周智友，許張柯，張慶華，劉孟熒，黎秋玲，李漢廣

(江西農(nóng)業(yè)大學(xué) 生物科學(xué)與工程學(xué)院，江西農(nóng)業(yè)微生物資源開發(fā)與利用工程實驗室，江西省菌物資源保護與利用重點實驗室，江西 南昌，330045)

化石燃料是目前國際上的主要能源物質(zhì)，但由于其儲存量的不斷下降及世界各國對環(huán)境保護意識的不斷增加，尋找可替代化石能源的新型環(huán)保性能源物質(zhì)近年來成為能源領(lǐng)域研究的熱點[1-3]。生物丁醇是一種全新的、可再生的綠色生物能源，與其他可代替汽油的燃料(如乙醇)相比，丁醇具有許多優(yōu)勢，如燃燒值高、疏水性強，被認為是最具有潛力的第二代可再生的綠色新型生物燃料[4-5]。

丙酮丁醇發(fā)酵(丙酮acetone、丁醇butanol、乙醇ethanol，簡稱ABE)的研究至今已有150多年的歷史，在20世紀80年代以前，發(fā)酵法生產(chǎn)生物丁醇工業(yè)是僅次于生物乙醇的第二大發(fā)酵工業(yè)[6]，然而由于石化產(chǎn)業(yè)的快速發(fā)展、原料成本的上升以及丁醇對細胞的毒性作用導(dǎo)致生物法獲取丁醇逐漸被化學(xué)合成法所取代。近年來隨著全球氣候的惡化和能源價格的不斷攀升，發(fā)展環(huán)境友好型經(jīng)濟是將來必然的選擇，因此發(fā)酵法生產(chǎn)丁醇由于其環(huán)保、可再生等優(yōu)勢迅速成為生物燃料和生物質(zhì)能源領(lǐng)域的一個研究熱點[7]。

目前ABE發(fā)酵常用菌種主要包括Clostridiumacetobutylicum、Clostridiumbeijerinckii、Clostridiumsaccharoperbutylacetonicum和Clostridiumsaccharobutylicum四種菌種[8]。其中在工業(yè)上最為常用的菌株是拜氏梭菌(Clostridiumbeijerainckii)和丙酮丁醇梭菌(Clostridiumacetobutylicum)[9]。在ABE發(fā)酵產(chǎn)物中溶劑(特別是丁醇)對生產(chǎn)菌株具有抑制甚至毒害作用[10]。有研究表明，當(dāng)發(fā)酵液中丁醇濃度達13～14 g/L 時菌體的生長會受到抑制作用[11]。而產(chǎn)生抑制的結(jié)果必將導(dǎo)致ABE發(fā)酵結(jié)束時出現(xiàn)低產(chǎn)物濃度與低生產(chǎn)強度現(xiàn)象。因此，篩選出高丁醇耐受性的優(yōu)良菌株是解決此現(xiàn)象的有效方法之一[12]。

為選育出高丁醇耐受性、高丁醇產(chǎn)量菌株，本文采用自行設(shè)計的“三明治”篩選方法從74份土樣中分離篩選出4株較高丁醇耐受性菌株，并對其中發(fā)酵性能最好的菌株a914進行了16S rDNA鑒定，最后對該菌株的發(fā)酵性能進行了初步研究，以期提高ABE(主要是丁醇)的生產(chǎn)強度，本論文的研究結(jié)果可為快速、簡捷地選育出高丁醇耐受性丁醇生產(chǎn)菌株提供較為有益的初步探索。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

葡萄糖(工業(yè)級)，國藥集團化學(xué)試劑有限公司；可溶性淀粉(分析純)，上海笛柏化學(xué)品技術(shù)有限公司；玉米粉、木薯粉(食品級)，市售；刃天青(分析純)，國藥集團化學(xué)試劑有限公司；異丁醇、正丁醇(色譜純)，國藥集團化學(xué)試劑有限公司；酵母浸粉(生化試劑)，國藥集團化學(xué)試劑有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

厭氧盒、厭氧袋(2.5L)，日本三菱公司；GC7890B型氣相色譜儀，安捷倫科技有限公司；高速離心機，江陰濱江醫(yī)療設(shè)備廠；PHS-3C pH計、電子天平，德國Sartirius公司；厭氧培養(yǎng)試管(18 mm×180 mm)，國藥集團化學(xué)試劑有限公司。

1.3 培養(yǎng)基

1.3.1 富集培養(yǎng)基

將集市購買的新鮮土豆切成大小為0.2 cm3的土豆塊莖，若不及時使用則存放于4 ℃冰箱中備用。

1.3.2 分離純化培養(yǎng)基

分離純化培養(yǎng)基(g/L)：葡萄糖40.0，可溶性淀粉40.0，酵母浸粉3.0，胰蛋白胨6.0，KH2PO41.0，K2HPO41.0， FeSO4·7H2O 0.01，MgSO4·7H2O 0.2，將pH調(diào)至6.0，瓊脂20.0，蒸餾水1.0 L，121 ℃熱壓滅菌20 min。

1.3.3 篩選培養(yǎng)基

在分離純化的培養(yǎng)基基礎(chǔ)上加入0.02 g/L的刃天青及8～10 g/L的異丁醇。

1.3.4 發(fā)酵培養(yǎng)基

(1)P2培養(yǎng)基(g/L)：葡萄糖60.0，酵母粉3.0，KH2PO41.0，K2HPO41.0，CaCO33.0，121 ℃熱壓滅菌20 min，無機鹽溶液(MgSO4·7H2O 0.02、FeSO4·7H2O 0.01、NaCl 0.01)，維生素(對氨基甲苯0.001、維生素B10.001、生物素0.000 01)，用0.22 μm的微孔濾膜進行過濾除菌。

(2)玉米粉發(fā)酵培養(yǎng)基：取80.0 g的玉米粉加入適量的蒸餾水(約1.3 L)糊化30 min，糊化結(jié)束后用蒸餾水定容至1.0 L，121 ℃熱壓滅菌20 min。

(3)木薯粉發(fā)酵培養(yǎng)基：干的木薯條經(jīng)粉碎并過30目篩，取80.0 g的木薯粉加入適量的蒸餾水(約1.3 L)糊化20 min，糊化結(jié)束后用蒸餾水定容至1.0 L，121 ℃熱壓滅菌20 min。

1.4 產(chǎn)丙酮丁醇微生物的分離篩選

1.4.1 樣品的采集

樣品為采自距離地表15～25 cm的土壤，每份樣品大約100 g，將樣品裝入無菌的密封袋中(記錄好采樣時間、地點等信息)并盡快進行分離篩選。

1.4.2 富集培養(yǎng)

樣品采集完成之后利用“三明治”的篩選方法進行富集培養(yǎng)[13]，“三明治”的篩選方法：取1～2 g的土樣放入?yún)捬跗恐?，再向厭氧瓶?dāng)中加入12 g/L的異丁醇將樣品和土豆浸沒，在100 ℃的沸水浴中熱激120 s，冷卻后于37 ℃條件下進行培養(yǎng)至大量產(chǎn)氣并出現(xiàn)醪蓋現(xiàn)象。

1.4.3 可視化的分離篩選

在固體分離純化培養(yǎng)基中加入0.02 g/L的刃天青(氧化還原指示劑)[14]以及8 g/L的異丁醇，并在培養(yǎng)基當(dāng)中加入40 g/L的淀粉，以此為丙酮丁醇篩選平板，以篩選出高丁醇耐受性及具備產(chǎn)淀粉酶能力菌株。

1.4.4 分離純化

將大量產(chǎn)氣并出現(xiàn)醪蓋現(xiàn)象的厭氧瓶挑出，用移液管取1 mL的樣液，將其接入玉米醪液或P2培養(yǎng)基中，37 ℃靜置培養(yǎng)，將略有溶劑味并大量產(chǎn)氣且出現(xiàn)醪蓋現(xiàn)象的厭氧管取出，涂布于固體分離純化培養(yǎng)基中，并將平板置于37 ℃條件下厭氧培養(yǎng)至長出單菌落，將長出的單菌落接入?yún)捬跖囵B(yǎng)試管中進行ABE發(fā)酵。

1.5 測定方法

1.5.1 總糖的測定

發(fā)酵培養(yǎng)基初始總糖的濃度利用硫酸-苯酚法進行測定[15-16]。

1.5.2 溶劑的測定

取發(fā)酵液5 mL在 8 000 r/min條件下離心5 min，然后將1.0 mL上清液和4.0 mL異丁醇溶液(濃度為1.21 g/L)混勻，然后采用氣相色譜儀進行檢測[17]。

2 結(jié)果與討論

2.1 菌株a914的分子生物學(xué)鑒定

分子生物學(xué)鑒定是指從遺傳學(xué)的角度利用分子生物學(xué)的方法闡明微生物種群之間的進化關(guān)系。GIOVANNONI等[18]首次用PCR產(chǎn)物對細菌的16S rDNA定位檢測細菌多樣，因此對未知細菌的16S rDNA進行測序成為細菌鑒定的一個重要依據(jù)。

將分離純化得到的菌株a914送至南昌科暢生物科技有限公司進行16S rDNA測序，菌株a914的DNA用Omega細菌基因組DNA抽提試劑盒進行提取，用細菌16S rDNA擴增引物27F和1492R擴增菌株a914的16S rDNA片段，其16S rDNA PCR產(chǎn)物電泳圖譜如圖1所示。

圖1 菌株a914 16S rDNA PCR產(chǎn)物電泳圖譜Fig.1 Electrophoretic pattern of 16S rDNA PCR product of a914 strain

登入NCBI，將菌株a914的16S rDNA序列與GENEBANK數(shù)據(jù)庫中BLAST軟件進行相似性比對，發(fā)現(xiàn)其與Clostridiumbeijerinckiistrain JCM 1390相似性達99%，選取相似性高的序列并下載，利用Mega5.1軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，通過1 000次bootstrap重復(fù)驗證系統(tǒng)發(fā)育樹的穩(wěn)定性，系統(tǒng)發(fā)育樹如圖2所示，再根據(jù)其發(fā)酵特性及生理生化特點，最終將菌株a914確定為拜氏梭菌(Clostridiumbeijerinckii)。

圖2 基于菌株a914 16S rDNA序列同源性構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.2 Phylogenetic tree constructed based on 16S rDNA sequence homology of strain a914

2.2 不同碳源對丙酮丁醇發(fā)酵的影響

在傳統(tǒng)的ABE發(fā)酵過程中，主要以玉米、小麥等糧食作物作為發(fā)酵原料[19-22]，本文為研究不同碳源對菌株a914發(fā)酵的影響，以4種不同的碳源(葡萄糖、蔗糖、木薯粉、玉米粉)作為發(fā)酵原料，其實試驗結(jié)果如表1所示，葡萄糖發(fā)酵培養(yǎng)基與蔗糖發(fā)酵培養(yǎng)基除碳源不同外其他成分完全相同(添加量60 g/L)，木薯粉發(fā)酵培養(yǎng)基與玉米粉發(fā)酵培養(yǎng)基直接糊化而成(添加量80 g/L)，不添加任何其他營養(yǎng)物質(zhì)。

表1 不同碳源對丙酮丁醇發(fā)酵的影響Table 1 Effect of different carbon sources on acetone butanol and ethanol fermentation

從表1可以看出，菌株a914以葡萄糖為碳源時丁醇產(chǎn)量達到5.44 g/L，總?cè)軇┊a(chǎn)量達到8.26 g/L，而以蔗糖為碳源丁醇產(chǎn)量為4.16 g/L，總?cè)軇┊a(chǎn)量為5.42 g/L，以葡萄糖為碳源時丁醇的得率均高于以其他3種碳源時丁醇的得率。而以木薯粉和玉米粉為碳源時的丁醇產(chǎn)量分別為3.02 g/L和4.03 g/L，總?cè)軇┓謩e為4.34 g/L和5.89 g/L。當(dāng)分別以玉米粉和木薯粉為碳源時，玉米粉的丁醇和總?cè)軇┑漠a(chǎn)量高于木薯粉，可能的原因是玉米粉含有較豐富的營養(yǎng)物質(zhì)，而木薯粉的營養(yǎng)物質(zhì)含量比較匱乏。

根據(jù)市場調(diào)查，目前，葡萄糖、蔗糖、木薯粉、玉米粉的價格為人民幣(3 800～4 500)元/t、(3 500～4 000) 元/t、(950～1 100)元/t、(2 000～2 500)元/t。從本試驗可以看出每生產(chǎn)1 t丁醇需要葡萄糖、蔗糖、木薯粉、玉米粉的量為10.98、14.49、26.49、14.92 t，以葡萄糖、蔗糖、木薯粉、玉米粉為培養(yǎng)基時的原料成本為人民幣(41 729～49 410)元/t、￥50 715～57 960)元/t、(25 165～29 139)元/t、(29 840～37 300)元/t。因此，從原料成本和糧食安全等方面考慮，木薯作為非糧作物成本最低，若能夠提高以木薯粉為原料時丁醇的產(chǎn)量，木薯粉將是這4種碳源物質(zhì)中最為理想的發(fā)酵原料(本文以下試驗均以木薯粉為發(fā)酵原料)。

2.3 不同氮源對丙酮丁醇發(fā)酵的影響

氮源主要用于合成含氮目的產(chǎn)物和菌體細胞，而無機氮是微生物生長過程中的速效氮源，有機氮在菌體生長過程中為菌體提供氮元素和必要的生長因子[23]。最適氮源的加入可以提升菌體的生長和丁醇的產(chǎn)量，本試驗考察了5種不同的氮源(乙酸銨、酵母粉、硝酸銨、硫酸銨、胰蛋白胨)對菌株a914產(chǎn)丁醇的影響，添加量均為3 g/L，其結(jié)果如圖3所示。

從圖4可以看出，向培養(yǎng)基中加入不同的氮源，其發(fā)酵結(jié)果各不相同，即丁醇和總?cè)軇┑漠a(chǎn)量各不相同，以酵母粉為氮源時，丁醇和總?cè)軇┑漠a(chǎn)量最高，分別達到6.54和9.65 g/L，與其他氮源相比，丁醇和總?cè)軇┊a(chǎn)量存在顯著性差異(P<0.05)。而以乙酸銨、硫酸銨和硝酸銨為氮源時，總?cè)軇┊a(chǎn)量差異不顯著(P>0.05)，且丁醇和總?cè)軇┊a(chǎn)量都低于以酵母浸粉為氮源的產(chǎn)量，因此從本試驗的結(jié)果可知，酵母浸粉可以作為后繼試驗最優(yōu)的氮源。

2.4 不同pH調(diào)節(jié)劑對丙酮丁醇發(fā)酵的影響

過低的pH值對菌體的生長存在抑制作用是因為其會影響菌體細胞表面的電荷分布、細胞膜的通透性。譚秀花[21]利用丙酮丁醇梭菌(Clostridiumacetobutylicum)進行丁醇發(fā)酵試驗時發(fā)現(xiàn)，當(dāng)pH低于4.0時，細胞停止生長，因此在丙酮丁醇發(fā)酵過程中預(yù)先在培養(yǎng)基加入適當(dāng)pH調(diào)節(jié)劑可以調(diào)整發(fā)酵液的pH值，避免在發(fā)酵過程中pH值過度下降，從而提高丁醇的產(chǎn)量，本文考察了5種不同pH調(diào)節(jié)劑(Na2CO3、NaHCO3、CaCO3、K2HPO4/KH2PO4、NH3·H2O)對菌株a914產(chǎn)丁醇的影響，添加量均為3.0 g/L，其結(jié)果如圖4所示。

圖4 不同pH調(diào)節(jié)劑對丙酮丁醇發(fā)酵的影響Fig.4 Effect of different pH regulators on acetone butanol and ethanol fermentation

由圖4可以看出，當(dāng)以CaCO3為pH調(diào)節(jié)劑時，丁醇和總?cè)軇┊a(chǎn)量分別達到6.73 g/L和9.83 g/L，且與其他pH調(diào)節(jié)劑相比，丁醇和總?cè)軇┊a(chǎn)量存在顯著性差異(P<0.05)；其次當(dāng)用K2HPO4/KH2PO4時，丁醇和總?cè)軇┊a(chǎn)量為6.02 g/L和8.72 g/L，但與NaHCO3為pH調(diào)節(jié)劑時丁醇和總?cè)軇┊a(chǎn)量差異不顯著(P>0.05)。以NH3·H2O為pH調(diào)節(jié)劑時丁醇和總?cè)軇┑漠a(chǎn)量為4.32 g/L和6.51 g/L，結(jié)果表明兩者都明顯低于CaCO3為pH調(diào)節(jié)劑的產(chǎn)量，究其原因可能是以NH3·H2O為pH調(diào)節(jié)劑時其初始的pH過高不利于菌體的生長，因此從本試驗的結(jié)果可知，CaCO3可作為最適pH調(diào)節(jié)劑。

2.5 不同CaCO3濃度對丙酮丁醇發(fā)酵的影響

CaCO3是比較常見的pH調(diào)節(jié)劑，當(dāng)其與菌體產(chǎn)生的酸發(fā)生反應(yīng)后不僅為菌體提高Ca2+，同時能起到恒定pH的作用[24]。為研究不同濃度的CaCO3對丙酮丁醇發(fā)酵的影響，依次向木薯粉培養(yǎng)基中加入0、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0 g/L的CaCO3，其試驗結(jié)果如圖5所示。

圖5 不同質(zhì)量濃度碳酸鈣對丙酮丁醇發(fā)酵的影響Fig.5 Effect of different concentrations of calcium carbonate on acetone butanol and ethanol fermentation

從圖5中可以看出，當(dāng)CaCO3質(zhì)量濃度為3.0 g/L，時丁醇和總?cè)軇┑漠a(chǎn)量為6.73 g/L和9.83 g/L；而當(dāng)CaCO3質(zhì)量濃度為4.0 g/L，時丁醇和總?cè)軇┑漠a(chǎn)量達到最大，分別為7.27 g/L和10.32 g/L，與對照組相比分別提高了310.68%和250.73%。隨著CaCO3添加量的繼續(xù)增加，丁醇和總?cè)軇┑漠a(chǎn)量之間無明顯變化。通過對數(shù)據(jù)進行Duncan氏新復(fù)極差法檢驗發(fā)現(xiàn)當(dāng)CaCO3添加量為3.0、4.0、5.0、6.0 g/L時丁醇和總?cè)軇┊a(chǎn)量之間差異不顯著(P>0.05)，在丁醇發(fā)酵初期會大量產(chǎn)生有機酸(乙酸、丁酸等)，從而導(dǎo)致發(fā)酵過程中pH值快速下降，當(dāng)發(fā)酵液中存在CaCO3時，可以中和乙酸、丁酸等酸性物質(zhì)，起到緩沖pH的作用，鐘潔[25]在進行CaCO3對丁醇發(fā)酵影響試驗時發(fā)現(xiàn)過量的CaCO3并不會對丁醇的產(chǎn)量造成太大的變化，這與本試驗的結(jié)果一致。因此從本試驗的結(jié)果以及從原料成本考慮，在培養(yǎng)基當(dāng)中添加3.0 g/L的CaCO3最佳。

3 結(jié)論

本試驗采用“三明治”篩選方法從74份土樣中分離篩選出4株高丁醇耐受性菌株，其中菌株a914發(fā)酵性能最佳，根據(jù)菌株a914的發(fā)酵特性、生理生化特征及分子生物學(xué)的鑒定結(jié)果，最終將菌株a914確定為拜氏梭菌(Clostridiumbeijerinckii)。然后對菌株a914產(chǎn)溶劑性能進行了初步研究，具體研究了不同碳源、氮源及pH調(diào)節(jié)劑對其產(chǎn)溶劑的影響。結(jié)果表明在最優(yōu)的條件下，丁醇和總?cè)軇┊a(chǎn)量分別達到6.73 g/L 和9.83 g/L。本試實驗結(jié)果表明“三明治”的篩選方法是一種快速有效的篩選模式，可為通過該種方法獲得更多的溶劑耐受性菌株提供有益的參考。