 (代換系1314的代換片段) 區(qū)域檢測(cè)到的低氮特異持綠QTL在兩年的大田試驗(yàn)中重復(fù)出現(xiàn)，表明該區(qū)段可能僅控制低氮條件下玉米穗位葉持綠，有利于我們挖掘低氮條件下特異的QTL。

3 討論

研究表明，植株氮素營養(yǎng)與持綠之間存在既密切又復(fù)雜的關(guān)系[19-21,34]。因此，克隆直接與氮效率緊密相關(guān)的葉片持綠基因，對(duì)于深入分析葉片持綠與氮效率之間的關(guān)系具有重要意義。方永豐等[35]通過對(duì)劉宗華等[36]、王愛玉等[37]、Zheng等[38]研究中定位到的持綠QTL進(jìn)行Meta分析，發(fā)現(xiàn)5個(gè)玉米持綠“一致性”QTL區(qū)間，并在這些QTL區(qū)間內(nèi)初步確定了8個(gè)與玉米持綠相關(guān)的候選基因。本研究在高、低兩種供氮條件下，通過兩年大田試驗(yàn)，利用172個(gè)單片段代換系材料，分析了玉米吐絲后第10天穗位葉SPAD值，共定位到53個(gè)持綠QTL，其中低氮條件下定位到的特異染色體區(qū)段umc1013～umc2047和高氮條件下定位到的特異染色體區(qū)段umc1077～umc2350，與方永豐等[35]通過Meta分析檢測(cè)到的持綠QTL區(qū)間有重疊。馮萬軍等[39]對(duì)玉米谷氨酰胺合成酶 (GS) 基因家族進(jìn)行定位分析發(fā)現(xiàn)，ZmGS1-2 (GRMZM2G024104) 基因位于第1染色體，該位置位于本研究中代換系材料1314 (Bin1.08，umc1013～umc2047) 的代換區(qū)間內(nèi)。GS根據(jù)亞細(xì)胞定位可分為胞質(zhì)型GS1和質(zhì)體型GS2，高等植物GS1主要參與種子萌發(fā)時(shí)氮源的轉(zhuǎn)運(yùn)和葉片衰老時(shí)氮源的轉(zhuǎn)移再利用，說明該染色體片段內(nèi)的基因與葉片衰老和氮代謝關(guān)系密切。Yang等[40]利用鄭58和B73構(gòu)建的165個(gè)F3:4自交系群體材料，通過三個(gè)表型 (葉綠素含量、光合效率和持綠葉面積) 對(duì)玉米持綠性進(jìn)行定位，共檢測(cè)到23個(gè)與持綠相關(guān)的QTL，其中第8染色體上的區(qū)段phi100175～umc1858在三個(gè)表型中均被檢測(cè)到，該區(qū)段所在位置與本研究中檢測(cè)到的高氮特異持綠QTL區(qū)間 (Bin8.03，umc2075～phi100175) 部分重疊。這些結(jié)果表明本研究中重復(fù)定位到的QTL區(qū)間內(nèi)可能存在與氮效率關(guān)系密切的玉米穗位葉持綠主效QTL。另外，筆者所在課題組前期對(duì)本研究所用的代換系群體苗期氮效率相關(guān)QTL進(jìn)行了定位[28]，研究發(fā)現(xiàn)在1314株系的代換片段 (umc1013～umc2047) 上定位到低氮條件下植株生物量QTL和氮含量QTL，該片段在本研究中定位到低氮特異的持綠QTL；代換系1473的代換片段 (umc1077～umc2350) 在前期的研究中定位到高氮條件下根系形態(tài)及氮積累量QTL，而該片段在本研究中定位到高氮特異的持綠性QTL。這一結(jié)果表明，玉米穗位葉的持綠性與氮效率之間存在密切關(guān)系。后期對(duì)高、低氮特異QTL進(jìn)行精細(xì)定位與分析，有助于解析玉米氮效率與持綠之間的復(fù)雜關(guān)系，對(duì)于培育高、低氮條件下持綠玉米品種具有重要的參考意義。

圖1 不同氮水平下玉米穗位葉持綠QTL在染色體上的分布Fig. 1 Position of the QTLs for ear leaf stay-green under low and high N conditions in maize

4 結(jié)論

本研究分別在umc1077～umc2350 (Bin10.04，代換系1473) 和umc1013～umc2047 (Bin1.08，代換系1314) 區(qū)段內(nèi)檢測(cè)到高、低氮特異的持綠QTL，且該區(qū)段與前人定位到的氮效率相關(guān)QTL區(qū)間重疊，說明這兩個(gè)持綠QTL與玉米氮效率關(guān)系密切，后期對(duì)該區(qū)間進(jìn)行精細(xì)定位，獲得候選基因，有益于探討玉米氮效率與持綠性之間的復(fù)雜關(guān)系。