劉婧，張云虹，趙霖，朱肖肖，張振，魏然，郭強(qiáng)，尹訓(xùn)強(qiáng)，周憲賓，王彬，李霞

(1濟(jì)南大學(xué) 山東省醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)與生命科學(xué)學(xué)院，濟(jì)南250200；2山東省醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所；3臨沂市蘭山區(qū)婦幼保健院；4山東中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院)

深靜脈血栓形成(DVT)是因靜脈內(nèi)膜損傷、血流緩慢和血液高凝狀態(tài)引起的周圍血管疾病，其發(fā)病率占周圍血管疾病的40%[1]。DVT多發(fā)生于下肢，以肢體廣泛性腫脹、疼痛、皮色暗紅、淺靜脈擴(kuò)張等為主要臨床表現(xiàn)。其血栓脫落可引發(fā)肺栓塞，嚴(yán)重威脅患者生命健康[2，3]。炎性細(xì)胞因子在DVT的發(fā)病中具有重要作用，其導(dǎo)致的血管內(nèi)皮損傷參與了DVT形成與發(fā)展[4]。白細(xì)胞介素10(IL-10)是一種具有免疫調(diào)節(jié)作用的細(xì)胞因子，在抑制炎癥、維持機(jī)體內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定中發(fā)揮重要作用[5]。研究發(fā)現(xiàn)，DVT患者存在IL-10表達(dá)降低，可能在炎癥損傷血管內(nèi)皮功能中扮演了重要角色，但導(dǎo)致IL-10降低的原因尚不清楚[6]。微小RNA(miRNA)是一類長度約為22個核苷酸的非編碼單鏈RNA分子，參與轉(zhuǎn)錄后基因表達(dá)調(diào)控，在維持機(jī)體穩(wěn)態(tài)中具有重要作用，但其在DVT發(fā)病中的作用尚不清楚[7，8]。本研究通過檢測DVT患者血清IL-10水平及外周血單個核細(xì)胞(PBMC)中miR-374a-5p表達(dá)變化，探討miR-374a-5p是否對IL-10存在調(diào)控作用，為臨床治療DVT提供新的靶點和思路。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 收集2017年6月～2018年6月山東中醫(yī)藥大學(xué)周圍血管病科就診的急性期DVT患者。納入標(biāo)準(zhǔn)：①符合第3版《深靜脈血栓形成的診斷和治療指南》[9]中的診斷標(biāo)準(zhǔn)，屬于急性期混合型單純下肢DVT；②單側(cè)肢體發(fā)病，病程<15 d；③年齡18～80歲；④尚未采用溶栓等藥物治療。排除標(biāo)準(zhǔn)：①合并活動性下肢潰瘍；②合并心、腦、肺疾病及肝、腎功能異常；③有出血性疾病或出血傾向；④妊娠期婦女。共收集DVT患者30例(DVT組)，男14例、女16例，年齡(56.6±7.2)歲。選取同期查體健康者30例作為健康對照組，男16例、女14例，年齡(53.4±6.5)歲。兩組性別、年齡具有可比性。本研究經(jīng)醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會批準(zhǔn)，患者或家屬簽署知情同意書。

1.2 標(biāo)本采集與試劑準(zhǔn)備 受試者均于清晨空腹抽靜脈血6 mL，EDTA-Na2抗凝，分離血清用于ELISA檢測，人外周血淋巴細(xì)胞分離液分離PBMC用于qPCR檢測。主要試劑:人外周血淋巴細(xì)胞分離液試劑盒購自索萊寶科技有限公司；人IL-10 ELISA購自杭州聯(lián)科生物技術(shù)有限公司；TRIzol Reagent、UItraSYBR Mixture均購自北京康為世紀(jì)生物科技公司；ReverTra Ace qPCR RT Kit購自東洋紡生物科技有限公司；miRNA 1st Strand cDNA Synthesis Kit購自南京諾唯贊生物科技有限公司；293T細(xì)胞及Hela細(xì)胞購自武漢普諾賽生命科技有限公司；Lipofectamine 2000購自美國Invitrogen公司；miR-374a-5p過表達(dá)(上游引物5′-UUAUAAUACAACCUGAUAAGUG-3′,下游引物5′-CUUAUCAGGUUGUAUUAUAAUU-3′)、抑表達(dá)(5′-CACUUAGCAGGUUGUAUUAUAA-3′)、陰性對照(上游引物5′-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT-3′,下游引物5′-ACGUGACACGUUCGGAGAATT-3′)、miR-374a-5p及內(nèi)參照U6逆轉(zhuǎn)錄引物與qPCR引物由上海吉瑪公司設(shè)計合成，內(nèi)參照GAPDH及目的基因IL-10 qPCR引物由上海博尚生物技術(shù)有限公司設(shè)計合成，引物序列見表1；野生型及突變型IL-10 mRNA 3′非翻譯區(qū)(3′UTR)載體購自美國Promega公司。

1.3 血清IL-10蛋白檢測 采用ELISA法。將1×洗液浸泡檢測板30 s，按照說明書加入倍比稀釋的標(biāo)準(zhǔn)品及樣品。每孔加入檢測抗體，混勻，室溫孵育2 h，洗板6次；每孔加入稀釋的辣根過氧化物酶標(biāo)記的鏈霉親和素，混勻，室溫孵育45 min，洗板6次；每孔加入顯色底物TMB避光，室溫孵育15 min，每孔加入終止液，使用酶標(biāo)儀進(jìn)行450 nm、630 nm雙波長下測定光密度(OD)值，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線后，依據(jù)OD450-OD630值計算IL-10蛋白濃度。

表1 基因引物序列及產(chǎn)物片段

1.4 PBMC中miR-374a-5p表達(dá)檢測 采用qPCR法。TRIzol法提取各組細(xì)胞總RNA，紫外分光光度計測定RNA的濃度及純度。根據(jù)miRNA 1st Strand cDNA Synthesis Kit說明書合成miRNA的cDNA，UltraSYBR Mixture PCR反應(yīng)體系擴(kuò)增。以U6為內(nèi)參照，根據(jù)獲得數(shù)據(jù)采用2ΔΔCt法計算miR-374a-5p的相對表達(dá)量。

1.5 miR-374a-5p與IL-10關(guān)系的生物信息學(xué)預(yù)測與驗證 通過對差異基因的生物信息學(xué)分析，用Target Scan7.1程序預(yù)測miR-374a-5p與IL-10 mRNA 3′UTR是否存在結(jié)合位點。運(yùn)用分子克隆技術(shù)，構(gòu)建包含結(jié)合位點的野生型及突變型IL-10 mRNA 3′UTR熒光素酶報告基因pmirGLO載體；將293T細(xì)胞分為干預(yù)組和對照組，干預(yù)組同時轉(zhuǎn)染空白對照NC與野生型或突變型IL-10 mRNA 3′UTR熒光素酶報告基因pmirGLO載體；轉(zhuǎn)染24 h后收集細(xì)胞，采用雙熒光素酶報告基因系統(tǒng)檢測熒光素酶報告基因活性。

1.6 miR-374a-5p對IL-10表達(dá)的調(diào)控作用觀察 將HeLa細(xì)胞分為3組，過表達(dá)組、抑表達(dá)組利用Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染miR-374a-5p mimics及inhibitor，空白對照組轉(zhuǎn)染空白對照NC；轉(zhuǎn)染24 h之后收集細(xì)胞，qPCR檢測各組細(xì)胞IL-10 mRNA水平，ELISA檢測各組培養(yǎng)上清IL-10蛋白水平。①IL-10 mRNA：TRIzol法提取各組細(xì)胞總RNA，紫外分光光度計測定RNA的濃度及純度。根據(jù)ReverTra Ace qPCR RT Kit及說明書合成mRNA，以UltraSYBR Mixture PCR反應(yīng)體系擴(kuò)增。以GAPDH為內(nèi)參照，采用2-ΔΔCt法計算IL-10 mRNA的相對表達(dá)量。②IL-10蛋白：收集細(xì)胞上清液，檢測方法同1.3.1。

2 結(jié)果

2.1 兩組血清IL-10蛋白水平及PBMC中miR-374a-5p表達(dá)比較 與健康對照組比較，DVT組血清IL-10蛋白水平降低而PBMC中miR-374a-5p表達(dá)升高(P均<0.05)。見表2。

表2 兩組血清IL-10蛋白水平及PBMC中miR-374a-5p表達(dá)比較

注：與健康對照組比較，*P<0.05。

2.2 miR-374a-5p與IL-10關(guān)系的生物信息學(xué)預(yù)測與驗證結(jié)果 Target Scan7.1程序預(yù)測顯示，miR-374a-5p與IL-10 mRNA 3′UTR之間具有潛在堿基互補(bǔ)結(jié)合位點，提示miR-374a-5p通過結(jié)合IL-10 mRNA 3′UTR進(jìn)而調(diào)控IL-10表達(dá)。見表3。雙熒光素酶報告基因系統(tǒng)檢測顯示，與對照組比較，干預(yù)組能降低野生型 IL-10 mRNA 3′UTR熒光素酶報告基因活性，但對突變型IL-10 mRNA 3′UTR熒光素酶報告基因活性無明顯影響(P>0.05)。見表4。

表3 miR-374a-5p與IL-10 mRNA 3′UTR結(jié)合位點預(yù)測

表4 miR-374a-5p對IL-10 mRNA 3′UTR熒光素酶報告基因活性的影響

注：與對照組同型別比較，*P<0.05。

2.3 miR-374a-5p對IL-10表達(dá)的調(diào)控作用 與空白對照組比較，過表達(dá)組HeLa細(xì)胞IL-10 mRNA表達(dá)及上清液IL-10蛋白水平均降低(P均<0.05)，而抑表達(dá)組HeLa細(xì)胞IL-10 mRNA表達(dá)及上清液IL-10蛋白水平均升高(P均<0.05)。見表5。

3 討論

DVT是周圍血管常見疾病，且近年來發(fā)病率呈逐年升高的趨勢[10,11]。DVT急性期容易發(fā)生血栓脫落，并發(fā)致死性肺栓塞，是臨床猝死的重要原因之一；若延誤治療或治療效果差，病情遷延可演變?yōu)檠ㄐ纬珊缶C合征，長期影響肢體功能，并形成靜脈性潰瘍[12]。目前，DVT的發(fā)病機(jī)制尚不十分清楚。研究發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞因子表達(dá)失衡導(dǎo)致的炎癥損傷血管內(nèi)皮細(xì)胞功能參與了DVT的發(fā)生與發(fā)展[1]。IL-10是重要的調(diào)節(jié)性細(xì)胞因子，主要由Th2細(xì)胞產(chǎn)生，也可來源于Th0細(xì)胞、單核巨噬細(xì)胞等。其主要功能是抑制Th1細(xì)胞的應(yīng)答，還可間接抑制NK細(xì)胞活性等，在抑制過強(qiáng)的炎癥反應(yīng)，維持機(jī)體內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定中發(fā)揮著重要作用[6]。研究表明，DVT患者血清IL-10水平降低。但是，導(dǎo)致IL-10表達(dá)降低的上游調(diào)控機(jī)制尚不清楚，深入探討有望為調(diào)控細(xì)胞因子表達(dá)治療DVT提供新的靶點與方法。

表5 各組HeLa細(xì)胞IL-10 mRNA表達(dá)及上清液IL-10蛋白水平比較

注：與空白對照組比較，*P<0.05。

miRNA可通過與其靶基因3′UTR區(qū)特異性的不完全互補(bǔ)結(jié)合調(diào)控靶基因表達(dá)與功能，廣泛參與調(diào)控細(xì)胞的增殖、分化、凋亡、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)等多種生理過程，在維持機(jī)體正常內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定中發(fā)揮著重要作用，其表達(dá)異常參與了腫瘤、糖尿病、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎等多種疾病的發(fā)生與發(fā)展[13]。但是，目前miRNA在DVT形成中的作用尚未闡明。有研究表明，miR-146a可能在DVT的纖溶—抗纖溶系統(tǒng)失衡過程中發(fā)揮重要調(diào)節(jié)作用[14]，let-7e-5p在DVT患者外周血中降低，而miR-483-3p和miR-195升高。這些miRNA在DVT患者中的差異表達(dá)，可作為DVT治療的新的靶點，為DVT的細(xì)胞療法提供了新的依據(jù)[8]。

本研究發(fā)現(xiàn)，DVT患者外周血PBMC中miR-374a-5p表達(dá)較正常對照升高，并且血清IL-10蛋白表達(dá)較降低，提示兩者表達(dá)的變化參與了DVT的發(fā)生與發(fā)展。miR-374a-5p是長度為22個核苷酸的內(nèi)源性非編碼單鏈小RNA，其編碼基因位于人的第Ⅹ號染色體。有研究報道，miR-374a-5p參與了炎癥反應(yīng)，在肥胖人群中其表達(dá)顯著升高，但其在DVT中的作用尚不清楚[15]。同時，我們通過Target Scan生物信息軟件分析發(fā)現(xiàn)，miR-374a-5p與IL-10 mRNA 3′UTR間存在潛在堿基互補(bǔ)結(jié)合位點，提示miR-374a-5p可能通過結(jié)合IL-10 mRNA 3′UTR進(jìn)而抑制IL-10基因的表達(dá)及功能，導(dǎo)致機(jī)體內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)失衡，引起炎癥損傷血管內(nèi)皮細(xì)胞，最終導(dǎo)致DVT形成。為了進(jìn)一步證實miR-374a-5p對IL-10的調(diào)控作用，本研究在HeLa細(xì)胞中轉(zhuǎn)染miR-374a-5p mimics上調(diào)miR-374a-5p表達(dá)，發(fā)現(xiàn)IL-10 mRNA及蛋白表達(dá)水平均降低；同時，我們發(fā)現(xiàn)在轉(zhuǎn)染miR-374a-5p inhibitor下調(diào)miR-374a-5p表達(dá)后，IL-10 mRNA及蛋白表達(dá)水平升高，進(jìn)一步證實miR-374a-5p對IL-10表達(dá)及功能具有負(fù)向調(diào)控作用。本研究從表觀遺傳免疫調(diào)控角度闡釋了DVT的可能發(fā)病機(jī)制，為DVT臨床診斷及治療提供了新的分子生物學(xué)指標(biāo)，靶向調(diào)控miR-374a-5p調(diào)節(jié)細(xì)胞因子表達(dá)可能為DVT治療的效靶點與途徑。