張雪 薛曉成 陳曉平 張燚 滕偉強 李璨 魯?shù)?/p>

1上海市浦東新區(qū)公利醫(yī)院中心實驗室（200135）

2上海市浦東新區(qū)公利醫(yī)院耳鼻咽喉科

3第二軍醫(yī)大學長海醫(yī)院耳鼻咽喉頭頸外科（上海）

4寧夏醫(yī)科大學在讀研究生

鼻咽癌（nasopharyngeal carcinoma,NPC）是我國南方地區(qū)高發(fā)腫瘤之一，占頭頸部腫瘤發(fā)病率首位，其發(fā)病率呈不斷上升趨勢[1]。上皮-間質轉化（epithelialmesenchymal transition,EMT）是上皮細胞失去細胞極性并獲得間充質表型，從而誘導細胞增殖遷移的過程[2]。研究表明，上皮-間質轉化在鼻咽癌的發(fā)生中起重要作用，但具體機制尚不清楚。

長鏈非編碼RNA(Long non-coding RNA,LncRNA)是長度大于200個核苷酸的非編碼RNA，LncRNA具有調控基因間相互作用，并在腫瘤致病過程中扮演重要角色[3]?；蜷gLncRNA-重編碼調控因子 [regulator of reprogramming（ROR），LncROR]是由Loewer首先在胚胎干細胞中發(fā)現(xiàn)，其主要參與細胞重編程過程[4]。近期研究表明，LncROR在多種腫瘤組織及細胞中異常表達[5]，但對于LncROR在鼻咽癌中的研究，國內外少見相關文獻報道。本研究通過在組織和細胞水平檢測LncROR在鼻咽癌中的表達，及對細胞增殖、抗凋亡和上皮-間質轉化的影響，旨在為鼻咽癌的發(fā)生、發(fā)展及研究新的治療靶點提供理論依據(jù)。

資料與方法

1 臨床樣本收集

收集2016年6月～2017年6月上海市浦東新區(qū)公利醫(yī)院及長海醫(yī)院經(jīng)病理確診的初治鼻咽癌患者及慢性鼻咽炎患者的病例標本各15例，所有鼻咽癌病理診斷均為未分化非角化型癌（WHO分型），臨床分期Ⅱ期2例，Ⅲ期8例，Ⅳ期5例（UICC頭頸腫瘤臨床分期第六版，2002年），腫瘤及鼻咽炎組織標本獲取后經(jīng)液氮凍存。所有患者術前均未行放療、化療及其他輔助治療，最終診斷由常規(guī)病理檢查確診。該研究通過公利醫(yī)院倫理委員會審核批準,并獲得患者及家屬的知情同意。

2 細胞培養(yǎng)

人鼻咽癌細胞株CNE-2,HNE1,HONE-1,SUNE-1及人鼻咽部上皮細胞株NP69，均購自中國科學院上海生命科學研究院細胞生物學研究所細胞庫。細胞均按細胞培養(yǎng)說明使用RPMI-1640培養(yǎng)基（Hyclone,SH30809.01）添加10%胎牛血清(biowest,S1820-500)、1%濃度 100U/ml青霉素和 100μg/ml鏈霉素進行培養(yǎng)。細胞培養(yǎng)于37℃，CO2體積分數(shù)為5%的飽和濕度的細胞培養(yǎng)箱中。

3 實時熒光定量聚合酶鏈反應

使用總RNA提取試劑盒（中國上海飛捷生物公司，220010）提取細胞和組織總RNA。使用Rever Tra Ace qPCR-RT反轉錄試劑盒（日本Toyobo生物有限公司，QPK-212T）進行反轉錄反應合成cDNA。按照SYBR Premix Ex TaqTM試劑盒（日本Toyobo生物有限公司，PCR311）使用說明進行qRT-PCR檢測。qRT-PCR及數(shù)據(jù)采集均使用ABI PRISM 7900HT序列檢測系統(tǒng) (美國Applied Biosystems公司)，GAPDH作為內參。

4 LncROR沉默穩(wěn)定轉染細胞株及對照組細胞株構建

鼻咽癌細胞CNE-2種于6孔板中，置于37℃，5%CO2分壓的細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，生長24小時后，將合成的siRNA-ROR基因沉默轉染序列用siRNA-Mate轉染（上海吉瑪生物公司，G04001），48小時后換液，進行后續(xù)實驗。

5 CCK-8法檢測CNE-2細胞增殖情況

細胞按30%～50%的濃度比例鋪于96孔板，24小時待細胞貼壁后，進行siRNA轉染,轉染結束后,用PBS清洗3次。每孔加入CCK8試劑（日本同仁化學,CK04），在37℃細胞培養(yǎng)箱中孵育3小時，分別在 0、12、24、48、72 小時時間點用酶標儀檢測，吸光度值為450nm波長，繪制細胞增殖曲線，每組實驗重復3次。

6 Western blot法檢測蛋白

細胞蛋白提取后，BCA法測蛋白濃度（江蘇碧云天生物公司，P0010S）。配10%分離膠進行電泳(江蘇碧云天生物公司，P0012A)，轉膜后孵育一抗（1：1000稀釋）4℃過夜，用TBST清洗3次后，二抗（1：2000稀釋）室溫孵育2小時，用TBST清洗3次后。用凝膠圖像處理系統(tǒng)分析目的條帶灰度值，完成統(tǒng)計 分 析 。 抗 體 ：Activated caspase-3（9661），Total caspase-3(9662)，Activated caspase-9（9505），Total caspase-9 (9502)，E-cadherin (14472)，β -catenin(8480)，N-cadherin(13116)，Vimentin(5741)，GADPH（5174）均購自于Cell Signaling公司。

7 統(tǒng)計學分析

結果

1 LncROR在鼻咽癌組織及鼻咽癌細胞株中表達升高

用實時定量熒光PCR法檢測臨床樣本中LncROR的表達水平。鼻咽癌患者瘤體組織LncROR表達水平明顯高于慢性鼻咽炎組織，(P＜0.05,圖1)。為了進一步驗證LncROR在鼻咽癌中的表達情況,我們選擇在1種正常鼻咽部上皮細胞株NP69及4種鼻咽癌細胞株中 (CNE-2,HNE1,HONE-1,SUNE-1)進行LncROR表達水平檢測。鼻咽癌細胞株中LncROR的表達水平均高于鼻咽部上皮組織細胞NP69（P＜0.05,圖2）。上述4種鼻咽癌細胞株中,LncROR在CNE-2中表達量最高。所以，我們選擇CNE-2細胞株進行后續(xù)體外實驗研究。

圖1 采用實時熒光定量PCR檢測LncRNA-ROR在鼻咽癌組織和鼻咽炎黏膜組織相對表達量。樣本間數(shù)據(jù)分析采用配對t檢驗（n=15，*:P＜0.05）。

圖2 采用實時熒光定量PCR檢測鼻咽部上皮細胞株NP69和鼻咽癌細胞株 (CNE-2,HNE1,HONE-1,SUNE-1)中LncRNA-ROR相對表達量。數(shù)據(jù)分析采用均數(shù)±標準誤，每組樣本平均重復實驗3次。與Mock組相比，*表示P＜0.05。

2 體外研究LncROR對鼻咽癌細胞增殖能力及凋亡相關蛋白的影響

用基因沉默方法抑制LncROR在CNE-2細胞中的表達。轉染48小時后，提取細胞總RNA，用實時熒光定量PCR方法檢測轉染成功（P＜0.05，圖3）

圖3 采用實時熒光定量PCR檢測，經(jīng)RNA干擾后，鼻咽癌細胞株CNE2中LncROR表達含量。Mock組：空載轉染對照組；sh-ROR:LncROR基因抑制組數(shù)據(jù)分析采用均數(shù)±標準誤，每組樣本平均重復實驗3次。與Mock組相比，*表示P＜0.05。

經(jīng)細胞增殖實驗證實，抑制LncROR表達后，與轉染對照組相比,細胞增殖能力明顯減弱（P＜0.05，圖 4）。用Western blot方法檢測，LncROR 對凋亡相關蛋白表達變化 (活化caspase-3、caspase-3總蛋白、活化caspase-9蛋白、caspase-9總蛋白)。結果顯示，抑制LncROR后，活化的caspase-3、caspase-9蛋白表達升高，但總蛋白的水平?jīng)]有明顯變化（P＜0.05，圖5）。上述結果顯示，LncROR表達下降可以減弱CNE-2細胞增殖能力,增加凋亡能力。

圖4 CCK-8實驗檢測LncRNA-ROR表達沉默后細胞增殖能力改變。Mock組：空載轉染對照組；sh-ROR:LncROR基因抑制組數(shù)據(jù)分析采用均數(shù)±標準誤，每組樣本平均重復實驗3次。與對照組相比，*表示P＜0.05。

圖5 Western blot方法檢測，LncROR表達沉默后對凋亡相關蛋白表達影響。Mock組：空載轉染對照組；sh-ROR:LncROR基因抑制組。左側：Western印跡法檢測條帶圖，右側：統(tǒng)計圖。數(shù)據(jù)分析采用均數(shù)±標準誤，每組樣本平均重復實驗3次。與Mock組相比，*表示 P＜0.05,

3 LncROR促進CNE-2細胞發(fā)生上皮-間質轉化

用Western blot檢測，在CNE-2細胞中抑制LncROR后，對上皮-間質轉化標志蛋白表達的影響。結果顯示，抑制LncROR后，可以導致上皮標志蛋白（E-鈣粘蛋白、β-連環(huán)蛋白）表達升高，間質標志蛋白（N-鈣粘蛋白、波形蛋白）表達下降(P＜0.05，圖6)。

圖6 Western blot方法檢測，LncROR表達沉默對上皮-間質轉化相關蛋白表達影響.Mock組：空載轉染對照組；sh-ROR:LncROR基因抑制組。E-cadherin:E-鈣粘蛋白；β-catenin：β-連環(huán)蛋白；N-cadherin:N-鈣粘蛋白；Vimentin:波形蛋白；GADPH為內參。左側：Western印跡法檢測條帶圖，右側：統(tǒng)計圖。數(shù)據(jù)分析采用均數(shù)±標準誤，每組樣本平均重復實驗3次。與Mock組相比，*表示P＜0.05,

討論

鼻咽癌中主要以低分化鱗癌為主，因其病變部位隱匿，早期不易被發(fā)現(xiàn)。故臨床就診患者約60%已出現(xiàn)頸部淋巴結轉移，20%因顱神經(jīng)受累而就診，明顯影響患者預后[1]。隨著腫瘤學和分子生物學的發(fā)展，上皮-間質轉化在腫瘤中所發(fā)揮的作用越來越受到關注。因此，研究鼻咽癌發(fā)生、發(fā)展的分子機制，尋找早期的診斷指標，對改善鼻咽癌預后有十分重要的意義。

LncRNA存在于細胞核和胞漿中，可在表觀遺傳、轉錄及轉錄后等多個層面參與基因調控[6]。近期研究發(fā)現(xiàn)，LncRNA在調節(jié)腫瘤增殖、凋亡以及上皮-間質轉化中起重要作用。Richards等[7]研究發(fā)現(xiàn)LncRNA-HIT有促進乳腺癌細胞侵襲和遷移的作用，在下調LncRNA-HIT的表達后，上皮標志蛋白E-鈣粘蛋白表達上調，間質標志蛋白波形蛋白表達下降。Ying等[8]在發(fā)生遠處轉移的膀胱癌組織中研究發(fā)現(xiàn)有LncRNA-MALAT-1高表達，下調MALAT-1表達后，上皮-間質轉化調控因子ZEB1、ZEB2和Slug的表達下降，E-鈣粘蛋白表達明顯增高，其機調節(jié)制可能是通過激活Wnt/β-catenin信號通路促發(fā)了上皮-間質轉化的發(fā)生。Liang等[9]研究發(fā)現(xiàn)，LncRNA-H19在間質樣腫瘤細胞和腫瘤組織中高表達，LncRNA-H19可競爭性拮抗miR-138和miR-200A的功能，使波形蛋白、ZEB1和ZEB2表達上升，進而導致上皮-間質轉化的發(fā)生。

LncROR是近期被證實的胚胎源性干細胞（embryonic stem cells，ESCs）的重要調控因子，可維持ESCs及腫瘤干細胞的存活[4]。目前研究發(fā)現(xiàn)，LncROR在腫瘤的增殖及抗凋亡中同樣發(fā)揮重要作用。近期研究表明，LncROR在多種腫瘤組織及細胞中異常表達，如肝癌、乳腺癌、膠質瘤等，且已證明其與腫瘤細胞的上皮-間質轉化相關。Hou等[10]的研究表明LncROR在乳腺癌中的表達水平高于周圍正常組織，并通過促進上皮-間質轉化，提高乳腺腫瘤細胞的增殖及侵襲能力，類似的研究在肝癌和膠質瘤中也得到證實[11，12]。不可否認，LncROR在調控腫瘤細胞增殖、抗調亡及上皮-間質轉化中的作用已在多種腫瘤中得到證實，但LncROR在鼻咽癌增殖、轉移和上皮-間質轉化中的作用尚無研究報道。

本實驗采用實時熒光定量PCR方法檢測鼻咽癌組織及慢性鼻咽炎組織中LncROR的表達情況，結果顯示在鼻咽癌組織中LncROR的表達明顯高于慢性鼻咽炎組織。初步表明LncROR的表達可能與鼻咽癌的發(fā)生、發(fā)展有一定的相關性。隨后，我們在 CNE-2、HNE1、HONE-1、SUNE-1 四種鼻咽癌細胞株中用實時熒光定量PCR方法檢測LncROR的表達，結果顯示：在CNE2中LncROR高于其他三種鼻咽癌細胞株，所以我們選擇CNE2作為后續(xù)LncROR的作用機制研究對象。

上皮-間質轉化是腫瘤發(fā)生增殖轉移的關鍵機制之一。LncROR已被證明在多種腫瘤細胞增殖和上皮-間質轉化過程中具有重要作用[13-15]，其中E-鈣粘蛋白和波形蛋白可作為腫瘤上皮-間質轉化過程中最可靠的標志蛋白[16，17]。Hou 等[10]研究發(fā)現(xiàn)：LncROR在乳腺癌組織和乳腺癌細胞株中的表達均有增高；并通過Western blot和免疫熒光法檢測上皮-間質轉化相關標志蛋白，發(fā)現(xiàn)調控LncROR表達水平后，E-鈣粘蛋白(E-cadherin)和閉合蛋白(occludin)等上皮標志蛋白表達降低，而波形蛋白(vimentin)和N-鈣粘蛋白(N-cadherin)等間質標志蛋白的表達增高；而且shRNA干擾LncROR后，波形蛋白和N-鈣粘蛋白的表達降低，說明LncROR可以通過調控上皮-間質轉化促使乳腺癌的發(fā)生和轉移。本研究結果證明，在抑制LncROR表達后，與對照組相比，CNE-2增殖能力明顯減弱。而且我們用Western blot方法檢測LncROR對凋亡相關蛋白表達變化，結果顯示，抑制LncROR后，活化的caspase-3、caspase-9表達升高，上述結果表明，LncROR表達下降可以減弱CNE-2細胞增殖和抗凋亡能力。隨后，我們還用Western blot方法檢測了上皮-間質轉化相關標志蛋白的水平改變，結果顯示在LncROR表達抑制后，上皮標志蛋白E-鈣粘蛋白、β-連環(huán)蛋白表達升高，間質標志蛋白N-鈣粘蛋白、波形蛋白表達下降。結果證明，LncROR可促進鼻咽癌細胞發(fā)生增殖、抗凋亡及上皮-間質轉化。

綜上所述，LncROR在鼻咽癌組織中高表達，并可以促進鼻咽癌細胞發(fā)生增殖、抗凋亡及上皮-間質轉化。隨著基因組學研究水平的不斷提高，人們對基因表達調控的認識也在持續(xù)提升，一些諸如LncROR等具有重要功能的LncRNA逐漸被發(fā)現(xiàn)[18-20]。隨著該領域研究的不斷深入，LncROR的研究有望從基礎走向臨床，成為鼻咽癌新的診斷指標及治療靶點。