徐 鳳，毛藝純，周淑芬，商 華

(牡丹江醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院，黑龍江 牡丹江 157011)

潰瘍性結(jié)腸炎(UC)是一種原因不明的慢性自身免疫性腸炎，具有易復(fù)發(fā)、易引起并發(fā)癥的特點[1]。研究學(xué)者認為，本病的發(fā)病基礎(chǔ)是當腸道黏膜屏障功能減弱時，腸道致病菌和毒素更加容易通過腸道黏膜引發(fā)局部免疫反應(yīng)[2-4]。研究發(fā)現(xiàn)，黏膜屏障在潰瘍性結(jié)腸炎發(fā)病過程中發(fā)揮了極其重要的作用[5]，因此保護腸道黏膜屏障對治療潰瘍性結(jié)腸炎至關(guān)重要[6]。近年來，中醫(yī)在潰瘍性結(jié)腸炎防治方面顯現(xiàn)出較大優(yōu)勢。半夏瀉心湯方出自張仲景的《傷寒論》，由半夏、干姜、黃連、黃芩、大棗、人參、甘草組成，具有補瀉兼施、辛開苦降、調(diào)暢氣機、寒溫并用的配伍特點，可治療氣機阻滯、脾胃同病，因而被廣泛應(yīng)用于胃炎、胃潰瘍、慢性潰瘍性結(jié)腸炎等疾病的治療[7-9]。有關(guān)對潰瘍性結(jié)腸炎的治療作用，大多文獻著重于其臨床觀察[9]，而對于機制研究如對腸道黏膜屏障的保護作用鮮見報道。故本研究觀察了半夏瀉心湯對三硝基苯磺酸(TNBS)誘導(dǎo)的潰瘍性結(jié)腸炎小鼠模型黏膜屏障功能的保護作用以及緊密連接相關(guān)蛋白閉鎖小帶蛋白-1(ZO-1)和閉鎖蛋白(Occludin)表達的影響。

1 材料

1.1 實驗動物

清潔級健康BALB/c小鼠70只，體質(zhì)量(25±2)g，購于哈爾濱醫(yī)科大學(xué)實驗動物學(xué)中心(實驗動物合格證號SCXK(黑)2015-001，實驗動物使用許可證號SYXK(黑)2015-007)。

1.2 實驗藥物

半夏瀉心湯組成：半夏12 g，干姜9 g，黃芩9 g，人參9 g，甘草9 g，黃連3 g，大棗12 g。精確稱取上述藥物浸泡30 min(人參提前浸泡24 h)，煎煮2次，每次30 min，4層紗布過濾，合并濾液水浴蒸發(fā)制成1 g/mL生藥的水煎液，高溫滅菌，冰箱4 ℃保存待用。

1.3 主要試劑

TNBS(美國Sigma公司，貨號P2297)；柳氮磺吡啶腸溶片(SASP，上海福達制藥有限公司，國藥準字：H31020840)；ZO-1和Occludin一抗(英國abcam公司，貨號分別為xy00046，YH-02495 m)；山羊抗小鼠熒光二抗(美國Abbkine公司，貨號分別為A23227，A23210)。

2 方法

2.1 潰瘍性結(jié)腸炎小鼠模型建立

小鼠按隨機數(shù)字表法分為正常對照組12只，模型組58只。模型組小鼠禁食不禁水24 h后麻醉(10%水合氯醛腹腔麻醉，0.25 mL/100 g)，以改良的小鼠灌胃針一次性將TNBS(70 mg/kg)溶液輕緩注入小鼠腸腔內(nèi)，提尾倒立1 min待自然清醒。正常對照組按照同樣方法以同等劑量的生理鹽水代替TNBS灌腸。

2.2 分組與給藥

模型建立3 d后隨機處死10只小鼠取結(jié)腸，如若觀察到明顯的潰瘍面說明模型建立成功。將模型建立成功的小鼠按隨機數(shù)字表法分為正常組、模型組、半夏雞心湯4.5 g/kg組、半夏雞心湯9.0 g/kg組和陽性對照組，模型組給予生理鹽水灌胃，參照文獻[10]進行劑量換算及預(yù)實驗結(jié)果，半夏瀉心湯4.5 g/kg組給予4.5 g/kg半夏瀉心湯水煎液灌胃，半夏瀉心湯9.0 g/kg組給予9.0 g/kg半夏瀉心湯水煎液灌胃，陽性對照組給予0.5 g/kg SASP灌胃，每組各12只。正常對照組以同等劑量的生理鹽水代替半夏瀉心湯灌胃。各組于造模后第3天開始灌胃，每日1次，連續(xù)21 d。

2.3 病變活動指數(shù)(DAI)評分[11]

DAI評分標準：體質(zhì)量下降<1%計0分；體質(zhì)量下降1%～5%計1分；體質(zhì)量下降6%～10%計2分；體質(zhì)量下降10%～15%計3分；體質(zhì)量下降>15%計4分。大便性狀：成形大便計0分；不黏附于肛門的糊狀、半成形大便計2分；可黏附于肛門的稀水樣便計3分；血便計4分。大便隱血：正常計0分；隱血陽性計2分；肉眼血便計4分。DAI=(體質(zhì)量下降評分+大便性狀評分+大便隱血評分)/3。

2.4 血清及標本采集

末次給藥后禁食不禁水24 h，每組分別取6只小鼠麻醉(10%水合氯醛腹腔麻醉，0.25 mL/100 g)，腹主動脈采血，3000 r/min離心10 min取上清，冰箱-20 ℃保存、待測。采血后處死小鼠，取出結(jié)腸段量取結(jié)腸長度。

2.5 結(jié)腸黏膜損傷指數(shù)(CMDI)[11]

CMDI評分標準：無損傷計0分；局部充血、水腫但未出現(xiàn)潰瘍計1分；充血且腸壁變厚但無潰瘍計2分；有潰瘍僅有1處出現(xiàn)炎癥計3分；潰瘍較大，直徑約1～2 cm，但腸管與外周臟器無黏連計4分；有多處潰瘍和炎癥，至少有1處潰瘍大小>1 cm，與周圍臟器黏連嚴重計5分。

2.6 結(jié)腸組織病理學(xué)評分(HS)[6]

結(jié)腸組織經(jīng)多聚甲醛固定，常規(guī)石蠟包埋，HE染色，鏡下觀察結(jié)腸黏膜形態(tài)學(xué)變化進行HS。HS包括炎癥、炎癥范圍(%)、隱窩損傷、損傷深度。各項具體評分標準：炎癥：無計0分；輕度計1分；中度計2分；重度計3分；炎癥范圍(%)：1%～25%計1分；26%～50%計2分；51%～75%計3分；76%～100%計4分。隱窩損傷：無計0分；基底部1/3隱窩破壞計1分；基底部2/3隱窩破壞計2分；僅表面上皮完整計3分；全部隱窩和上皮破壞計4分。損傷深度：黏膜層計2分；黏膜及黏膜下層計3分；全層計4分。HS=炎癥評分+炎癥范圍(%)評分+隱窩損傷評分+損傷深度評分。

2.7 髓過氧化物酶(MPO)活性測定

稱取結(jié)腸組織50 mg，采用0.5%HTBA 溶液制成5%的勻漿，4 ℃以14000 r/min離心15 min取上清，嚴格按照MPO試劑盒操作說明書檢測MPO活性。

2.8 血清二胺氧化酶(DAO)和D-乳酸(D-LA)水平測定

嚴格按照ELISA試劑盒操作說明書檢測血清DAO和D-LA的水平。

2.9 黏膜通透性評價

末次給藥后禁食不禁水24 h，各組分別取6只小鼠放置代謝籠中。口服乳果糖(L)和甘露醇(M)混合溶液2 mL，并進行30 min內(nèi)禁水、2 h內(nèi)禁食。收集24 h內(nèi)尿液，3000 r/min離心10 min，取10 mL尿液加入2 mL 0.2 g/L硫柳汞防腐后-70 ℃凍存。高壓液相色譜試差法測定尿液中L和M含量，計算L/M值。

2.10 Western blot分析檢測ZO-1和Occludin的表達

結(jié)腸組織勻漿后加入適量RIPA裂解液，10000 r/min 4 ℃離心10 min，取上清液BCA法測定總蛋白濃度。取30 μg蛋白上樣后進行10% SDS-PAGE凝膠電泳。當電泳完成后，半干轉(zhuǎn)將蛋白從凝膠上轉(zhuǎn)至PVDF膜上，5%脫脂牛奶封閉。一抗孵育過夜，PBST沖洗后二抗孵育，ECL 發(fā)光試劑發(fā)光，膠片曝光、顯影定影。掃描圖像，凝膠圖像分析軟件分析條帶積分值。

2.11 統(tǒng)計學(xué)方法

3 結(jié)果

3.1 半夏瀉心湯對潰瘍性結(jié)腸炎模型小鼠DAI評分的影響

表1顯示，在實驗過程中，正常對照組小鼠未見稀便和血便，精神佳，活動正常，毛發(fā)較為光澤，食欲好，體質(zhì)量增加較快。模型組小鼠明顯可見稀便和血便，精神萎靡不振，活動減少，飲食飲水明顯減少，體質(zhì)量下降；半夏瀉心湯4.5 g/kg組、半夏瀉心湯9.0 g /kg組和陽性對照組小鼠早期雖然可見稀便和血便、體質(zhì)量下降、食欲差等癥狀，但是癥狀程度不及模型組嚴重，后期可見稀便和血便逐漸緩解，飲食逐漸好轉(zhuǎn)，體質(zhì)量逐步增加。與正常對照組比較，模型組小鼠DAI評分顯著增高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)；與模型組比較，半夏瀉心湯4.5 g/kg組、半夏瀉心湯9.0 g/kg組和陽性對照組小鼠在給藥7 d后DAI評分顯著降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05或P<0.01)。

表1 各組小鼠DAI評分測定結(jié)果(分，

注：與正常對照組比較：﹡P<0.05，﹡﹡P<0.01；與模型組比較：﹟P<0.05，﹟﹟P<0.01

3.2 半夏瀉心湯對潰瘍性結(jié)腸炎模型小鼠結(jié)腸長度和CMDI的影響

圖1表2顯示，正常對照組小鼠可見結(jié)腸呈粉紅色，均勻細長，色澤較為一致；模型組小鼠可見結(jié)腸充血且增厚，出現(xiàn)明顯的潰瘍，黏膜呈黑褐色并有表面壞死；半夏瀉心湯4.5 g/kg組、半夏瀉心湯9.0 g/kg組和陽性對照組小鼠結(jié)腸明顯恢復(fù)，充血減輕，僅見散在小潰瘍，顏色趨于粉紅色，壞死減輕。與正常對照組比較，模型組顯著縮短小鼠結(jié)腸長度，顯著升高CMDI，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)；與模型組比較，半夏瀉心湯4.5 g/kg組、半夏瀉心湯9.0 g/kg組和陽性對照組顯著延長小鼠結(jié)腸長度，顯著降低CMDI，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05或P<0.01)。

表2 各組小鼠結(jié)腸長度、CMDI和HS測定結(jié)果

注：與正常對照組比較：﹡P<0.05，﹡﹡P<0.01；與模型組比較：﹟P<0.05，﹟﹟P<0.01

圖1 各組小鼠結(jié)腸組織大體外觀比較

3.3 半夏瀉心湯對潰瘍性結(jié)腸炎模型小鼠HS的影響

圖2表2HE染色結(jié)果顯示，正常對照組小鼠結(jié)腸未見潰瘍及壞死，黏膜上皮完整；模型組小鼠結(jié)腸黏膜及黏膜下層大量炎細胞浸潤，上皮壞死脫落；半夏瀉心湯4.5 g/kg組、半夏瀉心湯9.0 g/kg組和陽性對照組小鼠結(jié)腸黏膜及黏膜下層少見炎細胞浸潤。與正常對照組比較，模型組小鼠HS顯著升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)；半夏瀉心湯4.5 g/kg組、半夏瀉心湯9.0 g/kg組和陽性對照組HS顯著降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05或P<0.01)。

3.4 半夏瀉心湯對潰瘍性結(jié)腸炎模型小鼠結(jié)腸組織中MPO活性、血清DAO和D-LA水平、黏膜通透性的影響

表3顯示，與正常對照組比較，模型組小鼠結(jié)腸組織中MPO活性、血清DAO和D-LA水平、尿中L/M值顯著增高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)；與模型組比較，半夏瀉心湯4.5 g/kg組、半夏瀉心湯9.0 g/kg組和陽性對照組小鼠結(jié)腸組織中MPO活性、血清DAO和D-LA水平、尿中L/M值顯著降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05或P<0.01)。

A.正常對照組；B.模型組；C.半夏瀉心湯4.5 g/kg組；D.半夏瀉心湯9.0 g/kg組；E.陽性對照組圖2 各組小鼠結(jié)腸組織HE染色結(jié)果比較(HE染色 200×)

組別鼠數(shù)MPO活性(U/mg)DAO(U/mL)D-LA(μg/mL)L/M值正常對照組60.17±0.0042.63±0.1941.0779±0.04816.30±1.71模型組62.49±0.283﹡﹡4.51±0.317﹡﹡1.564±0.110﹡﹡42.21±5.32﹡﹡半夏瀉心湯4.5 g/kg組61.31±0.124﹟3.32±0.221﹟1.234±0.059﹟25.66±2.94﹟半夏瀉心湯9.0 g/kg組61.22±0.105﹟﹟2.96±0.209﹟﹟1.209±0.055﹟﹟22.84±2.70﹟﹟陽性對照組61.08±0.093﹟﹟2.85±0.203﹟﹟1.149±0.053﹟﹟20.32±2.61﹟﹟

注：與正常對照組比較：﹡P<0.05，﹡﹡P<0.01；與模型組比較：﹟P<0.05，﹟﹟P<0.01

3.5 半夏瀉心湯對潰瘍性結(jié)腸炎模型小鼠ZO-1和Occludin表達的影響

圖3表4顯示，與正常對照組比較，模型組小鼠結(jié)腸ZO-1和 Occludin表達均顯著降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)；與模型組比較，半夏瀉心湯4.5 g/kg組、半夏瀉心湯9.0 g/kg組和陽性對照組小鼠結(jié)腸ZO-1和Occludin表達均顯著升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05或P<0.01)。

注：A.正常對照組；B.模型組；C.半夏瀉心湯4.5 g/kg組；D.半夏瀉心湯9.0 g/kg組；E.陽性對照組圖3 Western bolt分析結(jié)果

組別相對表達水平ZO-1Occludin正常對照組1.087±0.1451.024±0.139模型組0.173±0.023﹡﹡0.076±0.010﹡﹡半夏瀉心湯4.5 g/kg組0.463±0.067﹟0.408±0.062﹟﹟半夏瀉心湯9.0 g/kg組0.714±0.109﹟﹟0.502±0.075﹟﹟陽性對照組0.929±0.140﹟﹟0.586±0.093﹟﹟

注：與正常對照組比較：﹡P<0.05，﹡﹡P<0.01；與模型組比較：﹟P<0.05，﹟﹟P<0.01

4 討論

研究發(fā)現(xiàn)，潰瘍性結(jié)腸炎發(fā)病的始動因素之一可能是由于腸道黏膜屏障的功能受損[12]。若腸道黏膜屏障的功能異常，則會引起腸道內(nèi)的抗原物質(zhì)移位至腸黏膜固有層，進而促進腸道釋放促炎因子，破壞腸道上皮細胞，最終導(dǎo)致腸道黏膜屏障功能受損[13]。因此可以認為，假使采用有效的手段使腸道黏膜屏障功能增強，則會對潰瘍性結(jié)腸炎的治療產(chǎn)生積極意義。本次實驗研究表明，給予半夏瀉心湯治療的潰瘍性結(jié)腸炎模型小鼠DAI評分，CMDI和HS結(jié)腸長度有所延長，提示半夏瀉心湯可能對潰瘍性結(jié)腸炎具有積極作用。

中性粒細胞中含MPO酶較高，因此MPO活性的高低可以間接評價中性粒細胞浸潤的數(shù)量及程度。DAO可評價腸黏膜屏障功能的狀態(tài)，因其是存在于腸道黏膜上皮細胞中的細胞內(nèi)酶，如果有腸道黏膜上皮損傷，就會使DAO從破裂的上皮細胞溢出進而進入血液，因此DAO升高能夠間接反映腸道黏膜上皮細胞的損傷程度[14]。D-LA是細菌發(fā)酵的代謝產(chǎn)物，D-LA升高是由于其通過受損黏膜入血，故此可用于評價腸道黏膜損害程度[15]。本次實驗研究表明，給予半夏瀉心湯治療的潰瘍性結(jié)腸炎模型小鼠MPO活性降低，DAO和D-LA水平降低，提示半夏瀉心湯可能對潰瘍性結(jié)腸炎模型小鼠腸道黏膜屏障功能具有良好的保護作用。

腸道上皮細胞旁路通透性異常升高是潰瘍性結(jié)腸炎的特征之一，也是導(dǎo)致炎癥反應(yīng)的主要因素，主要是因其通透性升高對腸道內(nèi)的致病菌和毒素的屏蔽作用減弱，從而使致病菌和毒素通過并進入上皮下層。為準確反映腸道黏膜的通透性變化，可以采用測定尿中L/M值的變化，如若L/M值增高，代表腸道通透性升高，說明腸道黏膜屏障功能受到破壞[16]。本次實驗研究表明，給予半夏瀉心湯治療的潰瘍性結(jié)腸炎模型小鼠L/M值降低。進一步提示半夏瀉心湯可能對潰瘍性結(jié)腸炎模型小鼠腸道黏膜屏障功能具有良好的保護作用。

半夏瀉心湯是如何發(fā)揮對潰瘍性結(jié)腸炎模型小鼠腸道黏膜屏障功能的保護作用，為探討可能機制，本次實驗對ZO-1和Occludin蛋白進行了檢測。緊密型連接(TJs)為細胞間緊密連接3種連接中的1種，為細胞與細胞之間最重要的連接方式，構(gòu)成上皮屏障功能的重要結(jié)構(gòu)，對腸道黏膜通透性起決定性作用[17]。緊密連接蛋白在腸道黏膜屏障功能的維持中起決定性作用，是維持腸道黏膜屏障結(jié)構(gòu)完整性的重要組成部分[18]。周膜蛋白緊密連接蛋白(ZO)家族，Occludin和Claudin跨膜蛋白家族是構(gòu)成TJs的3種主要超家族蛋白[19]。

Occludin蛋白對TJs功能的維持起到重要的作用，是第一個被發(fā)現(xiàn)的定位于TJs的跨膜蛋白，包括1個短的細胞內(nèi)環(huán)和2個長的細胞外環(huán)，其細胞內(nèi)環(huán)部分與ZO家族相連，而細胞外環(huán)部分與相鄰細胞的跨膜連接蛋白相互作用，封閉細胞間隙[17]。ZO有3種異構(gòu)體，即ZO-1，ZO-2和ZO-3，其中ZO-1與其同源體ZO-2、ZO-3一起為緊密連接蛋白搭建具有連接作用的腳手架樣平臺，在TJs中起核心連接作用[20]。本次實驗研究表明，給予半夏瀉心湯治療的潰瘍性結(jié)腸炎模型小鼠ZO-1和Occludin表達水平顯著升高，提示半夏瀉心湯可能通過升高ZO-1和Occludin表達，從而保護潰瘍性結(jié)腸炎小鼠腸道黏膜屏障功能。

綜上所述，半夏瀉心湯可能通過升高ZO-1和Occludin表達，從而保護潰瘍性結(jié)腸炎小鼠腸道黏膜屏障功能。本研究的局限之處在于并未探討拆方的作用。至于其拆方對潰瘍性結(jié)腸炎小鼠的保護作用及可能機制，本研究將作進一步的探討。