周麗平，袁 亮，趙秉強(qiáng)，李燕婷，林治安

（中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)資源與農(nóng)業(yè)區(qū)劃研究所/農(nóng)業(yè)農(nóng)村部植物營(yíng)養(yǎng)與肥料重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100081）

腐殖酸是動(dòng)植物遺骸經(jīng)過(guò)微生物的分解和轉(zhuǎn)化以及地球化學(xué)、物理的一系列變化過(guò)程而形成積累起來(lái)的一類(lèi)具有多種官能團(tuán)的大分子有機(jī)弱酸混合物。植物木質(zhì)素及其轉(zhuǎn)化產(chǎn)物多糖、蛋白質(zhì)、脂質(zhì)和核酸等都是參與該過(guò)程的重要組分[1]。因此，腐殖酸對(duì)植物生長(zhǎng)發(fā)揮著重要作用[2-4]，研究表明，腐殖酸對(duì)植物生長(zhǎng)發(fā)育的影響受分子量的影響較大。聚合程度低、分子量小的腐殖酸 (＜ 3.5 kDa) 更能提高根系H+-ATP酶的活性，以促進(jìn)作物生長(zhǎng)，這可能是因?yàn)樾》肿恿扛乘嵋子诒蛔魑镂眨液休^高含量的酸性官能團(tuán)[5-6]。也有研究表明，聚合程度高、分子量大的腐殖酸 (＞ 3.5 kDa) 能提高玉米根系H+-ATP酶活性，從而提高質(zhì)子泵活力，此外，大分子量腐殖酸具有較好的殘留效應(yīng)[7-8]。這些研究并未得到一致的結(jié)論。

目前，關(guān)于腐殖酸對(duì)玉米植株不同器官的碳水化合物、蛋白質(zhì)和核酸等的相關(guān)研究多采用蒽酮比色法、Somogyi法、考馬斯亮藍(lán)染色法和PCR法等[9-12]，這些方法制樣過(guò)程復(fù)雜、樣品用量多、測(cè)試時(shí)間長(zhǎng)，不利于快速、大量地進(jìn)行植株樣品分析和測(cè)定。傅里葉變換紅外光譜 (FTIR) 是一種主要基于化合物中極性鍵振動(dòng)的結(jié)構(gòu)分析技術(shù)，它可通過(guò)特征紅外吸收峰以及標(biāo)準(zhǔn)譜圖庫(kù)檢索對(duì)樣品中碳水化合物、脂類(lèi)和核酸等官能團(tuán)進(jìn)行定性和定量分析。該方法具有靈敏度高、制樣方法簡(jiǎn)單、樣品用量少、測(cè)試時(shí)間短等優(yōu)點(diǎn)[13-14]。前人已經(jīng)將該技術(shù)用于作物養(yǎng)分脅迫、作物病蟲(chóng)害檢測(cè)和吸附性能等的檢測(cè)[15-18]，但鮮有研究用FTIR方法來(lái)檢測(cè)腐殖酸處理下作物根、莖和葉各器官中主要代謝物的變化，而此方法若用于植株各器官的化學(xué)組分測(cè)定，可為高效篩選腐殖酸材料提供方法，為腐殖酸材料的進(jìn)一步高效利用提供技術(shù)支持。

綜上可知，腐殖酸的分子量大小可影響植物體的生長(zhǎng)發(fā)育，但利用FTIR方法研究腐殖酸處理下植物體內(nèi)不同器官的化學(xué)組分變化，尚未見(jiàn)到文獻(xiàn)報(bào)道。本研究以玉米鄭單958為供試作物，以來(lái)源較廣的風(fēng)化煤腐殖酸為試驗(yàn)材料，利用FTIR技術(shù)對(duì)玉米植株不同器官的主要代謝物進(jìn)行分析，以研究不同分子量風(fēng)化煤腐殖酸對(duì)玉米生長(zhǎng)的作用機(jī)理，從而為風(fēng)化煤腐殖酸影響玉米生長(zhǎng)與生理代謝的機(jī)理研究提供參考，并為風(fēng)化煤腐殖酸的進(jìn)一步開(kāi)發(fā)利用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試材料

供試夏玉米品種為鄭單958 (Zea mays L.)。供試風(fēng)化煤來(lái)自?xún)?nèi)蒙古棋盤(pán)井煤礦 (107°12'E、39°21'N，內(nèi)蒙古自治區(qū)鄂爾多斯市)，腐殖酸 (HA) 是采用IHSS標(biāo)準(zhǔn)方法從風(fēng)化煤中提取[19]，提取率為50.4%。供試腐殖酸的碳、氫、氧和氮含量分別為47.0%、4.89%、1.04%和33.6%。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

1.2.1 腐殖酸的分級(jí) 將腐殖酸樣品 (HA) 采用超濾法按分子量 ＞ 50 kDa、10～50 kDa 和 ＜ 10 kDa 分為三個(gè)不同的級(jí)分，分別編號(hào)為HAH、HAM和HAL，基本元素特性如表1。

1.2.2 溶液培養(yǎng)試驗(yàn) 試驗(yàn)在中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)資源與農(nóng)業(yè)區(qū)劃研究所人工氣候室進(jìn)行，白天溫度為28℃，夜間溫度為20℃，光照強(qiáng)度為500 μ m o l/(m2·s)。所用營(yíng)養(yǎng)液為霍格蘭營(yíng)養(yǎng)液[Ca(NO3)2·4H2O 1.18 g/L、KNO30.51 g/L、MgSO4·7H2O 0.49 g/L、KH2PO40.14 g/L、EDTA-Fe 0.036 g/L、H3BO32.86 mg/L、MnCl2·4H2O 1.81 mg/L、ZnSO4·7H2O 0.22 mg/L、CuSO4·5H2O 0.08 mg/L、H2MoO4·4H2O 0.09 mg/L][20]。試驗(yàn)設(shè)不添加腐殖酸 (CK)和分別添加分子量 ＞ 50 kDa(HAH)、10～50 kDa(HAM) 和 ＜ 10 kDa(HAL) 腐殖酸碳 10 mg/L 四個(gè)處理。

玉米種子經(jīng)70%的酒精表面消毒10 min，用蒸餾水洗凈后，在蒸餾水中浸泡24 h，轉(zhuǎn)移至石英砂中，在25℃下遮光環(huán)境中萌發(fā)3天，出苗后移入生長(zhǎng)室。兩葉一心時(shí)，精選出苗整齊的幼苗，去掉胚乳后移入盆缽中緩苗，每盆一株。緩苗營(yíng)養(yǎng)液pH為6.0 ± 0.5 (用1 mol/L的NaOH溶液和1 mol/L的HCl溶液調(diào)節(jié)營(yíng)養(yǎng)液pH)，2天后換成完全營(yíng)養(yǎng)液，每隔一天更換一次營(yíng)養(yǎng)液。試驗(yàn)設(shè)6次重復(fù)，隨機(jī)區(qū)組排列。

表1 供試腐殖酸分子量、元素含量和摩爾比Table 1 Molecular weight, elemental contents and mole ratios of the tested humic acids

表2 添加不同分子量腐殖酸處理對(duì)玉米干生物量的影響Table 2 Dry biomass of maize as affected by humic acids with different molecular weight

1.3 測(cè)定項(xiàng)目及方法

1.3.1 干物質(zhì)重 移苗20 d后，將玉米植株分為根、莖和葉，蒸餾水清洗后，于105℃下殺青30 min，65℃下烘干至恒重，稱(chēng)重。根冠比為根系干重與地上部干重的比值。

1.3.2 紅外光譜分析 將烘干的玉米植株根、莖和葉磨碎后過(guò)0.2 mm篩，分別稱(chēng)取1 mg樣品與200 mg溴化鉀 (KBr)，放入瑪瑙研缽中研磨均勻后進(jìn)行壓片，采用傅里葉變換紅外光譜儀 (型號(hào)VERTEX 70，德國(guó)Bruker公司) 檢測(cè)玉米植株根、莖和葉的光譜特征 (波數(shù)范圍為400～4000 cm-1，分辨率為4 cm-1，掃描次數(shù)為32次)。

1.4 數(shù)據(jù)處理與分析

試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用Excel 2003和Origin 9.0軟件進(jìn)行處理和作圖，采用SAS 9.1統(tǒng)計(jì)軟件Duncan方法進(jìn)行方差分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 腐殖酸處理對(duì)玉米干物質(zhì)重的影響

添加腐殖酸可增加玉米根、莖和葉的干物質(zhì)重，隨著腐殖酸分子量的增加，各器官干物質(zhì)重顯著降低 (表2)。與對(duì)照相比，腐殖酸處理的玉米根、莖和葉的干物質(zhì)重的平均值分別提高了91.07%、89.27%和88.53%。各腐殖酸處理之間比較，HAL處理的玉米根、莖和葉的干物質(zhì)重最大，與對(duì)照相比，分別提高了143.14%、123.41%和150.54%，其次為HAM處理，HAH處理玉米的根、莖和葉的干物質(zhì)重與對(duì)照相比，其提高幅度最小。

2.2 玉米根FTIR分析

腐殖酸處理下玉米植株主要基團(tuán)及其FTIR的峰值位置見(jiàn)表3。

腐殖酸處理和對(duì)照處理的根系紅外光譜的特征峰位置基本相同，但透射率不同 (圖1)。腐殖酸 (尤其是低分子量腐殖酸) 處理的玉米根系紅外光譜在3420 cm-1和1655 cm-1波數(shù)附近的透射率明顯低于對(duì)照，由此可知，添加腐殖酸可有效增加玉米根系碳水化合物、蛋白質(zhì)、多肽和氨基酸類(lèi)物質(zhì)的含量，其中，添加低分子量腐殖酸效果最佳。

2.3 玉米莖FTIR分析

由圖2可知，腐殖酸處理和對(duì)照處理玉米莖的紅外光譜特征峰對(duì)應(yīng)的波數(shù)基本相同。所有腐殖酸處理玉米莖的紅外光譜在3420 cm-1和1655 cm-1波數(shù)附近的透射率均高于對(duì)照處理，低分子腐殖酸表現(xiàn)尤為明顯。這表明，腐殖酸 (尤其是低分子量腐殖酸) 處理減少了碳水化合物、蛋白質(zhì)、多肽和氨基酸類(lèi)物質(zhì)在玉米莖部的積累。另外，HAH和HAM處理在1250 cm-1波長(zhǎng)附近的透射率要高于對(duì)照處理，而HAL處理在1250 cm-1波長(zhǎng)附近的透射率低于空白對(duì)照，這表明HAH和HAM處理減少了核酸在玉米莖部的積累，HAL處理增加了玉米莖部核酸的含量。

表3 主要功能團(tuán)、來(lái)源及其FTIR的峰值Table 3 Resource and wave length of main functional groups

圖1 不同分子量腐殖酸處理玉米根系FTIR光譜圖Fig. 1 FTIR spectra of maize roots under treatments of humic acids with different molecular weight

2.4 玉米葉FTIR分析

圖2 不同分子量腐殖酸處理玉米莖FTIR光譜圖Fig. 2 FTIR spectra of maize stems under treatments of humic acids with different molecular weight

圖3 不同分子量腐殖酸處理玉米葉FTIR光譜圖Fig. 3 FTIR spectra of maize leaf under treatments of humic acids with different molecular weight

由圖3可知，所有處理玉米葉的紅外光譜在3420、2920、1735、1655、1518、1380、1250 和1050 cm-1波數(shù)附近均有特征峰，腐殖酸各處理玉米葉的紅外光譜在以上各波長(zhǎng)處的透射率均低于對(duì)照處理，這說(shuō)明，腐殖酸處理能夠增加玉米葉片碳水化合物、酯類(lèi)物質(zhì)、蛋白質(zhì)、多肽、氨基酸類(lèi)物質(zhì)和核酸等的含量。各腐殖酸處理之間比較，HAL處理在各波長(zhǎng)處的透射率均為最低，這說(shuō)明小分子量腐殖酸處理更容易增加玉米葉片的碳水化合物、酯類(lèi)物質(zhì)、蛋白質(zhì)類(lèi)物質(zhì)和核酸等的含量。

3 討論與結(jié)論

外源添加腐殖酸可促進(jìn)玉米植株的生長(zhǎng)發(fā)育，增加玉米根、莖和葉的干物質(zhì)重。這主要是因?yàn)楦乘岷卸喾N活性官能團(tuán)，使其具有酸性、親水性、界面活性、陽(yáng)離子交換能力、絡(luò)合作用及吸附分散能力[30-32]，從而促進(jìn)作物根系對(duì)養(yǎng)分的吸收利用，并調(diào)控植物生長(zhǎng)發(fā)育的原生代謝和次生代謝過(guò)程。另外，腐殖酸本身就是一種天然有機(jī)高分子混合物，可為植物的生長(zhǎng)發(fā)育提供營(yíng)養(yǎng)。還有研究表明，腐殖酸能夠發(fā)揮生長(zhǎng)素活性，促進(jìn)H＋泵作用，降低細(xì)胞壁的pH值，激活細(xì)胞壁上的pH敏感酶和蛋白質(zhì)，使細(xì)胞壁疏松，以使植物生長(zhǎng)[33]。

不同分子量 (尤其是 ＜ 10 kDa分子量) 腐殖酸能夠增加玉米根系碳水化合物、蛋白質(zhì)、多肽和氨基酸類(lèi)物質(zhì)的含量，減少其在莖中的積累，增加玉米葉片碳水化合物、酯類(lèi)物質(zhì)、蛋白質(zhì)、多肽、氨基酸類(lèi)物質(zhì)和核酸等的含量，從而促進(jìn)玉米的生長(zhǎng)發(fā)育。這可能是因?yàn)?，腐殖?(尤其是小分子量腐殖酸) 可上調(diào)或下調(diào)某些基因，并通過(guò)復(fù)雜的轉(zhuǎn)錄網(wǎng)絡(luò)影響植物的原生代謝過(guò)程，以影響不同器官蛋白質(zhì)、碳水化合物和脂肪等的含量[5,34]。

小分子量 (＜ 10 kDa) 腐殖酸能更好地促進(jìn)玉米的生長(zhǎng)發(fā)育。這可能是因?yàn)樾∮?0 kDa分子量腐殖酸因分子量低且含較高含量的羧基和酚羥基，因而具有更好的金屬絡(luò)合能力，從而改善了營(yíng)養(yǎng)物同化和玉米代謝能力[35]。另外，腐殖酸本身就具有營(yíng)養(yǎng)功能，＜ 10 kDa分子量腐殖酸更易于進(jìn)入植物體內(nèi)，促進(jìn)植物生長(zhǎng)。而大分子量 (＞ 50 kDa) 腐殖酸可能因具有較多穩(wěn)定的結(jié)構(gòu)和成分，有更好的殘留效應(yīng)[36]。Piccolo等的研究表明，只有小分子量腐殖酸表現(xiàn)出了類(lèi)激素活性，并且分子量越小，類(lèi)激素活性越大。此外，低分子量腐殖酸具有較高含量的酸性官能團(tuán)，因此可促進(jìn)植物的生長(zhǎng)發(fā)育[5]，這一結(jié)論也解釋了本研究結(jié)果，值得進(jìn)一步研究。

總之，利用FTIR技術(shù)可揭示腐殖酸處理下玉米植株中不同器官組分的變化。腐殖酸處理能夠增加玉米根系碳水化合物、蛋白質(zhì)、多肽和氨基酸類(lèi)物質(zhì)的含量，減少其在莖中的積累，增加玉米葉片碳水化合物、酯類(lèi)物質(zhì)、蛋白質(zhì)、多肽、氨基酸類(lèi)物質(zhì)和核酸等的含量，低分子量腐殖酸表現(xiàn)尤為明顯。