方 可 ，李 婷 ，朱艷冰 ，2，3，黃高凌 ，2，3，楊遠帆 ，2，3，倪 輝 *，2，3

（1.集美大學 食品與生物工程學院，福建 廈門361021；2.福建省食品微生物與酶工程重點實驗室，福建 廈門361021；3.廈門市食品生物工程技術研究中心，福建 廈門 361021）

速溶茶粉是以成品茶葉為原料，經水提取、濃縮、干燥等工藝加工而成的可溶性粉狀物質[1]，它是重要的茶葉深加工產品，是加工茶飲料、茶糕點等食品的原料。依據原料茶葉的不同，速溶茶一般可分為速溶紅茶、速溶綠茶、速溶烏龍茶、速溶白茶、速溶黃茶、速溶黑茶、速溶花茶、速溶調配茶等[2]。在速溶茶粉提取生產過程中，由于原料茶葉香氣成分的揮發(fā)及降解和氧化[3]，導致速溶茶粉及其加工產品的香氣遠遠不如原料茶葉。人們先后研究了多種改良速溶茶粉質量的技術，如膜分離技術、低溫濃縮技術、香氣回填技術等[4-5]。此外，人們發(fā)現(xiàn)茶葉產品中含有香氣前體，在酶的作用下可釋放出香氣成分，該方法具有特異性，對其他品質成分影響小[6]；因此，酶工程技術是改良速溶茶粉及其加工產品（茶飲料）風味的重點研究領域。

相關研究表明，茶葉中的香氣前體主要是糖苷類物種，包括單糖苷和二糖苷[7]。β-葡萄糖苷酶（βglucosidase，EC 3.2.1.21）和 α-L-鼠李糖苷酶（α-L-rhamnosidase，EC 3.2.1.40）是兩種重要的糖苷酶，其中β-葡萄糖苷酶水解結合于非還原性末端的β-D-葡萄糖苷鍵[8]；α-L-鼠李糖苷酶水解末端α-L-鼠李糖苷鍵[9]。近年來，人們發(fā)現(xiàn)黑曲霉胞外粗酶可提高速溶茶粉水溶液及茶飲料香氣物質含量[10-11]，并研究了β-葡萄糖苷酶對茶飲料香氣的影響[12]，但尚未系統(tǒng)研究β-葡萄糖苷酶和α-L-鼠李糖苷酶以及這兩種酶的協(xié)同作用對速溶茶粉水溶液及茶飲料等產品香氣的影響。

針對以上研究現(xiàn)狀，以我國產量最大的速溶茶粉--速溶綠茶粉為原料，分別用β-葡萄糖苷酶、α-L-鼠李糖苷酶以及混合酶對速溶綠茶粉水溶液進行處理，綜合運用GC-MS、感官評價和風味強度值（OAV）分析等方法評價香氣特征變化，旨在闡明β-葡萄糖苷酶和α-L-鼠李糖苷酶對速溶綠茶粉水溶液香氣的改良效果，為提高速溶茶粉加工產品的風味提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

噴干型速溶綠茶粉：購于大閩（漳州）食品有限公司；β-葡萄糖苷酶：購于上海源葉生物科技有限公司；黑曲霉α-L-鼠李糖苷酶：作者所在實驗室按照表達純化制備得到。環(huán)己酮、正構烷烴（C8-20）、2-甲基呋喃、2-乙基呋喃、N-乙基吡啶、芳樟醇、壬醛、癸醛、反式-β-羅勒烯、α-萜品烯、萜品油烯、γ-萜品烯、2-庚酮、α-蒎烯、莰烯、β-香葉烯、水芹烯、2-壬酮、α-法尼烯：購于美國Sigma公司；香葉醇、苯甲醛、藏花醛、順式-3-己烯醇、水楊酸甲酯、2-甲基丁酸己酯、傘花烴、檸檬烯、反式-β-羅勒烯、己醇：購于英國Alfa Aesar公司。

1.2 主要儀器

手動 SPME進樣器和 50/30 μm DVB/CAR/PDMS萃取頭：美國Supelco公司產品；Rtx-5MS色譜柱：美國Restek公司產品；QP 2010氣相色譜-質譜聯(lián)用儀 （GC-MS）：成都島津儀器設備有限公司（成都）產品；RO-03A制冰機：日歐制冷設備有限公司（深圳）產品；GZX-DH電熱恒溫干燥箱：上海躍進醫(yī)療器械廠（上海）產品。

1.3 實驗方法

1.3.1 樣品的制備 速溶綠茶粉水溶液 （IGT）：稱取3 g速溶綠茶粉于60 mL頂空瓶中，加入30 mL純水，在40℃水浴鍋中保溫；β-葡萄糖苷酶處理后的速溶綠茶粉水溶液（GIGT）：稱取3 g速溶綠茶粉于60 mL頂空瓶中，加入30 mL純水和β-葡萄糖苷酶（10 U），在40℃水浴鍋中保溫；α-L-鼠李糖苷酶處理后速溶綠茶粉水溶液（LIGT）：稱取3 g速溶綠茶粉于60 mL頂空瓶中，加入30 mL純水和α-L-鼠李糖苷酶（13 U），在40℃水浴鍋中保溫；β-葡萄糖苷酶和α-L-鼠李糖苷酶混合酶處理后的速溶綠茶粉水溶液（GLIGT）：稱取3 g速溶綠茶粉于60 mL頂空瓶中，加入30 mL純水和β-葡萄糖苷酶（10 U）、α-L-鼠李糖苷酶（13 U），在 40 ℃水浴鍋中保溫。

1.3.2 樣品氣味特征的感官評價 根據ISO 8589標準和相關文獻方法對各樣品的青草香、花香、甜香、木香和焦糖香進行感官評價[11，14]。

1.3.3 樣品中揮發(fā)性化合物的分析 樣品在40℃水浴鍋中用50/30 μm DVB/CAR/PDMS萃取頭吸附20 min后進行固相微萃取頂空進樣分析，解吸附時間為3 min，GC-MS分析條件參考文獻[13]。通過特征離子峰和保留指數(shù)與標準品、揮發(fā)性化合物譜庫（NIST08、NIST08s、FFNSC1.3）以及參考文獻進行對照后定性。其中，保留指數(shù) （RIx）借鑒Kratz和Vandendoo[14]方法進行運算。對于2-甲基呋喃和順式-3-己烯醇等27種具有對照標準品的成分，根據它們的標準曲線采用外標法進行定量；其余10種沒有購買到對照標準品的成分通過內標環(huán)己酮標準曲線采用SIM模式（特征碎片為55）進行相對定量分析。

1.3.4 揮發(fā)性成分香氣強度值的計算 香氣強度值（OAV）采用揮發(fā)性成分濃度除以該成分氣味閾值的方式計算。

1.4 數(shù)據統(tǒng)計方法

通過Excell 2013（微軟，美國）計算平均值。采用SPSS-IBM 19.0（IBM，美國）軟件進行顯著性分析和主成分分析。

2 結果與討論

2.1 酶處理對香氣感官特征的影響

如圖1所示，IGT以焦糖香和甜香為主，木香、花香及青草香較弱，此結果與相關研究報道的綠茶香氣特征（主要呈現(xiàn)青草香）不一致[15]，其原因是速溶茶粉加工過程中香氣成分發(fā)生了揮發(fā)、氧化及美拉德反應[3]。相比IGT，GIGT的青草香及花香顯著增強，焦糖香顯著降低，整體香味以青草香、花香、甜香為主；LIGT與IGT相比，焦糖香顯著降低，但其他香氣感官強度沒有顯著變化，整體香氣以焦糖香和甜香為主；GLIGT的焦糖香是所有樣品中最低的，且青草香和花香是所有樣品中最強的，其整體風味呈現(xiàn)出濃郁青草香和甜香以及顯著的花香。對酶處理前后速溶綠茶粉水溶液花香、青草香、甜香、木香和焦糖香進行主成分分析，其結果如圖2所示。其中，主成分1（PC 1）代表63.86%的總變量值，其與甜香、花香、青草香和木香的感官強度數(shù)值呈正相關，而與焦糖香感官強度值呈現(xiàn)負相關（圖2（a））。主成分2（PC 2）與木香、花香和焦糖香的感官評價數(shù)值呈現(xiàn)正相關，與甜香和青草香數(shù)值呈現(xiàn)負相關，可解釋16.96%的總變量（圖2（a））。主成分散點圖顯示4種樣品的香氣特征可歸為兩類（圖2（b）），其中IGT與LIGT同屬一類，GIGT與GLIGT同屬一類，此結果表明，β-葡萄糖苷酶處理會導致速溶綠茶粉水溶液的整體香氣特征顯著變化，可將速溶綠茶粉水溶液的香氣由焦糖香為主轉變成以青草香和甜香為主。Zhu等人研究表明黑曲霉胞外酶處理速溶綠茶粉水溶液，可增強花香和發(fā)酵香，同時減弱青草香、木香和甜香減弱[10]；Ni等人研究發(fā)現(xiàn)用黑曲霉胞外酶處理綠茶水溶液，其烘烤香和蘑菇香增強，同時青草香、焦糖香和木香減弱[13]。這些相關研究與本研究結果顯著不同，其原因是相關研究采用的黑曲霉胞外粗酶液的的酶種類復雜，而作者采用了純化的β-葡萄糖苷酶及α-L-鼠李糖苷酶。

圖1 IGT、GIGT、LIGT和GLIGT感官評價雷達圖Fig.1 Radar map of the sensory evaluations of IGT、GIGT、LIGT and GLIGT

圖2 感官評價的主成分及得分散點圖Fig.2 Principal components and scatter plot of sensory evaluation scores

2.2 酶處理對揮發(fā)性成分組成的影響

采用GC-MS對速溶綠茶粉水溶液及其不同酶處理樣品中的揮發(fā)性物質進行分析，得到總離子流圖（圖3），依據相似度檢索、特征離子碎片分析和標準品比對等方法進行定性分析，共鑒定出37種揮發(fā)性成分（表1）。這些化合物包括3種呋喃類物質、6種醛類物質、4種醇類物質、3種酯類物質、3種酮類物質、14種烯烴類物質和4種其它物質。

定量分析結果（表2）顯示，IGT的主要揮發(fā)性化合物為 3-甲基丁醛 （354.66 μg/L）、2-甲基丁醛（583.44 μg/L）、壬醛（219.46 μg/L）、2-乙基己基水楊酸（411.64 μg/L）、N-吡啶（994.08 μg/L）、2，6-二叔丁基對苯酚（2 135.05 μg/L），此結果與 Qin等人[16]報道的中國綠茶的主要揮發(fā)性化合物是正戊醛、正己醛、檸檬烯、苯甲醛、壬醛、α-萜品醇、水楊酸甲酯、香葉醇和橙花叔醇的結果以及Wu等人[17]報道的武夷綠茶特征香氣成分為芳樟醇、香葉醇、順式-茉莉酮、δ-杜松烯、依蘭烯、α-雪松烯和β-石竹烯的結果不成一致，主要原因是速溶茶粉在加工過程中發(fā)生氧化、縮合、聚合和基團轉移等反應[1，18]。

GIGT中共檢測出37種揮發(fā)性化合物，主要為2-甲基丁醛（404.52 μg/L）、壬醛（254.94 μg/L）、順式-3-己烯醇（3 443.81 μg/L）、香葉醇（1 803.23 μg/L）、δ-杜松烯 （392.11 μg/L）、α-去二氫菖蒲烯（4 10.61 μg/L）、2-乙基己基水楊酸 （577.69 μg/L）、2，6-二叔丁基對苯酚（3 673.16 μg/L）（表 2）。相比IGT中的揮發(fā)性化合物，GIGT中順式-3-己烯醇（0.00 vs 3 443.81 μg/L）、 香葉醇 （0.00 vs 1 803.23 μg/L）、 己醇 （ 0.00 vs 124.68 μg/L）、 水楊酸甲酯（0.00 vs 134.25 μg/L）、苯甲醛（0.00 vs 104.54 μg/L）、癸醛（0.00 vs 95.77 μg/L）、壬醛、2-十一酮、2-乙基己基水楊酸、α-去二氫菖蒲烯、δ-杜松烯、2，6-二叔丁基對苯酚和3，5-二甲基苯酚的含量顯著增加，但3-甲基丁醛、2-甲基丁醛和N-吡啶的含量顯著減少。LIGT中共鑒定出32種揮發(fā)性化合物，相對于IGT，其癸醛（0.00 vs 122.05 μg/L）、壬醛（219.46 vs 351.0 μg/L）、2-乙基己基水楊酸 （411.64 vs 674.55 μg/L）等含量顯著增加。GLIGT中鑒定出37種揮發(fā)性化合物，其主要揮發(fā)性化合物與GIGT中一致，但順式-3-己烯醇（3 443.81 vs 4 017.11 μg/L）、水楊酸甲酯 （134.25 vs 172.66 μg/L）、 壬醛 （254.94 vs 290.6 μg/L）、癸醛（95.77 vs 122.05 μg/L）和 2-十一酮（127.86 vs 256.41 μg/L）、2，6-二叔丁基對苯酚（3 673.16 vs 4 490.56 μg/L）含量進一步提高。以上結果表明，β-葡萄糖苷酶可顯著增加速溶綠茶粉水溶液中多種揮發(fā)性成分的含量，α-L-鼠李糖苷酶也可以增加一些揮發(fā)性成分的含量，且它們對速溶綠茶粉水溶液的揮發(fā)性成分的增加存在協(xié)同增效作用。

根據相關研究報道，β-葡萄糖苷酶處理可顯著增加綠茶湯中順式-3-己烯醇、水楊酸甲酯和芳香族醇含量[12]；漆酶和α-半乳糖苷酶處理可顯著增加綠茶溶液中壬醛含量[19]。作者用β-葡萄糖苷酶處理速溶綠茶粉水溶液，該結果與其他學者相關研究結果相似。此外，本研究發(fā)現(xiàn)α-L-鼠李糖苷酶也能增加速溶綠茶粉水溶液的揮發(fā)性物質成分，同時α-L-鼠李糖苷酶和β-葡萄糖苷酶在增加速溶綠茶粉揮發(fā)性成分方面具有協(xié)同增效作用；這兩方面的尚未見同類研究報道。

圖 3 IGT、GIGT、LIGT、GLIGT、β-葡萄糖苷酶和 α-L-鼠李糖苷酶揮發(fā)性化合物總離子流圖Fig.3 Total ion chromatogram （TIC）of the volatiles in IGT，LIGT，GIGT，GLIGT，β-glucosidase and α-L-rhamnosidase solution

表1 IGT、GIGT、LIGT、GLIGT中揮發(fā)性成分的鑒定及標準曲線Table 1 Identification and standard curves of volatile compounds in IGT、GIGT、LIGT、GLIGT

續(xù)表1

表2 IGT、GIGT、LIGT、GLIGT中揮發(fā)性化合物定量表Table 2 Quantitative determination of volatile components of IGT、GIGT、LIGT、GLIGT

續(xù)表2

2.3 酶處理對揮發(fā)性成分氣味強度值（OVA）的影響

根據GC-MS檢測到的揮發(fā)性成分濃度和相關文獻報道的氣味閾值，計算各成分的OAV值，結果如表3所示。IGT中，3-甲基丁醛（OVA 1773.30）、2-甲基丁 醛 （OVA 583.44）、2-乙 基 呋 喃 （OVA 29.36）、檸檬烯（OVA 4.12）、壬醛（OVA 5.49）等成分的氣味強度達到了正常人體嗅覺可以感知的強度（OAV值大于1）。它們分別呈現(xiàn)出可可味、杏仁味、檸檬味和青草香[20-21]，這與IGT主要呈現(xiàn)出焦糖香和甜香相符合。

GIGT 中 3-甲基丁醛（OVA 1193.55）、2-甲基丁醛（OVA 404.52）、2-乙基呋喃（OVA 26.26）、順式-3-己烯醇（OVA 49.2）、檸檬烯（OVA 4.12）、壬醛（OVA 5.49）、 香葉醇 （OVA 45.05）、 水楊酸甲酯（OVA 3.36）和癸醛（OVA 1.6）的氣味強度可被正常人體嗅覺感知（OAV值大于1）（表3）。這些物質分別呈現(xiàn)青草香、花香和甜香，該結果較好解釋了GIGT的香氣以青草香、花香、甜香為主。LIGT中3-甲 基 丁 醛 （OVA 1290.00）、2- 甲 基 丁 醛 （OVA 493.14）、2-乙基呋喃 （OVA 23.85）、 檸檬烯（OVA 4.17）、壬醛（OVA 8.78）等成分的 OAV 值大于 1，說明這些成分對其整體香氣特征具有影響。LIGT與IGT中各成分的OAV值十分相近，說明其主要氣味貢獻成分與IGT相比沒有發(fā)生顯著變化。GLIGT中3-甲基丁醛 （OAV 1166.90）、2-甲基丁醛（OAV 426.68）、2-乙基呋喃（OAV 23.44）、順式-3-己烯醇（OAV 57.39）、 檸檬 烯 （OAV 4.22）、 壬醛 （OAV 7.26）、香葉醇（OAV 40.53）、水楊酸甲酯（OAV 4.32）和癸醛（OAV 2.03）成分的OAV值大于1，說明這些成分對其整體香氣特征具有影響；該結果與GLIGT顯示出很強的青草香、花香和甜香相符合。另外，相對于GIGT來說，GLIGT中具有青草香的揮發(fā)性化合物的OAV值明顯增加，這就說明α-L-鼠李糖苷酶與β-葡萄糖苷在增強速溶綠茶粉水溶液青草香方面具有協(xié)同作用。

Ni等人通過GC-O實驗發(fā)現(xiàn)黑曲霉胞外粗酶可增加綠茶水溶液揮發(fā)性成分的氣味稀釋倍數(shù)[13]。本研究發(fā)現(xiàn)β-葡萄糖苷酶可提高速溶綠茶粉水溶液青草香和花香成分香氣強度值，該結果與Ni等人的研究[13]相似。同時，本研究還發(fā)現(xiàn)α-L-鼠李糖苷酶與β-葡萄糖苷對速溶綠茶粉水溶液青草香具有協(xié)同增強作用，該結果尚未見同類報道。

表3 IGT、GIGT、LIGT和GLIGT的香氣強度值Table 3 Odor activity values of IGT、GIGT、LIGT and GLIGT

3 結語

速溶綠茶粉水溶液主要呈現(xiàn)甜香與焦糖香。β-葡萄糖苷酶處理可顯著增強速溶綠茶粉水溶液的花香和青草香；α-L-鼠李糖苷酶處理可降低速溶綠茶粉水溶液的焦糖香；β-葡萄糖苷酶和α-L-鼠李糖苷酶對提高速溶綠茶粉水溶液的青草香具有協(xié)同增效作用。該研究為利用β-葡萄糖苷酶和α-L-鼠李糖苷酶提高茶飲料、茶糕點等產品的風味提供了基礎。