仲玉備，陳歷俊，趙軍英，董學(xué)艷，李菊芳，劉 斌，常蘭蘭，陳樹興,*，姜鐵民,*

（1.河南科技大學(xué)食品與生物工程學(xué)院，河南 洛陽 471023；2.國家母嬰乳品健康工程技術(shù)研究中心，北京 100163；3.北京市乳品工程技術(shù)研究中心，北京 100163）

母乳是6 個月內(nèi)嬰兒最理想的天然食品，世界衛(wèi)生組織提倡0～6 個月嬰兒母乳喂養(yǎng)，且繼續(xù)母乳喂養(yǎng)至1 歲以上[1]。母乳喂養(yǎng)不僅有助于嬰兒生長發(fā)育，增進(jìn)母子感情，還可促進(jìn)母親身體恢復(fù)[2]。母乳中含有3%～5%的脂肪，是嬰兒營養(yǎng)的重要組成，可為嬰幼兒生長發(fā)育提供45%～60%的能量，并且母乳脂肪酸作為生物活性物質(zhì)影響嬰兒中樞神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育[3]，尤其是多不飽和脂肪酸（polyunsaturated fatty acid，PUFA）與嬰兒的生長發(fā)育直接相關(guān)，如作為PUFA前體物質(zhì)的亞油酸（linoleic acid，LA）、α-亞麻酸（α-linolenic acid，ALA）可預(yù)防過敏和感染，并對嬰兒視覺和認(rèn)知發(fā)展具有重要意義，二十碳五烯酸（eicosapentaenoic acid，EPA）可以幫助降低膽固醇含量，對心腦血管疾病有預(yù)防和治療作用，還可促進(jìn)人體內(nèi)飽和脂肪酸代謝，二十二碳六烯酸（docosahexaenoic acid，DHA）和花生四烯酸（arachidonic acid，AA）作為大腦中的主要結(jié)構(gòu)性脂肪酸，在健康人腦組織的脂肪結(jié)構(gòu)中分別占25%和15%，充足的DHA和AA供給是嬰兒生長發(fā)育，尤其是神經(jīng)系統(tǒng)及視力發(fā)育的重要保障[4-5]。

母乳脂肪酸的組成隨泌乳期、母親膳食、所在地區(qū)而變化[6-10]，還可能受胎次、孕周、母親遺傳背景等多種因素的影響[11-12]，但關(guān)于此方面的研究甚少。目前鮮見乳母血型、孕前身體質(zhì)量指數(shù)（body mass index，BMI）、分娩方式、嬰兒胎次等多個因素與母乳中重要PUFA關(guān)系的研究。因此，本實(shí)驗(yàn)通過氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用（gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS）技術(shù)對河南洛陽地區(qū)不同泌乳期母乳中脂肪酸的組成和含量進(jìn)行系統(tǒng)研究，并進(jìn)一步分析乳母血型、生育年齡、分娩方式和嬰兒性別、胎次等對成熟乳中重要PUFA含量的影響，以期為科學(xué)模擬母乳開發(fā)嬰幼兒配方食品及開展泌乳期母嬰個性化膳食攝入研究提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 研究對象與乳樣采集

于2015年10月—2016年1月，在河南洛陽5111醫(yī)院、電力醫(yī)院婦產(chǎn)科按“知情同意，自愿參加”原則，招募居住河南洛陽不低于1 a，分娩后仍居住在本地，無特殊偏食習(xí)慣，嬰兒足月分娩、無先天性及遺傳性疾病的健康漢族乳母，并簽署知情同意書，定時用吸奶器采初乳（0～5 d）、過渡乳（12～14 d）、成熟乳（1～6 月），并放入－80 ℃超低溫冰箱中進(jìn)行冷凍保存，共收集樣本240 份。

1.2 試劑與儀器

37 種脂肪酸甲酯混標(biāo) 美國Sigma公司；去離子水及其他試劑均為色譜純。

MIRIS HMA型母乳分析儀 瑞典MIRIS AB公司；TRACE1300-ISQ GC-MS聯(lián)用儀 賽默飛世爾科技（中國）有限公司；高速冷凍離心機(jī) 美國Sigma公司；旋渦振蕩器 美國Scilogex公司；恒溫水浴鍋 余姚市東方電工儀器廠。

1.3 方法

1.3.1 母乳脂肪含量測定

母乳脂肪含量采用母乳分析儀進(jìn)行測定。

1.3.2 脂肪酸甲酯化

采用鹽酸-甲醇法。取200 μL母乳，加入0.5 mol/L的鹽酸-甲醇溶液5 mL，加入2 mL正己烷，2 mL甲醇，振蕩混勻，在80 ℃恒溫水浴振蕩2 h，取出試管用流動水冷卻至室溫后，加入2 mL去離子水，振蕩混勻后，于5 000 r/min冷凍離心5 min，吸取1 mL上層清液（酯層溶液）于進(jìn)樣瓶，進(jìn)行GC-MS檢測，檢測前于－20 ℃保存[13]。

1.3.3 色譜條件

色譜柱：HP-88氣相色譜柱（100 m×0.25 mm，0.20 μm）；升溫程序：初始溫度60 ℃，保持5 min，以8 ℃/min升至160 ℃，然后以4 ℃/min升至200 ℃，保持5 min，最后以3 ℃/min升至240 ℃，保持5 min；進(jìn)樣器Thermo Scientific TriPlus RSH自動進(jìn)樣器；進(jìn)樣口溫度200 ℃；恒流速模式1 mL/min；進(jìn)樣量1 μL；分流比10∶1；載氣N2。

1.3.4 質(zhì)譜條件

電子電離源；離子源溫度280 ℃；傳輸線溫度240 ℃；四極桿溫度150 ℃；四極桿質(zhì)量掃描范圍m/z35～400。

1.3.5 脂肪酸定性定量方法

根據(jù)脂肪酸甲酯的質(zhì)譜特征離子和保留時間定性，根據(jù)已知質(zhì)量的脂肪酸甲酯混標(biāo)定量。37 種脂肪酸甲酯混標(biāo)總離子流色譜如圖1所示、母乳樣品（LY-DL003-3）的脂肪酸甲酯總離子流色譜如圖2所示。

圖1 37 種脂肪酸甲酯混標(biāo)GC-MS總離子流色譜圖Fig. 1 GC-MS total ion chromatograms of mixed standard of 37 fatty acid methyl esters

圖2 母乳樣品（LY-DL003-3）中脂肪酸甲酯GC-MS總離子流色譜圖Fig. 2 GC-MS total ion chromatogram of human milk sample(LY-DL003-3)

1.4 數(shù)據(jù)分析

應(yīng)用SPSS 23.0軟件對乳母一般資料進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)描述；母乳基本信息中定量資料為非正態(tài)分布，數(shù)據(jù)用Median±IQR表示；脂肪及脂肪酸數(shù)據(jù)均通過正態(tài)性檢驗(yàn)，數(shù)據(jù)用 ±s表示；多組數(shù)據(jù)間比較采用方差分析法，兩組數(shù)據(jù)間比較采用t檢驗(yàn)，正態(tài)分布變量用Pearson相關(guān)分析。將單因素分析中對母乳中重要PUFA含量有顯著影響的因素，納入線性回歸分析[14]。所有統(tǒng)計檢驗(yàn)均為雙側(cè)檢驗(yàn)，P＜0.05，差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 研究對象基本信息

乳母的生育年齡、體質(zhì)量、身高、孕前BMI、血型及嬰兒出生體質(zhì)量、胎次等資料統(tǒng)計結(jié)果如表1所示。

表1 研究對象基本信息Table 1 Basic information about the study objects

2.2 母乳中脂肪含量

表2 不同泌乳階段母乳脂肪質(zhì)量濃度Table 2 Fat contents of breast milk at different lactation stages g/100 mL

由表2可知，初乳（0～5 d）中脂肪含量最低，過渡乳（12～14 d）中達(dá)到最高，初乳、過渡乳、成熟乳（1～6 月）中脂肪含量差異顯著。

2.3 母乳中脂肪酸含量

本研究測定初乳、過渡乳、成熟乳中脂肪酸的組成及相對含量，共檢測到37 種脂肪酸，多以偶數(shù)碳原子脂肪酸形式存在，其中飽和脂肪酸（saturated fatty acid，SFA）17 種，單不飽和脂肪酸（monounsaturated fatty acid，MUFA）9 種，n-3系列PUFA 4 種，n-6系列PUFA 7種。如表3所示，總SFA含量隨著泌乳期的延長而增加，并且維持在26.50%～46.62%范圍內(nèi)，在初乳與成熟乳中差異顯著；中鏈飽和脂肪酸（medium chain saturated fatty acids，MCSFA）C10:0、C12:0在初乳中的含量較過渡乳、成熟乳低，差異顯著；另外，C4:0、C11:0、C14:0、C15:0、C17:0、C20:0、C21:0、C24:0含量在各組間無顯著差異?？侻UFA質(zhì)量分?jǐn)?shù)在初乳中最高為37.14%，成熟乳中最低為33.67%；油酸是MUFA主要組成成分，隨著泌乳期的延長含量逐漸降低，但差異不顯著?？侾UFA質(zhì)量分?jǐn)?shù)在初乳、過渡乳、成熟乳中分別為27.68%、27.31%、28.72%，組間差異不顯著；初乳、過渡乳中n-6系列PUFA含量均較成熟乳中低，并且差異顯著；LA是n-6系列PUFA的主要組成成分，在初乳、過渡乳中含量均顯著低于成熟乳；AA質(zhì)量分?jǐn)?shù)在初乳中最高為0.83%，成熟乳中最低為0.66%；總n-3系列PUFA含量在各組間無顯著差異，其中ALA、EPA在初乳中質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為1.85%、0.05%，均比過渡乳、成熟乳中的含量低，但是DHA含量在初乳中最高為0.68%。

表3 不同泌乳期母乳脂肪酸測定結(jié)果Table 3 Fatty acid composition of breast milk at different lactation stages%

續(xù)表3

2.4 成熟乳中5 種重要PUFA影響因素分析

2.4.1 乳母年齡對母乳PUFA的影響

表4 生育年齡與母乳中5 種PUFA相關(guān)性Table 4 Correlation analysis of childbearing age and the contents of five PUFAs in breast milk

如表4所示，乳母年齡與母乳中5 種PUFA含量之間不存在相關(guān)性。

2.4.2 乳母孕周對母乳PUFA的影響

表5 孕周與母乳中5 種PUFA相關(guān)性Table 5 Correlation analysis of gestational age and the contents of five PUFAs in breast milk

由表5可知，足月胎兒孕周的長短與母乳中5 種PUFA之間不存在相關(guān)性。

2.4.3 嬰兒胎次對母乳PUFA的影響

表6 嬰兒胎次對母乳5 種PUFA影響Table 6 Effect of parity on the contents of five PUFAs in breast milk

根據(jù)嬰兒的胎次，將納入研究的乳母分為2 組，頭胎、二胎，由表6可知，兩組間差異無統(tǒng)計學(xué)意義，但生頭胎的乳母母乳中5 種PUFA的含量均比生二胎的高。

2.4.4 嬰兒性別對母乳PUFA的影響

根據(jù)乳母分娩的嬰兒性別，將納入研究的乳母分為2 組，男嬰、女嬰組，由表7可知，乳母母乳中LA含量在男女嬰組間有顯著差異，并且女嬰組含量高于男嬰組。ALA、AA、EPA、DHA含量在男女嬰組間差異無統(tǒng)計學(xué)意義。

表7 嬰兒性別對母乳5 種PUFA的影響Table 7 Effect of infant sex on the contents of five PUFAs in breast milk

2.4.5 分娩方式對母乳PUFA的影響

將納入研究的乳母按分娩方式分為順產(chǎn)、剖腹產(chǎn)2 組，由表8可知，剖腹產(chǎn)組5 種PUFA含量均比順產(chǎn)組高，但差異不顯著。

表8 分娩方式對母乳5 種PUFA的影響Table 8 Effect of delivery modes on the contents of five PUFAs in breast milk

2.4.6 乳母血型對母乳PUFA的影響

根據(jù)乳母血型，將納入研究的乳母分為4 組，A型、B型、AB型、O型，由表9可知，AB血型乳母母乳中AA、EPA、DHA含量均高于其他血型，并且具有統(tǒng)計學(xué)意義，LA、ALA含量在不同血型乳母母乳中差異不顯著。

表9 乳母血型對母乳5 種PUFA的影響Table 9 Effect of maternal blood types on the contents of PUFAs in breast milk

2.4.7 乳母產(chǎn)前BMI對母乳PUFA的影響

依據(jù)“中國肥胖問題工作組”提出我國成人BMI標(biāo)準(zhǔn)，將納入研究的乳母按孕前BMI分成4 組，消瘦（≤18.5）、正常（18.5～23.9）、超重（24～27.9）、肥胖（≥28）。由表10可知，產(chǎn)前超重組乳母母乳中ALA、DHA含量均高于消瘦、正常、肥胖組，并且差異顯著，LA、AA、EPA含量在4 組間差異不顯著。

表10 乳母產(chǎn)前BMI對母乳5 種PUFA的影響Table 10 Effect of prenatal BMI on the contents of five PUFAs in breast milk

以母乳LA含量（Y1）為因變量，以單因素分析得到的對其有顯著影響的嬰兒性別（X1）為自變量，進(jìn)行線性回歸分析，得回歸方程為：Y1=27.160－2.487X1，X1=1（女）、2（男），R2=0.052，P=0.022，說明LA水平的變異可由自變量解釋5.2%，男嬰乳母母乳中LA含量低于女嬰母乳中的，與單因素分析結(jié)果一致；以母乳ALA含量（Y2）為因變量，以單因素分析中對其有顯著影響的乳母孕前BMI（X2）為自變量，進(jìn)行線性回歸，得回歸方程為：Y2=1.646＋0.405X2，X2=1（≤18.5）、2（18.5～23.9）、3（24～27.9）、4（≥28），R2=0.045，P=0.036，說明ALA水平的變異可由自變量解釋4.5%，BMI與母乳ALA含量呈正相關(guān)，整體BMI越大，ALA含量越大，與單因素分析結(jié)果基本一致；以母乳DHA含量（Y5）為因變量，以單因素分析中對其有顯著影響的乳母孕前BMI（X2）、乳母血型（X3）為自變量做多元線性回歸，納入方程的只有乳母孕前BMI（X2），得到回歸方程Y5=0.188＋0.079X2，X2=1（≤18.5）、2（18.5～23.9）、3（24～27.9）、4（≥28），R2=0.089，P=0.024，說明DHA水平的變異可由自變量解釋8.9%，BMI與DHA含量呈正相關(guān)，整體與單因素分析結(jié)果一致；以母乳AA含量（Y3）為因變量，以單因素分析有顯著影響的乳母血型（X3）為自變量，進(jìn)行回歸分析，得回歸方程：Y3=0.616＋0.002X3，X3=1（A）、2（B）、3（AB）、4（O），R2=0.026，P=0.917，P值大于0.05，說明AA和乳母血型間線性關(guān)系不顯著；以母乳中EPA含量（Y4）為因變量，以單因素分析有顯著影響的乳母血型（X3）為自變量，進(jìn)行回歸分析，得回歸方程：Y4=0.188＋0.011X3，X3=1（A）、2（B）、3（AB）、4（O），R2=0.001，P=0.281，P值大于0.05，說明EPA和乳母血型間線性關(guān)系不顯著。

3 討 論

本研究采用GC-MS聯(lián)用技術(shù)測定河南洛陽地區(qū)母乳脂肪酸的組成，并探討乳母母乳中對嬰兒發(fā)育具有重要作用的5 種PUFA LA、ALA、AA、EPA和DHA含量的影響因素。

母乳中脂肪及脂肪酸含量呈動態(tài)變化。初乳中脂肪含量最低，過渡乳中最高，成熟乳中趨于穩(wěn)定，脂肪的變化，尤其是早期的變化是為了適應(yīng)新生嬰兒消化器官發(fā)育尚不完善，胃腸功能差的狀況，攝入含過多脂肪的母乳會引起生理腹瀉。母乳中SFA、MCSFA（C10:0、C12:0）的含量隨著泌乳時間的延長而逐漸增加，與國內(nèi)外其他報道中各種脂肪酸所占的比例范圍類似[7,9,15]。不同泌乳階段中MUFA含量差異不顯著，其中成熟乳中MUFA含量（33.67%）高于日照（32.27%）和徐水（29.28%），但低于江蘇句容地區(qū)（37.52%）[16]，油酸是嬰幼兒所需能量的重要來源及組織和細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)的重要組分[17]，是母乳中含量最高的MUFA，而且在初乳中含量最高，這可能是由于嬰幼兒生長發(fā)育初期，組織、器官生長發(fā)育旺盛，對能量需求較高[18]，另外，在不同的泌乳期均檢測到芥酸（C22:1），可能與河南洛陽地區(qū)人們普遍食用菜籽油有關(guān)，還需進(jìn)一步研究。初乳、過渡乳中PUFA的含量與北京地區(qū)相當(dāng)，成熟乳中PUFA含量較北京地區(qū)高[9]。n-6系列PUFA中的LA和n-3系列PUFA中的ALA是人體必需脂肪酸，可通過脫氫和碳鏈延長分別合成AA、DHA，歐洲兒科胃腸病學(xué)和營養(yǎng)學(xué)會推薦母乳中LA/ALA理想范圍為5～15，本研究中各泌乳期LA/ALA比例較適宜。初乳中AA、DHA含量最高，并且隨著泌乳期的延長顯著下降，與劉靜[6]、Weiss[19]等的研究一致。這是由于胎兒期和新生兒早期，AA和DHA通常在胎兒及嬰兒大腦中大量聚集，以促進(jìn)大腦細(xì)胞的分化及視網(wǎng)膜的正常發(fā)育，雖然DHA和AA在體內(nèi)可分別由ALA和LA合成，但此時嬰兒體內(nèi)的脂肪酸碳鏈延長酶和去飽和酶活性較低，合成能力有限，其體內(nèi)的DHA和AA多半是孕期經(jīng)胎盤及產(chǎn)后經(jīng)母乳得來[20]，隨著嬰幼兒發(fā)育的成熟，自身合成能力的提高，母乳中AA、DHA含量逐漸下降。

對可能會影響母乳中5 種PUFA含量的7 個因素分析發(fā)現(xiàn)，母乳中LA含量與嬰兒性別有關(guān)，女嬰乳母組母乳中LA含量顯著高于男嬰乳母組。孕前超重乳母母乳中ALA、DHA含量顯著高于其他3 組，另除LA外，超重組、肥胖組乳母母乳中其他4 種PUFA，ALA、AA、EPA、DHA含量均較消瘦組、正常組高，這可能由于PUFA與促進(jìn)代謝有關(guān)，可使心血管疾病風(fēng)險降低，是對后代心臟的保護(hù)機(jī)制[21]。AB血型乳母母乳中AA、EPA、DHA含量均高于A型、B型、O型血乳母母乳中含量，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義，血脂是乳母母乳脂肪酸的重要來源，研究表明非O型血人群血脂濃度較高[22]，這可能是AB血型乳母母乳中AA、EPA、DHA含量較其他血型乳母高的原因，另外，本研究中B型血乳母母乳中總脂肪酸含量也顯著高于O型血乳母。分娩方式對5 種PUFA含量均無顯著影響，但剖腹產(chǎn)乳母母乳中5 種PUFA含量均高于順產(chǎn)乳母，可能是由于剖腹產(chǎn)乳母產(chǎn)后傷口愈合需要大量的熱能和蛋白質(zhì)，更加注重膳食營養(yǎng)搭配。生頭胎乳母母乳中5 種PUFA含量與生二胎乳母相比，差異不顯著，但是生頭胎的乳母母乳中5 種PUFA含量均較生二胎的高，可能是由于生二胎的乳母合成PUFA能力較生頭胎乳母弱造成的[12]。乳母孕周、生育年齡不影響5 種PUFA的組成，與Esther等[23]的研究一致。Guerra等[24]對早產(chǎn)和足月分娩乳母母乳研究時發(fā)現(xiàn)由于早產(chǎn)兒自身組織中PUFA存儲量較少，并且對LA、ALA碳鏈延長和去飽和能力弱，其乳母母乳中PUFA含量顯著高于足月分娩乳母。Argovargaman等[25]研究顯示孕周只影響年齡較大乳母（＞37 歲）過渡乳中n-3、n-6系列脂肪酸的組成，另外，產(chǎn)婦年齡在懷孕后期會以脂肪含量和組成的形式影響母乳的成熟[26]，并且隨著懷孕和分娩年齡的增高，母親和孩子會有健康與代謝問題，如增加母親患高血壓、糖尿病的風(fēng)險，同時也會導(dǎo)致早產(chǎn)和低體質(zhì)量兒的出生[27]，從母嬰健康角度考慮，應(yīng)適齡生育。母乳中PUFA含量與編碼哺乳動物長鏈脂肪酸延長酶基因ELOVL1-ELOVL7有關(guān)[28-29]，另外，林麒等[30]的研究表明，母乳脂肪酸含量還與社會因素有關(guān)。對于造成女嬰乳母母乳中LA含量顯著高于男嬰乳母的原因，需要結(jié)合乳母基因型及社會因素等進(jìn)行深入研究。另外，由于本研究資料信息收集有限，乳母孕期體質(zhì)量的增加、產(chǎn)后體質(zhì)量的變化、睡眠等是否也會對母乳中5 種PUFA含量造成差異也需要進(jìn)一步研究。

總之，為滿足嬰幼兒生長發(fā)育的需求，母乳中各種脂肪酸特別是PUFA含量隨著泌乳時間的延長而不斷發(fā)生著變化，并且母乳中與嬰兒生長發(fā)育至關(guān)重要的PUFA受不同因素的影響。因此，在進(jìn)行新生兒喂養(yǎng)以及配方奶粉的配制時應(yīng)充分考慮脂肪酸等營養(yǎng)素的微觀變化及乳母遺傳背景、身體狀況等，使之更符合嬰幼兒的營養(yǎng)需求。