吳和弟，許麗娃，吉家釵，陳訓(xùn)春，王少津

(?？谑腥嗣襻t(yī)院，?？?70208)

研究顯示，2型糖尿病患者發(fā)生冠狀動(dòng)脈狹窄的風(fēng)險(xiǎn)顯著升高，與非2型糖尿病患者相比，2型糖尿病患者發(fā)生冠狀動(dòng)脈狹窄的風(fēng)險(xiǎn)增加8～15倍，且患者預(yù)后較差[1，2]。目前關(guān)于2型糖尿病發(fā)生冠狀動(dòng)脈狹窄的機(jī)制仍未完全明確，給臨床預(yù)防和治療帶來了困難。乙醛脫氫酶2(ALDH2)是人體內(nèi)重要的醛類氧化酶，主要作用為催化乙醛氧化成乙酸。ALDH2基因突變在冠狀動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生發(fā)展中起到重要作用，是心腦血管疾病發(fā)生的重要因素[3，4]。已有研究表明，ALDH2基因多態(tài)性可影響2型糖尿病患者的血糖水平[5，6]。而ALDH2基因多態(tài)性是否是增加2型糖尿病患者冠狀動(dòng)脈狹窄風(fēng)險(xiǎn)仍未有定論。本研究探討了海南地區(qū)2型糖尿病老年患者并發(fā)冠狀動(dòng)脈狹窄風(fēng)險(xiǎn)與ALDH2基因多態(tài)性的相關(guān)性。現(xiàn)報(bào)告如下。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選擇2015年1月～2016年12月?？谑腥嗣襻t(yī)院收治的2型糖尿病患者300例。納入標(biāo)準(zhǔn)：符合WHO制定的2型糖尿病診斷標(biāo)準(zhǔn)[7]；本地出生的常住人口，年齡>60歲；均行選擇性冠狀動(dòng)脈造影檢查。排除標(biāo)準(zhǔn)：合并免疫系統(tǒng)疾病、惡性腫瘤、肝腎功能障礙；近3個(gè)月內(nèi)患有感染性疾??；有血緣關(guān)系者。根據(jù)冠狀動(dòng)脈造影結(jié)果，以單支或多支冠狀動(dòng)脈狹窄程度≥30%確診為冠心病，將患者分為冠心病組159例和非冠心病組141例。冠心病組男97例、女62例，年齡61～76(68.06±4.10)歲，BMI(25.19±2.87)kg/m2，收縮壓(138.84±21.35)mmHg、舒張壓(84.35±10.76)mmHg，總膽固醇(TC)為(5.53±1.43)mmol/L、甘油三酯(TG)為(1.95±1.03)mmol/L、低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)為(3.43±1.07)mmol/L、高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)為(1.09±0.43)mmol/L；非冠心病組男89例、女52例，年齡60～77(68.43±5.08)歲，BMI(24.56±2.42)kg/m2，收縮壓(137.89±19.34)mmHg、舒張壓(85.19±11.43)mmHg，TC(5.34±1.21)mmol/L、TG(1.92±1.07)mmol/L、LDL-C(3.29±1.12)mmol/L、HDL-C(1.13±0.47)mmol/L。兩組性別、年齡、BMI、血壓、血脂具有可比性。本研究經(jīng)我院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，患者均簽署知情同意書。

1.2 ALDH2基因多態(tài)性檢測方法

1.2.1 DNA提取 采集患者空腹外周靜脈血10 mL，加入枸櫞酸鈉抗凝。加入Ficoll淋巴細(xì)胞分離液分離白細(xì)胞，應(yīng)用DNA提取試劑盒(武漢博士德有限公司)提取基因組DNA。取1 μL樣品，利用分光光度計(jì)檢測DNA濃度與純度，當(dāng)OD260/OD280在1.0～1.8表明樣本達(dá)標(biāo)。

1.2.2 引物設(shè)計(jì)及合成 引物序列由蘇州吉瑪生物技術(shù)有限公司設(shè)計(jì)合成，上游引物5-GTCAACTGCTATGATGTGTTTGG-3′，下游引物5′-CCACCAGCAGACCCTCAAG-3′。

1.2.3 PCR擴(kuò)增及產(chǎn)物測序 PCR反應(yīng)體系：上、下游引物各2 μL，模板DNA 2 μg，Master Mix 25 μL，總反應(yīng)體系50 μL。反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)變性3 min，94 ℃變性45 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸45 s，共35個(gè)循環(huán)，最后72 ℃延伸5 min，4 ℃保存。取擴(kuò)增產(chǎn)物，采用2%瓊脂糖凝膠電泳，電壓80 V，電泳時(shí)間25 min。紫外線分析凝膠成像系統(tǒng)下觀察結(jié)果。ALDH2基因擴(kuò)增產(chǎn)物送蘇州吉瑪生物技術(shù)有限公司測序，根據(jù)樣本測序結(jié)果對(duì)相關(guān)基因位點(diǎn)進(jìn)行人工比對(duì)，分析基因多態(tài)性。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS19.0統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)數(shù)資料以百分?jǐn)?shù)表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)；相關(guān)性分析采用Logistic回歸分析法。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 ALDH2基因測序結(jié)果 患者ALDH2基因型有3種，即GG型、AG型、AA型。

2.2 兩組ALDH2基因型及等位基因分布情況比較 冠心病組和非冠心病組ALDH2基因型分布均符合Hardy-Weinberg平衡(P>0.05)。冠心病組GG基因型頻率低于非冠心病組，AA基因型頻率高于非冠心病組，G等位基因頻率低于非冠心病組，A等位基因頻率高于非冠心病組。兩組AA基因型頻率、AG基因型頻率均低于GG基因型頻率，A等位基因頻率低于G等位基因頻率(P均<0.05)。見表1。

表1 兩組ALDH2基因型及等位基因分布情況比較[例(%)]

注：與AG基因型比較，aP<0.05；與AA基因型比較，bP<0.05；與A等位基因比較，cP<0.05。

2.3 不同性別患者基因型及等位基因頻率分布情況 不同性別患者ALDH2基因型分布均符合Hardy-Weinberg平衡(P>0.05)。男性與女性患者比較，ALDH2基因型頻率、等位基因頻率分布差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均>0.05)。男性和女性患者的AA基因型頻率、AG基因型頻率均低于GG基因型頻率，A等位基因頻率低于G等位基因頻率(P均<0.05)。見表2。

表2 不同性別患者ALDH2基因型及等位基因分布情況比較[例(%)]

注：與AG基因型比較，aP<0.05；與AA基因型比較，bP<0.05；與A等位基因比較，cP<0.05。

2.4 不同年齡患者基因型及等位基因頻率分布情況 不同年齡患者ALDH2基因型分布均符合Hardy-Weinberg平衡(P>0.05)?！?0歲患者與>70歲患者ALDH2基因型頻率、等位基因頻率分布差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均>0.05)。≤70歲患者與>70歲患者的AA基因型頻率、AG基因型頻率均低于GG基因型頻率，A等位基因頻率低于G等位基因頻率(P均<0.05)。見表3。

表3 不同年齡患者基因型及等位基因分布情況比較[例(%)]

注：與AG基因型比較，aP<0.05；與AA基因型比較，bP<0.05；與A等位基因比較，cP<0.05。

2.5 2型糖尿病患者冠狀動(dòng)脈狹窄危險(xiǎn)因素分析 以是否發(fā)生冠心病為因變量，以ALDH2等位基因頻率為自變量行Logistic回歸分析，在調(diào)整性別、年齡因素后，A等位基因是2型糖尿病患者冠心病發(fā)病的危險(xiǎn)因素(OR=2.426，95%CI為1.312～4.526，P=0.005)。

3 討論

2型糖尿病合并冠狀動(dòng)脈狹窄患者的病死率顯著高于單純2型糖尿病患者，因此研究2型糖尿病患者發(fā)生冠狀動(dòng)脈狹窄的風(fēng)險(xiǎn)及機(jī)制具有重要意義。以往研究認(rèn)為，高血糖、高血壓、脂代謝紊亂是冠狀動(dòng)脈粥樣硬化的重要危險(xiǎn)因素[9]。但僅通過高血壓、高血糖、脂代謝紊亂并不能完全解釋2型糖尿病患者發(fā)生冠狀動(dòng)脈狹窄的機(jī)制。近年研究顯示，基因多態(tài)性在糖尿病、冠心病、惡性腫瘤等疾病的發(fā)生發(fā)展中起重要作用[10]。ALDH是乙醇代謝的關(guān)鍵酶，與人類的飲酒行為、乙醇代謝和乙醇耐受等密切相關(guān)[11]。ALDH2是ALDH的重要亞型，具有心血管保護(hù)功能，而ALDH2突變與心腦血管疾病的發(fā)生、發(fā)展有密切關(guān)系。You等[12]報(bào)道，ALDH2可以通過抑制解毒4-HNE途徑，降低活性氧生成，從而降低心肌細(xì)胞損傷。Adeniji等[13]報(bào)道，上調(diào)ALDH2表達(dá)可有效降低動(dòng)脈粥樣硬化損傷，并發(fā)揮抗心肌細(xì)胞凋亡作用。Koppes等[14]報(bào)道，ALDH2基因多態(tài)性影響2型糖尿病患者的血糖，攜帶突變型ALDH2基因的2型糖尿病患者的血糖更難于控制。

人類ALDH2基因位于第12號(hào)染色體，第487位堿基有一個(gè)突變位點(diǎn)，可出現(xiàn)GG型、AG型、AA型三種基因型[15]。相關(guān)研究顯示，不同種族人群ALDH2基因型具有明顯差異。海南地區(qū)位于我國最南端，地處熱帶北緣、四面環(huán)海，氣候濕潤。海南省民族眾多，但漢族仍是主體民族，占80%以上，黎族、苗族、壯族為主要少數(shù)民族，約占17%，研究海南2型糖尿病老年患者并發(fā)冠狀動(dòng)脈狹窄風(fēng)險(xiǎn)與ALDH2基因多態(tài)性的關(guān)系具有重要意義。研究發(fā)現(xiàn)，不同性別、年齡的2型糖尿病患者冠狀動(dòng)脈狹窄發(fā)病率不同，其中女性2型糖尿病患者冠狀動(dòng)脈狹窄發(fā)病率高于男性，而高年齡段2型糖尿病患者冠狀動(dòng)脈狹窄發(fā)病率則更高。本研究結(jié)果顯示，不同性別、不同年齡ALDH2基因型頻率、等位基因頻率分布差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，表明海南地區(qū)2型糖尿老年病患者ALDH2基因型頻率與性別、年齡無關(guān)。不同性別、年齡的2型糖尿病患者冠狀動(dòng)脈狹窄發(fā)病率不同與ALDH2基因多態(tài)性可能無明顯關(guān)系。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，冠心病組GG基因型頻率低于非冠心病組，AA基因型頻率高于非冠心病組，G等位基因頻率低于非冠心病組，A等位基因頻率高于非冠心病組。

目前，關(guān)于ALDH2基因多態(tài)性具體通過何種機(jī)制影響2型糖尿病患者發(fā)生冠狀動(dòng)脈狹窄的風(fēng)險(xiǎn)仍不十分明確。我們認(rèn)為可能與以下因素有關(guān)：①ALDH2的A等位基因突變導(dǎo)致T2DM患者血糖更難于控制，增加胰島素抵抗，促進(jìn)動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)[16,17]；②ALDH2的A等位基因突變導(dǎo)致其解毒4-HNE途徑、抑制乙醛產(chǎn)生作用降低，影響心肌病保護(hù)功能[18]；③ALDH2的A等位基因突變影響機(jī)體乙醇代謝和乙醇耐受，促進(jìn)動(dòng)脈粥樣硬化形成[19]。其具體機(jī)制有待進(jìn)一步研究證實(shí)。本研究結(jié)果顯示，2型糖尿病合并CHD患者A等位基因頻率升高，ALDH2基因多態(tài)性有可能成為2型糖尿病老年患者冠狀動(dòng)脈狹窄發(fā)生的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。但本研究仍存在一定不足，因少數(shù)民族樣本數(shù)量較少，未對(duì)各民族基因多態(tài)性進(jìn)行比較，有待后續(xù)大樣本補(bǔ)充。

綜上所述，2型糖尿病老年患者并發(fā)冠狀動(dòng)脈狹窄風(fēng)險(xiǎn)與ALDH2基因多態(tài)性有關(guān)，ALDH2的A等位基因增加了2型糖尿病患者罹患冠狀動(dòng)脈狹窄的危險(xiǎn)。