陳彥平，張金蘋

(1.北京市門頭溝區(qū)中醫(yī)醫(yī)院內(nèi)分泌科，北京 102300;2.中日友好醫(yī)院內(nèi)分泌科，北京 100029)

非酒精性脂肪性肝病(non-alcoholic fatty liver disease，NAFLD)是一組以肝臟脂肪變性和異位脂肪為特征的肝臟疾病，主要病理特征為甘油三酯(triglyceride，TG)為主的脂質(zhì)積聚在沒有攝入過量酒精的患者肝細(xì)胞內(nèi)［1］。在我國，隨著肥胖率的上升，人口年齡的增長和體力活動(dòng)的減少，NAFLD的患病率呈上升趨勢(shì)。有研究表明，2型糖尿病(type 2 diabetes mellitus，T2D)患者中，NAFLD 的患病率明顯增加，NAFLD的嚴(yán)重程度與T2D嚴(yán)重程度呈正相關(guān)［2－3］。微小 RNA(MicroRNA，miRNA)是一種由18～25個(gè)核苷酸組成的小的非編碼RNA分子，在信使RNA表達(dá)中具有轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)作用，研究發(fā)現(xiàn)miRNA參與了細(xì)胞的分裂、生長等生物學(xué)過程。在NAFLD患者的血清中，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了如miR-34a、miR-26a等一系列 miRNA的異常表達(dá)，在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中miR-26a在減弱NAFLD發(fā)展中的起著重要的作用，過量表達(dá)miR-26a小鼠的肝臟質(zhì)量、肝臟TG沉積和血清谷丙轉(zhuǎn)氨酶(Alanine Transaminase，ALT)水平均較對(duì)照小鼠顯著降低［4－5］。沙格列汀是治療糖尿病伴NAFLD的主要藥物之一，其在控制患者血糖的同時(shí)，還可以通過影響肝臟脂質(zhì)代謝而改善患者肝功能［6］，為闡明不同水平miR-26a對(duì)沙格列汀治療糖尿病伴NAFLD的影響，本研究對(duì)不同miR-26a表達(dá)水平的2型糖尿病伴NAFLD患者給予沙格列汀治療，觀察治療前后的部分血糖及血脂指標(biāo)，報(bào)告如下。

1 對(duì)象與方法

1.1 研究對(duì)象

2015年1月～2017年12月收治的113例2型糖尿病伴NAFLD患者，男64例、女49例，49～71歲、平均(57.3±6.8)歲，體質(zhì)量指數(shù)(31.3±2.9)kg/m2;所有患者均有多飲、多尿、多食和消瘦、疲乏無力等典型糖尿病癥狀，均符合美國糖尿病學(xué)會(huì)頒布的2016年糖尿病診斷標(biāo)準(zhǔn)［7］:FPG≥1 260 mg/L，糖耐量餐后實(shí)驗(yàn)血糖≥200 g/L，HbA1c≥6.5%，高血糖典型癥狀或高血糖危象或任意時(shí)間血漿葡萄糖≥200 g/L。2011年中華醫(yī)學(xué)會(huì)NAFLD診斷標(biāo)準(zhǔn)［8］:無飲酒史或飲酒折合乙醇量＜140 g/周(女性＜70 g/周)，除外病毒性肝炎、藥物性肝病等可導(dǎo)致脂肪肝的特定疾病，肝活檢組織學(xué)改變符合脂肪性肝病或肝臟影像學(xué)表現(xiàn)符合彌漫性脂肪肝無其他可解釋原因。排除嚴(yán)重心、肝等臟器功能衰竭、酒精性及其他明確原因造成的脂肪肝患者，排除惡性腫瘤及對(duì)沙格列汀過敏患者。所有患者或家屬均簽署知情同意書，本研究由醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)實(shí)施。

1.2 方法

113例患者口服沙格列汀(中美上海施貴寶制藥有限公司，國藥準(zhǔn)字J20110029)進(jìn)行治療(5 mg，1次/d)，療程6個(gè)月?；颊哂诜? d后抽取外周靜脈血2 mL，將含有血液的試管以45～60°的角度在4℃的溫度下放置1 h，然后3 000 r/min離心5 min，獲得上清液，提取血清總RNA，逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA后行 Real-time PCR檢測(cè)miR-26a水平，以U6為內(nèi)參。miR-26a上游引物序列為 5'-AAGGAGAACCCGTAGATCCG-3'，miR-26a下游引物序列為5'-GTGCAGGGTCCGAGGTATTC-3';U6上游引物序列為 5'-GCGCGTCGTGAAGCGTTC-3'，U6下游引物序列為5'-GTGCAGGGTCCGAG GT-3'。反應(yīng)條件:95℃預(yù)變性3 min，95℃ 15 s，55℃20 s，72 ℃ 20 s，83.5 ℃ 15 s共 40個(gè)循環(huán);最后95 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min，95 ℃ 15 s，重復(fù)3次實(shí)驗(yàn)。以2－△△CT值法進(jìn)行相對(duì)定量分析。以患者血清miR-26a相對(duì)表達(dá)中位數(shù)為臨界值，將113例患者分為miR-26a高表達(dá)組(n=49)及miR-26a低表達(dá)組(n=64)，兩組患者年齡、性別、病程等一般資料比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。

1.3 觀察指標(biāo)

比較兩組患者治療前及治療6個(gè)月時(shí)的空腹血糖(fasting blood-glucose，F(xiàn)PG)、餐后 2 h血糖(2h-postprandial blood glucose，2hPPG)、糖化血紅蛋白(glycosylated hemoglobin，HbA1c)、谷丙轉(zhuǎn)氨酶(alanine transaminase，ALT)、谷草轉(zhuǎn)氨酶(aspartate transaminase，AST)、γ-谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶(γ-glutamyl transpeptidase，GGT)、總膽固醇(total cholesterol，TC)及TG水平;比較沙格列汀對(duì)兩組患者NAFLD的治療效果。NAFLD療效評(píng)價(jià):顯效為患者臨床癥狀減輕或消失，B超檢查顯示脂肪肝的征象有明顯的減輕，患者肝功能恢復(fù)正常，血脂下降超過30%;有效為患者臨床癥狀減輕，B超檢查顯示脂肪肝的征象有減輕，患者肝功能有改善，血脂下降超過10%;無效為患者臨床癥狀無變化，總有效=顯效+有效。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

數(shù)據(jù)采用SPSS 20.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示，兩組間數(shù)據(jù)比較采用t檢驗(yàn)。計(jì)數(shù)資料采用例數(shù)(%)表示，數(shù)據(jù)比較采用χ2檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 血清FPG、2hPPG及HbA1c水平

治療前兩組患者血清FPG、2hPPG及HbA1c水平比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05);治療后兩組患者血清FPG、2hPPG、HBA1c水平均較治療前顯著降低(P＜0.05)，但治療后兩組患者血清FPG、2hPPG、HBA1c水平比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。見表1。

表1 治療前后兩組患者血清FPG、2hPPG及HbA1c水平比較(±s)Tab.1 The effect of saxagliptin on the levels of FDG，2hPPG and HBAlc

表1 治療前后兩組患者血清FPG、2hPPG及HbA1c水平比較(±s)Tab.1 The effect of saxagliptin on the levels of FDG，2hPPG and HBAlc

(1)與治療前比較，P＜0.05

指標(biāo) miR-26a高表達(dá)組(n=49)治療前 治療后miR-26a低表達(dá)組(n=64)治療前 治療后FPG(mmol/L) 9.58±2.01 6.21±1.32(1) 9.47±1.99 6.19±1.26(1)2hPPG(mmol/L) 15.02±1.93 9.03±0.90(1) 14.92±1.83 8.91±0.88(1)HbA1c(%) 8.33±0.68 6.11±0.49(1) 8.18±0.61 6.09±0.47(1)

2.2 血清ALT、AST、GGT、TC及TG水平

治療前兩組患者血清 ALT、AST、GGT、TC及TG水平比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05);治療后兩組患者血清ALT、AST、GGT、TC及TG水平均較治療前顯著降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，但治療后兩組患者血清 ALT、AST、GGT、TC及TG水平比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。見表2。

表2 治療前后兩組患者肝功能及血脂指標(biāo)比較(±s)Tab.2 The effect of saxagliptin on the levels of ALT，AST，GGT，TC and TG

表2 治療前后兩組患者肝功能及血脂指標(biāo)比較(±s)Tab.2 The effect of saxagliptin on the levels of ALT，AST，GGT，TC and TG

(1)與治療前比較，P＜0.05

指標(biāo) miR-26a高表達(dá)組(n=49)治療前 治療后miR-26a低表達(dá)組(n=64)治療前 治療后ALT(U/L) 35.64±20.02 17.14±4.53(1) 36.44±21.20 24.03±4.61(1)AST(U/L) 28.02±11.02 19.87±8.43(1) 27.96±11.56 23.97±9.72(1)GGT(U/L) 55.01±29.23 27.13±17.13(1) 54.52±31.14 34.12±16.98(1)TC(mmol/L) 5.35±0.72 4.10±0.68(1) 5.41±0.63 4.91±0.59(1)TG(mmol/L) 3.12±0.30 1.09±0.29(1) 3.06±0.35 1.34±0.31(1)

2.3 療效

113例患者治療NAFLD的總有效率為73.5%，miR-26a高表達(dá)組治療NAFLD的總有效率83.7%，miR-26a低表達(dá)組治療NAFLD的總有效率為65.6%，兩組患者NAFLD療效比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。見表3。

表3 兩組患者NAFLD療效比較(n，%)Tab.3 The therapeutic effect of saxagliptin on NAFLD

3 討論

近十年來，人們對(duì)miRNA在包括NAFLD在內(nèi)的多種疾病的診斷和療效評(píng)估價(jià)值方面的興趣日益濃厚［9－10］。在NAFLD的相關(guān)研究中，已經(jīng)檢測(cè)了NAFLD中的miRNA表達(dá)模式，并且已經(jīng)提出了幾種miRNAs作為這種疾病的預(yù)測(cè)因子［11］。既然miRNA可能作為NAFLD的預(yù)測(cè)指標(biāo)，那么miRNA的表達(dá)水平可能也制約著NAFLD患者對(duì)藥物的反應(yīng)性。因此，本研究探究了miR-26a差異表達(dá)的糖尿病伴NAFLD患者對(duì)沙格列汀的臨床敏感性，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，miR-26a的差異表達(dá)并不會(huì)影響糖尿病患者的血糖控制(P＞0.05)，但是沙格列汀在miR-26a表達(dá)較高的患者取得了更好的NAFLD治療療效(P＜0.05)，提示miR-26a作為沙格列汀的療效具有一定的指示作用。

沙格列汀是用于治療成人2型糖尿病的二肽酰基肽酶(dipeptidyl peptidase，DPP-4)抑制劑，主要作用于腸降血糖素系統(tǒng)，其作用位點(diǎn)包括葡萄糖依賴性促胰島素多肽(gastric inhibitory peptides，GIP)和胰高血糖素樣肽-1(glucagon-1，GLP-1)。GLP-1和GIP響應(yīng)于食物攝取，從腸中的細(xì)胞分泌，并通過不同的受體作用于胰腺β-細(xì)胞，以葡萄糖依賴性方式刺激胰島素的釋放，GLP-1還以葡萄糖依賴性方式抑制胰腺α細(xì)胞的胰高血糖素分泌，調(diào)節(jié)胃排空，并作用于中樞神經(jīng)系統(tǒng)以減少食物攝入［12］。近年來的研究表明DDP-4抑制劑可在控制血糖的同時(shí)，改善患者的血脂和肝功能［13］，這些發(fā)現(xiàn)與本研究中沙格列汀治療下患者 ALT、AST、GGT、TC及TG改善相一致。DPP-4抑制劑可能通過影響肝臟脂質(zhì)代謝來減少脂肪合成，而肝臟脂質(zhì)代謝異常是NAFLD的重要原因。

目前的研究發(fā)現(xiàn)TG代謝異常是誘發(fā)NAFLD的關(guān)鍵，而miR-26a家族是控制TG等脂質(zhì)代謝的重要miRNA家族［14］。miR-26a的基因組位點(diǎn)定位于編碼C-末端結(jié)構(gòu)域RNA聚合酶II多肽A小磷酸酶家族的蛋白質(zhì)的基因的內(nèi)含子中，在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，miR-26a的表達(dá)下調(diào)可造成調(diào)節(jié)脂肪生成的關(guān)鍵蛋白胰島素誘導(dǎo)基因1過度表達(dá)，造成脂肪酸過度合成和TG的積累［15］，說明miR-26a在脂質(zhì)代謝過程中發(fā)揮著重要的調(diào)節(jié)作用，在本研究中也發(fā)現(xiàn)了miR-26a高表達(dá)的患者經(jīng)沙格列汀治療后血脂指標(biāo)TC、TG的改善更明顯(P＜0.05)，說明miR-26a激活造成脂質(zhì)代謝改善可能是沙格列汀治療NAFLD的重要機(jī)制之一。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)miR-26a表達(dá)并不影響沙格列汀的血糖改善功能，高miR-26a表達(dá)的糖尿病伴NAFLD患者對(duì)沙格列汀治療的敏感性更高，可獲得更明顯的肝功能和血脂指標(biāo)改善，血清miR-26a表達(dá)監(jiān)測(cè)有作為沙格列汀治療糖尿病伴非酒精性脂肪肝患者療效早期預(yù)測(cè)的生物標(biāo)記物的潛力。