張曉明 葉小玲 胡曉敏

（1.廣州旺地園林工程有限公司，廣東 廣州 510335；2. 英德市旺地櫻花種植有限公司，廣東 英德 513000；3.韶關市旺地櫻花種植有限公司，廣東 韶關 512000；4.廣州天適集團有限公司，廣東 廣州 510335）

云南櫻桃Cerasus yunnanensis屬薔薇科Roseace櫻屬落葉喬木，原產我國云南、四川和廣西[1]。廣州天適集團有限公司多年前從野生云南櫻桃中選育出一優(yōu)良單株，具有生長速度快、冠型好、花量繁密、花瓣大、花色粉紅艷麗、耐熱性好、抗逆性強等優(yōu)點，適合華南及周邊地區(qū)種植，推廣前景廣闊[2]。

該優(yōu)株可通過種子進行繁殖，但實生苗難以保持母本優(yōu)良性狀，生長量、花型和花色分化均較大，不穩(wěn)定。其常規(guī)無性繁殖主要采用嫁接繁殖，嫁接所用砧木種類和穗條木質化程度對其嫁接成活影響很大，在廣東適宜的嫁接時間為12月至次年1月，鑒于嫁接用母株枝條數量及嫁接時間的限制，嚴重制約了其快速推廣應用[3～4]。組織培養(yǎng)快速繁殖技術為其大規(guī)模高效繁殖提供了有效途徑，其中無菌系的建立是其組培快繁技術關鍵之一。

櫻花組織培養(yǎng)技術研究較晚，目前有關櫻花無菌系建立的報道不多[5～6]，已有的櫻屬植物外植體滅菌方法對該云南櫻桃優(yōu)株外植體滅菌效果差。該云南櫻桃優(yōu)株長期定植于戶外，因長期暴露在空氣中，體表附著大量微生物，體內內生菌多，脫毒困難[7]。其體內內含物多，褐化現象嚴重。此外，櫻屬植物多具皮孔，葉基部有托葉，清洗和脫毒過程中托葉易脫落，而導致外植體容易受到清潔劑、消毒劑等傷害；其葉片基部的腺體分泌大量粘液，吸引昆蟲攀爬和吮食，導致細菌入侵，從而增加了外植體消毒的困難。可見，對污染和褐化的控制是其無菌系建立的關鍵所在。本文以云南櫻桃優(yōu)株的嫩枝為外植體，通過研究預處理方式、取材時間、取材部位和消毒方法對其無菌材料獲得的影響，完善其無菌系建立技術，為其組培快繁技術建立奠定基礎，并為其他櫻屬植物組培快繁技術提供參考借鑒。

1 材料與方法

1.1 材料

在廣州天適集團有限公司韶關市乳源縣大布基地內，從7年生的優(yōu)株上剪取嫩枝作為外植體。

1.2 方法

1.2.1 預處理方法的篩選

本試驗共設置4種預處理方法，其中處理1～3所用外植體是2013年4月取自優(yōu)株上的半木質化枝條，處理4所用外植體取自2013年1月初嫁接于鐘花櫻桃（寒緋櫻）Cerasus campanulata上的該優(yōu)株萌枝。取外植體應選擇天氣晴朗的 10∶00—11∶00時段。各處理如下：

1）將外植體置于自來水下沖洗去表面泥土，剪去葉片（留葉柄），在自來水中加入適量洗潔精和2滴吐溫，用棉球蘸洗潔精溶液輕輕刷洗外植體表面，然后用自來水沖洗干凈洗潔精，再用消毒劑進行表面消毒滅菌。

2）將外植體置于自來水下沖洗去表面泥土，將其基部用滅過菌的濕潤紗布包裹，按自然生長方向置于燒杯中，套上保鮮袋，放入4℃冰箱低溫冷藏，分別于l d、3 d、5 d、7 d和10 d后取出，剪去葉片，在自來水中加入適量洗潔精和2滴吐溫，用棉球蘸洗潔精溶液輕輕刷洗腋芽及莖段，用自來水沖洗干凈后用消毒劑進行表面消毒滅菌。

3）將外植體置于自來水下沖洗去表面泥土，剪去葉片（留葉柄），在自來水中加入適量洗潔精和2滴吐溫，用棉球蘸洗潔精溶液輕輕刷外植體表面，用自來水沖洗干凈洗潔精，然后把其基部用滅過菌的濕潤紗布包裹，按自然生長方向置于燒杯中，套上保鮮袋，放入4℃冰箱低溫冷藏，ld后取出置于超凈工作臺，用消毒劑進行表面消毒滅菌。

4）取得的外植體按處理1進行預處理。

以上各預處理后，取外植體頂芽下第4～5個莖節(jié)進行表面消毒滅菌，均按1.2.4中的d處理進行。

1.2.2 取材時間的篩選

分別于2013年4月、7月和10月，于天氣晴朗的 10∶00—11∶00 時段，剪取半木質化萌枝的頂芽下第4～5個莖節(jié)為外植體，按照預處理2的方法冷藏1 d，然后用1.2.4中的d處理進行外植體的表面滅菌。

1.2.3 取材部位的篩選

2013年4月于天氣晴朗的10∶00—11∶00時段，剪取半木質化萌枝為外植體，將其分為3部分（Ⅰ號為頂芽及頂芽以下2個莖節(jié)，Ⅱ號為Ⅰ號外植體以下2～3個莖節(jié)，Ⅲ號為Ⅱ號以下莖節(jié)），采用1.2.1預處理2的方法冷藏1 d，然后用1.2.4中的d處理進行外植體的表面滅菌（Ⅰ號、Ⅱ號和Ⅲ號升汞的較佳處理時間分別為2～3 min、4～5 min和6～8 min）。

1.2.4 消毒滅菌方法的篩選

2013年4月于天氣晴朗的10∶00—11∶00時段，剪取半木質化萌枝為外植體，將外植體置于自來水下沖洗去表面泥土，剪去葉片（留葉柄），在自來水中加入適量洗潔精和2滴吐溫，用棉球蘸洗潔精溶液輕輕刷洗外植體表面，后用自來水沖洗干凈，在超凈工作臺上將枝條分成2～3 cm小段，無菌水沖洗干凈后，在每個無菌玻璃瓶中放置5～10個芽段，再按照以下5種消毒方式進行表面消毒：

a）2%次氯酸鈉溶液8～20 min（時間依據材料幼嫩程度而定）；

b）0.1%升汞溶液2～8 min（時間依據材料幼嫩程度而定）；

c）75%酒精溶液30 s+0.1%升汞溶液2～8 min；

d）1%新潔爾滅5 min+0.1%升汞溶液2～8 min；

e）1%新潔爾滅5 min+75%酒精溶液30 s +0.1%升汞溶液2～8 min。

其中2%次氯酸鈉和0.1%升汞溶液具體的消毒時間根據莖段的幼嫩程度而定，如1.2.3中分級，Ⅰ級莖段2%次氯酸鈉溶液處理時間為8 min，而0.1%升汞溶液處理時間為2 min。各消毒劑使用后都需用無菌水清洗干凈，消毒和清洗過程中要不停地晃動玻璃瓶，使外植體與消毒劑或無菌水充分接觸，每次無菌水沖洗時需晃動玻璃瓶不少于30 s。把消毒后的外植體置于接種盤中，用接種刀切除葉柄以及外植體兩端受傷部位，再接種于誘導培養(yǎng)基上，每瓶接種1個外植體。

每個處理接種100瓶。15 d后觀察并記錄各小組的污染率、褐化/死亡率和成活率。

2 結果與分析

2.1 預處理方式對外植體存活的影響

表1結果顯示，通過將野外枝條嫁接到砧木上于溫室內養(yǎng)護管理的效果最好，污染率和褐化/死亡率均在10%以內，存活率高達82%。野外采集的外植體宜隨采隨處理，及時處理的存活率最高，達51%，隨著冷藏時間的延長，污染率和褐化/死亡率升高，而成活率降低。當枝條貯藏時間超過7 d，基本很難獲得存活個體。此外，枝條帶葉冷藏較去掉葉片清洗后保存效果好，可能是清洗后冷藏加速了托葉脫落。試驗過程中發(fā)現，隨著冷藏時間的延長，托葉脫落現象加重，5 d后托葉基本都脫落，增加了植物材料與環(huán)境的接觸面，加重了環(huán)境中微生物、殺菌劑等對外植體的損害（圖1～2）。故野外采回來的外植體應盡快處理，冷藏時間不宜超過5 d。

綜上，合適的預處理方式可有效減輕云南櫻桃優(yōu)良單株外植體的帶菌情況。對于野外材料，條件允許情況下，可以先在溫室嫁接，再取其萌枝作為外植體。若條件不允許，則采回后應及時處理，且外植體帶葉冷藏的時間不宜超過5 d，采集和處理過程中盡量減少托葉的脫落。

2.2 采集時間對外植體存活的影響

表2的試驗結果顯示，不同的取材時間會影響云南櫻桃優(yōu)株進瓶效果。在3個取材時間中，4月為最佳取材時間，取材接種的外植體污染率和褐化/死亡率均最低，而存活率最高，高達51%。由于7月份南方降雨量大、氣溫高、濕度大，各類菌的活動旺盛期，此時取材接種的外植體效果最差，污染率高達57%，而存活率僅19%。10月份取材接種外植體效果不理想，稍好于7月處理的外植體的效果。綜上，云南櫻桃優(yōu)株外植體的最佳采集時間為春季3—4月，一般是在春季抽梢半木質化到萌動腋芽長出芽鱗前。

表1 不同預處理方式對外植體存活的影響

表2 不同取材時間對外植體存活的影響

圖1 優(yōu)株枝Ⅱ冷藏5 d

圖2 優(yōu)株枝Ⅲ冷藏5 d

2.3 取材部位對外植體存活的影響

表3表明，云南櫻桃優(yōu)株Ⅱ號外植體接種效果最好（圖3），存活率高達65%，污染率和褐化/死亡率均最低。Ⅰ號外植體效果其次，Ⅲ號外植體效果最差（圖4）。三者之間污染率相差不大，Ⅲ號外植體褐化/死亡率遠高于Ⅰ號和Ⅱ號外植體，由于Ⅲ號外植體木質化程度較高，莖段不及Ⅱ號外植體充實，易被消毒劑滲透。Ⅰ號外植體幼嫩，對消毒劑承受力不及Ⅱ號外植體。綜上，云南櫻桃優(yōu)株最佳的取材部位為Ⅱ號（即頂芽下第4～5個莖節(jié)）。

2.4 消毒方法對外植體存活的影響

植物各部分的表面帶著的各種微生物可以通過消毒劑進行表面消毒，云南櫻桃優(yōu)株內生菌較多，單獨使用一種消毒劑效果不理想。

表4結果顯示，云南櫻桃優(yōu)株的最佳消毒組合是處理d—1%新潔爾滅5 min+0.1%升汞2～8 min（依據莖段幼嫩程度而定），此消毒處理外植體存活率最高，可達59%，褐化/死亡率最低。處理e效果其次，存活率為48%。處理b和c外植體誘導效果差別不大，處理c較處理b多了酒精30 s處理，外植體的污染率降低了9%，但褐化/死亡率卻提高了10%，可能酒精不適合作為云南櫻桃優(yōu)株消毒劑，或者酒精使用時間過長。單獨使用次氯酸鈉的脫毒效果最差，污染率高達60%，存活率僅為16%。綜上，云南櫻桃優(yōu)株嫩枝的表面消毒最佳處理為處理d—1%新潔爾滅5 min+0.1%升汞2～8 min（依據莖段幼嫩程度而定）。

表3 不同取材部位對外植體存活的影響

表4 不同消毒方法對外植體存活的影響

圖3 嫁接萌枝Ⅱ

圖4 嫁接萌枝Ⅲ

3 結論與討論

無菌系的建立是云南櫻桃優(yōu)良單株組培快繁關鍵技術之一。本研究表明：1）外植體宜隨采隨處理，且枝條帶葉冷藏時間不宜超過5 d，隨著枝條冷藏時間延長，托葉脫落現象加重，增加了消毒劑對外植體的損害，外植體存活率與冷藏時間成反比。2）已有的櫻花組織培養(yǎng)研究中，外植體滅菌的存活率一般在45%～70%[8～10]。本試驗中，將云南櫻桃優(yōu)株的野外枝條嫁接到砧木上于溫室內養(yǎng)護管理，再取其萌枝作為外植體，可有效降低其污染率，外植體存活率可達82%，對于野外材料，條件允許情況下，可以先在溫室嫁接。3）外植體最佳采集時間為春季3—4月，外植體帶菌情況、引起褐變的物質的量因生長季節(jié)不同而有所差異，在適宜的季節(jié)采集合適的外植體，可以有效減少污染、褐化的發(fā)生[11]。4）最佳的取材部位為頂芽下第4～5個莖節(jié)，配合表面消毒方法即1%新潔爾滅5 min+0.1%升汞溶液2～8 min，外植體存活率可達65%，75%酒精對外植體進行消毒可降低污染率，但對外植體傷害較大，褐化/死亡率提高，這與王紅梅等[8]對垂枝櫻外植體滅菌的研究結果一致。

本研究通過對外植體進行預處理，選擇合適的取材時間、取材部位和消毒方式等方法，能夠有效降低污染率和褐化死亡率，提高外植體存活率，可高效快速建立云南櫻桃優(yōu)株的無菌系，有利于快速開展其組培快繁技術后續(xù)研究，同時可為其他櫻花品種的組培快繁技術研究提供參考和借鑒。

該云南櫻桃優(yōu)株樹形優(yōu)美、花色鮮艷、花量大、耐熱性好、抗逆性強，是非常適合華南地區(qū)種植的新優(yōu)櫻花觀賞品種。目前已在廣東、廣西等省份大量應用推廣，生長及開花表現良好，深受人們喜愛（圖5～6）。組培快繁技術相關研究為其工廠化育苗及快速推廣提供了有力保障。

圖5 廣州琶洲開花效果

圖6 廣州番禺寶墨園開花效果