李文謙，施凱楠，朱星揚(yáng)，茅燕勇

（淮陰工學(xué)院，江蘇淮安223003）

磷是作物產(chǎn)量形成和品質(zhì)保證的重要因素，影響著世界上很多國(guó)家的農(nóng)業(yè)發(fā)展[1,2]。只有那些溶解在水中的磷，才能被植物吸收利用，而在土壤栽培過(guò)程中由于磷的吸附和固定作用的存在，使得磷化肥的被作物利用的效率非常低，產(chǎn)生了一系列資源浪費(fèi)問(wèn)題[3-5]。在土壤磷元素轉(zhuǎn)化過(guò)程中，通過(guò)使用解磷微生物來(lái)溶解磷礦粉產(chǎn)生可溶磷，在目前看來(lái)能夠改善磷元素缺乏地區(qū)作物生長(zhǎng)情況，同時(shí)能夠合理利用我國(guó)現(xiàn)有的磷礦資源，以減少資源浪費(fèi)的情況，保持了土壤的肥沃性，還能達(dá)到節(jié)能減排的目的[6-8]。

我國(guó)的磷礦資源雖然豐富，但在品質(zhì)上卻以產(chǎn)出中低品位磷礦粉為主[9,10]，充分利用這些中低品位的磷礦粉，將其中的磷元素釋放出來(lái)，對(duì)我國(guó)磷礦資源的利用具有重要的意義。為此，本文以實(shí)驗(yàn)室篩選自果園的解磷菌作為研究對(duì)象，通過(guò)試驗(yàn)確定解磷菌對(duì)中低品位磷礦粉的最佳溶解工藝條件。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌種和磷礦粉

菌株P(guān)R17為實(shí)驗(yàn)室篩選的解磷真菌。

中低品位磷礦粉，購(gòu)買自濟(jì)南榮冠化工有限公司。

1.1.2 培養(yǎng)基

PDA固體培養(yǎng)基：馬鈴薯 200 g、葡萄糖20 g、瓊脂15～20 g、水 1000 mL。

PDA液體培養(yǎng)基：馬鈴薯 200 g、葡萄糖20 g、水1000 mL。

1.2 方法

試驗(yàn)在裝有50 mL PDA液體培養(yǎng)基的三角瓶中進(jìn)行，同時(shí)加入0.25 g中低品位磷礦粉，作為培養(yǎng)基中的磷源，將分離的細(xì)胞懸液按培養(yǎng)基液體體積比的10%接種到每個(gè)三角瓶中。緊接著放入高壓蒸汽滅菌鍋中，在115℃、0.1 MPa下，滅菌20 min。然后放入28℃的恒溫?fù)u床中，把振蕩速率調(diào)成180 r/min培養(yǎng)5 d。最后取樣，測(cè)定培養(yǎng)基液體中可溶性磷的含量。試驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.1 培養(yǎng)時(shí)間對(duì)解磷菌溶磷能力的影響

設(shè)置7個(gè)初始條件全部相同的平行樣，分別于第1、2、3、4、5、6、7 d 取樣，測(cè)定培養(yǎng)液中可溶性磷含量。

1.2.2 初始pH對(duì)解磷菌溶磷能力的影響

通過(guò)調(diào)節(jié)磷礦粉培養(yǎng)基的初始pH分別為5.5、6.0、6.5、7.0和7.5，在接種后的第5 d進(jìn)行取樣，測(cè)定培養(yǎng)基中可溶性磷的含量、解磷菌菌體濕重。

1.2.3 培養(yǎng)溫度對(duì)解磷菌溶磷能力的影響

將解磷菌株溶解磷礦粉時(shí)搖床培養(yǎng)溫度設(shè)定為20、23、25、28、31 ℃，在接種后第 5 d進(jìn)行取樣，測(cè)定培養(yǎng)基中可溶性磷的含量、解磷菌菌體濕重。

1.2.4 接種量對(duì)解磷菌溶磷能力的影響

將解磷菌株按照接種量體積的1%、3%、5%、7%和10%接種到磷礦粉培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)，在接種后的第5 d對(duì)培養(yǎng)基進(jìn)行取樣，測(cè)定培養(yǎng)基中可溶性磷的含量、解磷菌菌體濕重。

1.2.5 振蕩速率對(duì)解磷菌溶磷能力的影響

將解磷菌株溶解磷礦粉時(shí)搖床振蕩速率設(shè)定為120、140、160、180、200 r/min，在接種后的第 5 d 進(jìn)行取樣，測(cè)定培養(yǎng)基中可溶性磷的含量、解磷菌菌體濕重。

1.2.6 磷礦粉濃度對(duì)解磷菌溶磷能力的影響

將解磷菌株溶解磷礦粉時(shí)的磷礦粉濃度分別設(shè)置為3.5、4、4.5、5、5.5g/L，在接種后的第 5 d 進(jìn)行取樣，測(cè)定培養(yǎng)基中可溶性磷的含量、解磷菌菌體濕重。

1.2.7 碳氮比對(duì)解磷菌溶磷能力的影響

將解磷菌株溶解磷礦粉時(shí)的培養(yǎng)基溶液里的碳氮比分別設(shè)置為10:1、20:1、30:1、40:1和50:1，在接種后的第5 d對(duì)培養(yǎng)基液體進(jìn)行取樣，測(cè)定培養(yǎng)基中可溶性磷的含量、解磷菌菌體濕重。

1.3 測(cè)量指標(biāo)與方法

1.3.1 培養(yǎng)液中可溶性磷含量的測(cè)定

打開紫外分光光度計(jì)，調(diào)節(jié)好待測(cè)波長(zhǎng)后，預(yù)熱30 min待用。將培養(yǎng)了5 d的三角瓶從搖床中取出，先將培養(yǎng)液過(guò)濾（使用無(wú)磷濾紙以減少實(shí)驗(yàn)誤差），然后將過(guò)濾后得到的液體在10000 r/min、4℃下離心20 min，取出后吸取10 mL上清液，再次通過(guò)0.22 μm的微孔濾膜，取5 mL透過(guò)微孔濾膜后的液體，加入50 mL的容量瓶中，補(bǔ)加去離子水至35 mL，然后緩緩加入酚酞指示劑1～2滴，用0.1 mol/L濃度的NaOH溶液中和至待測(cè)液體剛出現(xiàn)微紅色，再精確加入10 mL鉬銻抗顯色劑[11]，搖勻定容后，靜置30 min，之后在700 nm波長(zhǎng)的紫外分光光度計(jì)上，用1 cm光徑比色皿進(jìn)行比色（調(diào)節(jié)分光光度計(jì)的時(shí)候，以空白對(duì)照組的吸收值作為比色零點(diǎn)）。

1.3.2 解磷菌菌體濕重的測(cè)定

為考察菌體生長(zhǎng)與培養(yǎng)液中可溶性磷含量的相關(guān)關(guān)系，在方法1.2.1～1.2.7中測(cè)定可溶性磷含量的同時(shí)測(cè)定菌體濕重。取100 mL培養(yǎng)液，在5000 r/min、4℃下離心10 min，棄上清，稱量濕菌濕重。

2 結(jié)果與分析

2.1 培養(yǎng)時(shí)間對(duì)解磷菌溶解中低品位磷礦粉的影響

接種解磷菌懸液之后，放入搖床培養(yǎng)。每天進(jìn)行可溶性磷含量的檢測(cè)，結(jié)果如圖1。

由圖1可知，培養(yǎng)液中的可溶磷含量在培養(yǎng)第5 d達(dá)到最大值，為25.8 mg/L，說(shuō)明磷礦粉達(dá)到了最大的溶解量，此時(shí)菌體生長(zhǎng)量也最大，菌體濕重為85 g/L。因此，解磷菌溶解中低品位磷礦粉的最佳培養(yǎng)時(shí)間為5 d。

圖1 培養(yǎng)時(shí)間對(duì)解磷菌溶解中低品位磷礦粉的影響Fig.1 Effect of culture time on dissolution of medium and low-grade rock phosphate by phosphate-solubilizing bacteria

2.2 初始pH對(duì)解磷菌溶解中低品位磷礦粉的影響

分別于培養(yǎng)基的初始 pH 5.5、6.0、6.5、7.0 和 7.5 條件下培養(yǎng)5 d，對(duì)含磷礦粉的培養(yǎng)液進(jìn)行可溶性磷含量的檢測(cè)，試驗(yàn)結(jié)果如圖2所示。

圖2 初始pH對(duì)對(duì)解磷菌溶解中低品位磷礦粉的影響Fig.2 Effect of initial pH on dissolution of medium and lowgrade rock phosphate by phosphate-solubilizing bacteria

由圖2可知，菌體生長(zhǎng)量與可溶性磷含量的變化趨勢(shì)一致，均為先上升后下降。在pH 6.5時(shí)，菌體的溶磷效果最好，培養(yǎng)液中可溶磷含量達(dá)到最大值，為28.3 mg/L。這主要因?yàn)榻饬拙L(zhǎng)和繁殖的時(shí)候，培養(yǎng)基中液體的pH值對(duì)其影響比較大，而在液體pH高于或低于菌體的最適pH的時(shí)候，都會(huì)對(duì)菌體生長(zhǎng)產(chǎn)生較大的影響，所以培養(yǎng)基的最適pH為6.5。

2.3 培養(yǎng)溫度對(duì)解磷菌溶解中低品位磷礦粉的影響

分別于 20、23、25、28、31 ℃的恒溫培養(yǎng)搖床中進(jìn)行5 d培養(yǎng)，檢測(cè)可溶性磷含量，試驗(yàn)結(jié)果如圖3所示。

圖3 培養(yǎng)溫度對(duì)解磷菌溶解中低品位磷礦粉的影響Fig.3 Effect of culture temperature on dissolution of medium and low-grade rock phosphate by phosphatesolubilizing bacteria

由圖3可見(jiàn)，在28℃條件下，培養(yǎng)液中的可溶性磷含量達(dá)到了最大值，為29.6 mg/L，高于或低于這個(gè)溫度，培養(yǎng)液中的可溶性磷含量都會(huì)顯著降低；同時(shí)在此溫度下，菌體生長(zhǎng)量也達(dá)到了最大值。說(shuō)明培養(yǎng)菌體時(shí)的環(huán)境溫度對(duì)菌體生長(zhǎng)和繁殖的影響比較大，當(dāng)環(huán)境溫度高出最適溫度或者低于最適溫度的時(shí)候，菌體生長(zhǎng)都會(huì)受到影響。所以，菌體溶解磷礦粉最適溫度為28℃。

2.4 接種量對(duì)解磷菌溶解中低品位磷礦粉的影響

采用1%、3%、5%、7%和10%的接種量培養(yǎng)5 d，試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)圖4。

由圖4可見(jiàn)，當(dāng)接種量為7%時(shí)，可溶性磷含量達(dá)到最大值，為31.3 mg/L，當(dāng)接種量低于這個(gè)值時(shí)，液體中的可溶性磷含量呈上升趨勢(shì)，但當(dāng)接種量大于這個(gè)值時(shí)，液體中的可溶磷含量下降。同時(shí)，菌體生長(zhǎng)量在低于最適接種量時(shí)，呈明顯上升趨勢(shì)；當(dāng)接種量超過(guò)最適值的時(shí)候，菌體生長(zhǎng)量便趨于平緩，這可能是因?yàn)榻臃N量過(guò)大的情況下，培養(yǎng)基中的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)不足，導(dǎo)致解磷效果下降。因此，最適接種量為7%。

圖4 接種量對(duì)解磷菌溶解中低品位磷礦粉的影響Fig.4 Effect of inoculating amount on dissolution of medium and low-grade rock phosphate by phosphate-solubilizing bacteria

2.5 振蕩速率對(duì)解磷菌溶解中低品位磷礦粉的影響

分別于 120、140、160、180、200 r/min 條件下培養(yǎng) 5 d，檢測(cè)可溶性磷含量，試驗(yàn)結(jié)果如圖5所示。

圖5 振蕩速率對(duì)解磷菌溶解中低品位磷礦粉的影響Fig.5 Effect of shaking speed on dissolution of medium and low-grade rock phosphate by phosphate-solubilizing bacteria

由圖5可知，在速率為120～180 r/min時(shí)，培養(yǎng)液中的可溶性磷含量呈明顯上升趨勢(shì)，在振蕩速率為180 r/min條件下，達(dá)到最大值27.8 mg/L，超過(guò)180 r/min的速率時(shí)，液體中可溶磷性含量又明顯降低。同時(shí)，菌體生長(zhǎng)量也在180 r/min的速率下達(dá)到最大值，高于或低于這個(gè)轉(zhuǎn)速，都會(huì)對(duì)菌體生長(zhǎng)和繁殖有較大影響。分析其主要原因，可能是由于振蕩速率太高的情況下，搖床高速振蕩產(chǎn)生過(guò)高的剪切力削弱了菌體的生長(zhǎng)，減少了解磷菌的菌體數(shù)量，并降低了解磷菌的溶磷能力。因此，確定最佳振蕩速率為180 r/min。

2.6 磷礦粉濃度對(duì)解磷菌溶解中低品位磷礦粉的影響

在磷礦粉濃度分別為 3.5、4、4.5、5、5.5 g/L 條件下培養(yǎng)解磷菌，試驗(yàn)結(jié)果如圖6所示。

圖6 不同磷礦粉濃度對(duì)解磷菌溶解中低品位磷礦粉的影響Fig.6 Effect of concentration of phosphate rock powder on dissolution of medium and low-grade rock phosphate by phosphate-solubilizing bacteria

由圖6可以看出，當(dāng)培養(yǎng)基磷礦粉濃度為5 g/L時(shí)，發(fā)酵液中可溶性磷含量達(dá)到最大值，為30.5 mg/L，同時(shí)菌體生長(zhǎng)量也達(dá)到最大值。當(dāng)培養(yǎng)基中磷礦粉濃度為3.5～5.5 g/L時(shí)，液體中可溶性磷含量和菌體生長(zhǎng)量都呈明顯上升趨勢(shì)，但當(dāng)磷礦粉濃度超過(guò)5 g/L時(shí)，可溶性磷的含量隨著磷礦粉濃度的增加而明顯減少。分析其原因，可能是由于本實(shí)驗(yàn)使用的是中低品位磷礦粉，較之質(zhì)量高的磷礦粉，含有較多的雜質(zhì)，包含一些金屬離子等，這些雜質(zhì)又使液體中的可溶性磷沉淀。因此，最佳的磷礦粉濃度為5 g/L。

2.7 碳氮比對(duì)解磷菌溶解中低品位磷礦粉的影響

在碳氮比分別為 10:1、20:1、30:1、40:1、50:1 條件下進(jìn)行培養(yǎng)，結(jié)果如圖7所示。

由圖7可知，在碳氮比為20:1條件下，培養(yǎng)液中的可溶性磷含量達(dá)到最大值，為28.8 mg/L，同時(shí)，菌體生長(zhǎng)量也達(dá)到最大值。但是當(dāng)碳氮比低于或高于最適碳氮比時(shí)，培養(yǎng)液中的可溶性磷含量和菌體生長(zhǎng)量都呈明顯下降趨勢(shì)。培養(yǎng)基中營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)濃度合適時(shí)，解磷菌才能較好的生長(zhǎng)和繁殖，營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)濃度過(guò)低時(shí)不能滿足解磷菌正常的生長(zhǎng)需要，濃度過(guò)高時(shí)則可能對(duì)解磷菌生長(zhǎng)起抑制作用。

圖7 碳氮比對(duì)解磷菌溶解中低品位磷礦粉的影響Fig.7 Effect of carbon-nitrogen ratio on dissolution of medium and low-grade rock phosphate by phosphatesolubilizing bacteria

3 結(jié)論

通過(guò)控制外部條件因素（培養(yǎng)時(shí)間、初始pH、培養(yǎng)溫度、接種量、振蕩速率磷礦粉濃度、碳氮比），研究不同條件下，解磷菌對(duì)中低品位磷礦粉的溶解效果，從而確定解磷菌對(duì)中低品位磷礦粉的最佳溶解工藝條件，即最適初始pH為6.5，最適培養(yǎng)溫度為 28℃，最適接種量為7%，最適振蕩速率為180 r/min，最適磷礦粉濃度為5.0 g/L，最適碳氮比為20:1，培養(yǎng)5 d。通過(guò)使用解磷菌來(lái)溶解磷礦粉產(chǎn)生可溶磷，在目前看來(lái)能夠改善磷元素缺乏地區(qū)作物生長(zhǎng)情況，提高作物的產(chǎn)量。同時(shí)能夠合理利用我國(guó)現(xiàn)有的磷礦資源，保持土壤的肥沃性。這對(duì)于高效利用我國(guó)現(xiàn)有的磷礦資源具有非常深遠(yuǎn)的意義。