陳東,馮林森,王羽豐#昆明醫(yī)科大學(xué)第三附屬醫(yī)院暨云南省腫瘤醫(yī)院干部醫(yī)療科,昆明6508
2昆明醫(yī)科大學(xué)第六附屬醫(yī)院暨云南省玉溪市人民醫(yī)院血液科,云南 玉溪6534050
自1971年Folkman[1]首先提出“實(shí)體惡性腫瘤的生長和轉(zhuǎn)移離不開新生血管”這一觀點(diǎn)后,人們逐漸認(rèn)識到腫瘤的發(fā)展過程與血管新生密切相關(guān),因此,抗腫瘤血管生成的研究不斷深入。腫瘤血管新生的過程受腫瘤微環(huán)境中諸多因素的影響,目前已知的共同調(diào)節(jié)血管生成的信號通路有數(shù)十種,其中血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)和血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子受體2(vascular endothelial growth factor receptor 2,VEGFR2)構(gòu)成的信號通路是作用最強(qiáng)的正性調(diào)控通路之一,對血管新生的整個過程進(jìn)行調(diào)節(jié),發(fā)揮了不可替代的作用。然而有關(guān)VEGF/VEGFR2信號通路上游的分子調(diào)控機(jī)制尚不明確,本文通過總結(jié)調(diào)控該信號通路的潛在靶點(diǎn),以期為相關(guān)研究提供參考。
上皮細(xì)胞膜蛋白2(epithelial membrane protein 2,EMP2)是屬于生長抑制特異性基因3(growth arrest-specific gene 3,GAS3)/外周髓鞘蛋白 22(peripheral myelin protein 22,PMP22)家族的四聚體蛋白[2],廣泛分布于Ⅰ型肺泡細(xì)胞、子宮內(nèi)膜細(xì)胞、皮膚角質(zhì)細(xì)胞、視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞及角膜上皮細(xì)胞中[3-6]。在子宮內(nèi)膜癌、多形性膠質(zhì)母細(xì)胞瘤中,EMP2可正性調(diào)節(jié)VEGF并加速血管生成。Gordon等[7]在子宮內(nèi)膜癌移植瘤模型中發(fā)現(xiàn),EMP2與VEGF的分泌水平呈正相關(guān)。逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(reverse transcription-polymerase chain reaction,RT-PCR)結(jié)果表明,EMP2過表達(dá)組的VEGF mRNA表達(dá)水平升高,EMP2低表達(dá)組的VEGF mRNA表達(dá)水平下降。該研究認(rèn)為,在缺氧的條件下,EMP2可促進(jìn)局部黏著斑激酶(focal adhesion kinase,F(xiàn)AK)和原癌基因SRC活化,從而上調(diào)缺氧誘導(dǎo)因子1A(hypoxia inducible factor 1 subunit alpha,HIF1A)的表達(dá),通過HIF1A依賴途徑誘導(dǎo)VEGF的表達(dá),并最終誘導(dǎo)毛細(xì)血管新生。然而EMP2對HIF1A表達(dá)的調(diào)控機(jī)制仍不明確,需進(jìn)一步研究。Morales等[8]在視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞中也得到了類似的結(jié)果,蛋白質(zhì)印跡(Western blot)和酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(enzyme-linked immunoadsordent assay,ELISA)結(jié)果表明,EMP2過表達(dá)組的VEGF水平較對照組高150%,而EMP2低表達(dá)組的VEGF水平較對照組低57%;采用過表達(dá)EMP2的視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞上清液培養(yǎng)血管內(nèi)皮細(xì)胞后,內(nèi)皮細(xì)胞的遷移和成管能力明顯升高。該研究認(rèn)為,EMP2對VEGF的上調(diào)作用有望成為視網(wǎng)膜疾病抗血管治療的全新靶點(diǎn)。Qin等[9]研究發(fā)現(xiàn),EMP2在膠質(zhì)母細(xì)胞瘤患者中具有較高的特異性。后續(xù)研究發(fā)現(xiàn),EMP2可促進(jìn)多形性膠質(zhì)母細(xì)胞瘤的血管生成,通過增加血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子A(vascular endothelial growth factor A,VEGFA)的分泌與表達(dá),加速內(nèi)皮細(xì)胞遷移和毛細(xì)血管形成;在腫瘤細(xì)胞中加入抗EMP2免疫球蛋白G1(immunoglobulin G1,IgG1)抗體后,VEGFA水平明顯下降[10]。該研究還認(rèn)為,在膠質(zhì)母細(xì)胞瘤中,血腦屏障的完整性被破壞,抗EMP2 IgG1抗體成功通過率提高,有望成為膠質(zhì)母細(xì)胞瘤的新型靶向藥物。此外,Wang等[11]研究發(fā)現(xiàn),EMP2對多形性膠質(zhì)母細(xì)胞瘤的侵襲具有促進(jìn)作用,體內(nèi)試驗(yàn)和體外實(shí)驗(yàn)中應(yīng)用EMP2抗體后,腫瘤細(xì)胞數(shù)量明顯減少,腫瘤負(fù)荷明顯下降。
雖然上述研究中應(yīng)用EMP2抗體對VEGF的抑制效果可觀,但其作用機(jī)制可能不僅僅局限于抗血管生成,且遠(yuǎn)期療效仍需大量研究證實(shí)。此外,不同的惡性腫瘤中,EMP2扮演著截然不同的角色。在B細(xì)胞淋巴瘤、鼻咽癌、泌尿上皮癌中,EMP2可促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡,抑制腫瘤進(jìn)展及侵襲[11-13];而在乳腺癌、子宮內(nèi)膜癌、卵巢癌和膠質(zhì)母細(xì)胞瘤中,EMP2的表達(dá)明顯上調(diào),其表達(dá)水平與腫瘤的進(jìn)展和侵襲呈正相關(guān),研究認(rèn)為EMP2可成為上述4種腫瘤的預(yù)后標(biāo)志物,并有望成為潛在的治療靶點(diǎn)[14-16]。
微小RNA-29a(microRNA-29a,miRNA-29a)屬于miRNA-29家族成員(miRNA-29a/b/c)之一,大量研究已證實(shí)miRNA-29a與腫瘤細(xì)胞的增殖、凋亡[17]、侵襲[18]、預(yù)后[19]、耐藥[20]等有關(guān)。在胃癌中,miRNA-29可通過抑制VEGFA的表達(dá)減少腫瘤血管新生。李學(xué)成等[21]應(yīng)用定量聚合酶鏈反應(yīng)(quantitative polymerase chain reaction,qPCR)和ELISA技術(shù)分別檢測50例胃癌患者的血清miRNA-29a及VEGFA水平,發(fā)現(xiàn)兩者的表達(dá)呈負(fù)相關(guān);根據(jù)miRNA-29a的表達(dá)水平,將113例胃癌組織分為高表達(dá)組和低表達(dá)組,免疫組織化學(xué)染色結(jié)果顯示,高表達(dá)組中VEGFA的表達(dá)量明顯高于低表達(dá)組。王國威等[22]采用雙熒光素酶實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步明確,miRNA-29a可直接與VEGFA mRNA的3'UTR相應(yīng)位點(diǎn)結(jié)合,促進(jìn)VEGFA mRNA的降解,從而下調(diào)VEGFA的表達(dá)水平。體內(nèi)研究證實(shí),miRNA-29a可明顯抑制裸鼠移植瘤生長,并降低移植瘤內(nèi)微血管密度(microvascular density,MVD),該結(jié)果可能與miRNA-29a抑制VEGFA的表達(dá)有關(guān)[23]。Zhang 等[24]研究發(fā)現(xiàn),miRNA-29a/c過表達(dá)可降低胃癌細(xì)胞中VEGFA的表達(dá)水平,將胃癌細(xì)胞與內(nèi)皮細(xì)胞共培養(yǎng)后,內(nèi)皮細(xì)胞的生長、增殖和管腔形成明顯受到抑制;細(xì)胞微泡能夠有效地將miRNA-29a/c運(yùn)輸至胃癌細(xì)胞內(nèi),某種程度上發(fā)揮了載體和保護(hù)的功能。
有關(guān)miRNA的研究為靶向或基因治療提供了新的臨床思路,雖然miRNA-29a能有效抑制VEGF的分泌與表達(dá),但其抗血管生成效果及安全性還需進(jìn)一步研究。
諸多研究發(fā)現(xiàn),微小RNA-377(microRNA-377,miRNA-377)可抑制食管癌和胃癌的發(fā)展,并通過抑制VEGF的表達(dá)調(diào)控血管生成。Li等[25]研究發(fā)現(xiàn),miRNA-377在食管鱗癌組織標(biāo)本及患者血清中的表達(dá)水平均明顯下降,其表達(dá)水平與患者的生存期呈正相關(guān),與病理分期、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移均呈負(fù)相關(guān);miRNA-377過表達(dá)可抑制食管鱗癌的生長、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移及血管生成,而miRNA-377低表達(dá)后結(jié)果相反;熒光素酶實(shí)驗(yàn)證實(shí)miRNA-377可直接結(jié)合VEGF的3'UTR。Wang等[26]研究發(fā)現(xiàn),胃癌細(xì)胞及組織標(biāo)本中miRNA-377的表達(dá)量均低于正常細(xì)胞及組織;體外實(shí)驗(yàn)中,miRNA-377過表達(dá)可抑制胃癌細(xì)胞的生長及遷移;構(gòu)建pcDNA 3.1-VEGFA載體后,miRNA-377對VEGFA的抑制效果可發(fā)生逆轉(zhuǎn),進(jìn)一步證實(shí)了miRNA-377可通過下調(diào)VEGFA的表達(dá)抑制胃癌的進(jìn)展。Wen等[27]在體外實(shí)驗(yàn)中將miRNA-377抑制劑轉(zhuǎn)染至人臍靜脈內(nèi)皮細(xì) 胞(human umbilical vein endothelial cell,HUVEC),結(jié)果發(fā)現(xiàn),miRNA-377抑制劑可促進(jìn)管腔形成;在心肌缺血大鼠模型中,敲除內(nèi)源性miRNA-377可直接上調(diào)VEGF的表達(dá),進(jìn)而刺激間質(zhì)干細(xì)胞介導(dǎo)的血管生成,減少心肌纖維化并改善心肌功能。
微小 RNA-101(microRNA-101,miRNA-101)在腫瘤中的作用機(jī)制成為另一個研究熱點(diǎn),越來越多的研究發(fā)現(xiàn)其與血管生成關(guān)系密切,并主要負(fù)性調(diào)節(jié)血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子C(vascular endothelial growth factor C,VEGFC)的表達(dá),對 VEGFR2的磷酸化也有增強(qiáng)作用。Deng等[28]在肝內(nèi)膽管癌細(xì)胞和組織標(biāo)本中發(fā)現(xiàn),miRNA-101可直接下調(diào)VEGFC的表達(dá)水平,從而抑制肝內(nèi)膽管癌細(xì)胞的侵襲和遷移。Liu等[29]在肝癌組織和細(xì)胞中也發(fā)現(xiàn)了類似的結(jié)果。Li等[30]在鉑耐藥胃癌細(xì)胞中證實(shí),miRNA-101的表達(dá)水平明顯下降,并且與VEGFC水平呈負(fù)相關(guān),將miRNA-101類似物轉(zhuǎn)染至胃癌細(xì)胞后,胃癌細(xì)胞的增殖率下降,凋亡率升高。Lei等[31]在體外實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn),miRNA-101可直接下調(diào)VEGFC的表達(dá),并抑制膀胱癌細(xì)胞的侵襲和遷移;細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,miRNA-101可以提高膀胱癌細(xì)胞對順鉑化療的敏感性。以上3項(xiàng)研究均采用熒光素酶法證實(shí)VEGFC是miRNA-101的直接靶點(diǎn),但有關(guān)miRNA-101與血管生成關(guān)系的研究仍需進(jìn)一步完善。Kim等[32]在體外研究中發(fā)現(xiàn)miRNA-101對缺氧條件敏感,將外源性miRNA-101轉(zhuǎn)染至HUVEC后,可上調(diào)血紅素氧化酶-1(heme oxygenase-1,HO-1)的表達(dá),進(jìn)而促進(jìn)HIF1A介導(dǎo)的VEGF表達(dá);此外,過表達(dá)的miRNA-101還可加強(qiáng)VEGFR2的磷酸化作用,并促進(jìn)其下游效應(yīng)蛋白的表達(dá),如FAK、蛋白激酶B(protein kinase B,PKB,又稱AKT)、內(nèi)皮型一氧化氮合酶(endothelial nitric oxide synthase,eNOS)、細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶(extracellular regulated protein kinase,ERK),最終促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞增殖、遷移及管腔形成;在下肢缺血小鼠模型中發(fā)現(xiàn),miRNA-101可明顯改善缺血下肢血流情況,增加毛細(xì)血管數(shù)量。Liu等[33]在胃癌細(xì)胞和組織標(biāo)本中發(fā)現(xiàn)miRNA-101、miRNA-27b、miRNA-128可抑制VEGFC的表達(dá),并與MVD呈負(fù)相關(guān);體外實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),三者的表達(dá)可減少VEGFC的分泌,進(jìn)而抑制內(nèi)皮細(xì)胞增殖、遷移以及管腔形成;但3種miRNA之間并未發(fā)現(xiàn)協(xié)同作用,仍需進(jìn)一步研究。
光導(dǎo)蛋白樣蛋白(phosducin-like protein,PhLP)是一種保守型蛋白家族,具有與硫氧還原蛋白相似的結(jié)構(gòu)域,最初被認(rèn)為是G蛋白信號通路的調(diào)節(jié)器。該蛋白家族成員包括PhLP1、PhLP2A(又稱為PDCL3)、PhLP2B和PhLP3[34]。PDCL3可調(diào)節(jié)VEGFR2的穩(wěn)態(tài),并在缺氧情況下促進(jìn)血管生成。
體外研究發(fā)現(xiàn),作為一種新型蛋白,PDCL3與VEGFR2的穩(wěn)定性有關(guān),并扮演該受體分子伴侶的角色[35]。無需VEGF配體介導(dǎo)的磷酸化,PDCL3便能與VEGFR2的近膜域結(jié)合,通過抑制VEGFR2的泛素化和降解,從而調(diào)控其表達(dá)量。PDCL3還可以促進(jìn)VEGF誘導(dǎo)的酪氨酸磷酸化。此外,VEGFR2介導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞增殖和毛細(xì)血管形成同樣需要PDCL3的參與。PDCL3調(diào)控了VEGFR2的表達(dá)量與功能,并在后續(xù)的血管生成中發(fā)揮了重要作用。Srinivasan等[36]研究發(fā)現(xiàn),PDCL3位于細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)以及細(xì)胞質(zhì)間隔,主要與細(xì)胞內(nèi)的VEGFR2結(jié)合,可協(xié)助VEGFR2折疊,再次證實(shí)其分子伴侶的作用。體外實(shí)驗(yàn)中,通過干擾小RNA(small interfering RNA,siRNA)沉默HUVEC的PDCL3表達(dá)后,VEGFR2酪氨酸激酶磷酸化對VEGF配體的敏感性明顯下降。在斑馬魚和小鼠實(shí)驗(yàn)中,PDCL3同樣展現(xiàn)了其促血管生成的生物學(xué)意義。另外,缺氧條件能夠上調(diào)PDCL3的表達(dá),進(jìn)一步加深了人們對缺氧條件促血管生成機(jī)制的了解。然而,PDCL3還可能受其他血管生成因子的調(diào)控。有研究在人卵巢上皮癌裸鼠移植瘤模型中發(fā)現(xiàn),貝伐珠單抗組和阿帕替尼組的PDCL3表達(dá)量均高于對照組,認(rèn)為PDCL3可能與抗血管藥物的耐藥有關(guān)[37]。
由于目前腫瘤抗血管治療產(chǎn)生的耐藥限制了其療效,干擾PDCL3的表達(dá)在理論上可能會增加腫瘤患者對抗血管藥物的獲益,但PDCL3在各類腫瘤中是否異常表達(dá)需要進(jìn)一步研究證實(shí)。
載脂蛋白A-I結(jié)合蛋白(apoA-I binding protein,AIBP)是應(yīng)用酵母雙雜交技術(shù)從人肝臟cDNA文庫中篩選的一種分泌蛋白,主要由高密度脂蛋白(high density lipoprotein,HDL)組成,可與載脂蛋白A-I結(jié)合[38-39]。Fang等[40]研究發(fā)現(xiàn),AIBP介導(dǎo)的膽固醇流出可對新生血管進(jìn)行負(fù)性調(diào)控。在內(nèi)皮細(xì)胞中發(fā)現(xiàn),AIBP可與HDL協(xié)同促進(jìn)膽固醇流出,抑制了VEGF介導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞管腔形成。該研究還發(fā)現(xiàn),膽固醇流出也影響了細(xì)胞膜上的脂筏結(jié)構(gòu),脂筏的破壞阻礙了細(xì)胞膜表面VEGFR2的二聚化,使VEGF/VEGFR2信號的傳導(dǎo)受到抑制。此外,該信號通路中多種蛋白激酶(如VEGFR2、FAK、ERK1/2、AKT)的磷酸化也部分減弱。將人類 AIBP(human apoA-I binding protein,hAIBP)及斑馬魚 AIBP2(zebrafish apoA-I binding protein 2,zAIBP2)基因轉(zhuǎn)染至HEK293細(xì)胞,隨后移植入小鼠主動脈環(huán),與對照組相比,hAIBP組和zAIBP2組主動脈環(huán)處的血管生成明顯受到抑制。體外實(shí)驗(yàn)中,研究者運(yùn)用嗎啉代寡核苷酸抑制了斑馬魚胚胎中zAIBP2的表達(dá),發(fā)現(xiàn)前段動脈的脂筏數(shù)量和新生血管明顯增加;而補(bǔ)充了足量的HDL后,zAIBP2的缺失效應(yīng)得以彌補(bǔ),膽固醇流出再次加強(qiáng),前段動脈脂筏數(shù)量減少,血管新生受到抑制。Western blot結(jié)果證實(shí),zAIBP2的低表達(dá)提高了VEGFR2信號通路的磷酸化水平,并且促進(jìn)了血管生成素-1受體TIE2、VEGFR3、Friend白血病病毒整合素-1(Friend leukemia integration-1,F(xiàn)LI-1)及其他血管生成因子的表達(dá)。
在體內(nèi)外研究中,AIBP能夠促進(jìn)膽固醇流出從而調(diào)節(jié)脂筏數(shù)量以及VEGFR2信號通路,最終調(diào)控血管生成。值得注意的是,膽固醇代謝紊亂與惡性腫瘤密切相關(guān)[41],AIBP介導(dǎo)的膽固醇流出能否對腫瘤血管生成進(jìn)行調(diào)控,值得進(jìn)一步深究。
惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展與血管新生密切相關(guān),抑制血管新生是一種有效的治療手段。在過去的幾十年中,對VEGF/VEGFR2信號通路的體內(nèi)外研究取得了大量的成果,已有大量抗血管生成藥物,如VEGF單克隆抗體貝伐珠單抗和阿柏西普,VEGFR2酪氨酸激酶抑制劑阿帕替尼、索拉非尼、蘇尼替尼等已應(yīng)用于臨床,大量Ⅲ期臨床試驗(yàn)證實(shí)抗血管治療提高了晚期非小細(xì)胞肺癌、卵巢癌、胃癌、結(jié)直腸癌患者的無進(jìn)展生存時間和(或)總生存時間,但仍有一些問題亟須解決:①需發(fā)現(xiàn)特異性生物標(biāo)志物明確抗血管治療獲益人群[42];②單一抗血管治療并不理想,需與化療及其他治療方案聯(lián)合[43];③抗血管治療數(shù)月后發(fā)生耐藥,機(jī)制尚不明確[44];④部分患者對不良反應(yīng)無法耐受,最佳藥物劑量與時間還需優(yōu)化[45];⑤抗血管治療并非適用于所有實(shí)體瘤,也有可能促進(jìn)病情進(jìn)展[46]。VEGF/VEGFR2信號通路的調(diào)控機(jī)制是未來的研究方向,臨床研究者仍需對腫瘤血管生成機(jī)制進(jìn)行深入研究,為腫瘤治療提供新的方向和策略。