邊 江，王 婷,史偉云，阮慶國

0引言

自1905年奧地利眼科醫(yī)師Eduard Konrad Zirm成功施行首例人類同種異體穿透性角膜移植(penetrating keratoplasty，PKP)以來[1]，角膜移植技術(shù)飛速發(fā)展，已成為治療終末角膜疾病的理想方式。龐大的角膜病患者群體和較高的移植成功率使角膜移植在器官及組織移植領(lǐng)域占據(jù)著獨特并重要的地位。相比其它組織器官，雖然角膜移植術(shù)成功幾率相對較高，但術(shù)后排斥反應(yīng)仍然是手術(shù)失敗的主要原因。受體角膜植床的微環(huán)境，如炎癥刺激、血管化，以及多次角膜移植史等，都成為導(dǎo)致角膜移植排斥的危險因素，術(shù)后排斥幾率達(dá)到50%[1-2]。隨著角膜移植手術(shù)方式的不斷創(chuàng)新、改進，板層角膜移植術(shù)(lamellar keratoplasty，LKP)、角膜內(nèi)皮移植術(shù)(endothelial keratoplasty，EK)等替代了一部分全層角膜移植[3-4]；國內(nèi)外新型免疫抑制劑等抗排斥藥物的研發(fā)及使用，在一定程度上提高了高危角膜移植的成功幾率[5-7]。然而，目前對角膜移植術(shù)后免疫排斥反應(yīng)的發(fā)生機制仍然沒有明確的解釋，即使積極使用抗排斥藥物干預(yù)，臨床上仍可見大量移植后排斥病例。

角膜以它獨特的無血管、無淋巴管的解剖結(jié)構(gòu)，以及前房生理特點，成為人體少有的免疫赦免組織[1, 8]。但當(dāng)受炎癥刺激或新生血管化等因素的影響后，免疫赦免遭到破壞，繼而針對異體抗原發(fā)生宿主免疫應(yīng)答。當(dāng)發(fā)生免疫排斥反應(yīng)后，機體進行一系列免疫調(diào)節(jié)，免疫細(xì)胞與免疫分子相互作用，使免疫應(yīng)答以最恰當(dāng)?shù)男问骄S持在合適的水平，維持機體內(nèi)環(huán)境平衡穩(wěn)定，誘導(dǎo)免疫耐受。體內(nèi)外實驗表明，調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(regulatory T cells，Treg)在免疫調(diào)節(jié)中起著關(guān)鍵性作用[9-12]，是自身免疫性疾病、腫瘤、器官移植排斥反應(yīng)相關(guān)領(lǐng)域研究的熱點。本篇綜述主要介紹調(diào)節(jié)性T細(xì)胞參與眼部免疫耐受的相關(guān)內(nèi)容，著重闡述調(diào)節(jié)性T細(xì)胞在角膜移植排斥過程中的作用、機制和應(yīng)用。

1 Treg細(xì)胞誘導(dǎo)眼部免疫耐受

眼睛是人體重要的感受器官，當(dāng)接受外界抗原或移植物后可以長期存活，被稱為免疫赦免器官。早期研究認(rèn)為，眼部的淋巴系統(tǒng)主要存在于淚腺和結(jié)膜組織中，這種無血管、無淋巴管的特殊解剖結(jié)構(gòu)是前房具有免疫赦免特性的主要機制[8]。但隨著研究的不斷進展，逐漸發(fā)現(xiàn)除了特殊的解剖結(jié)構(gòu)外，免疫調(diào)節(jié)機制在維持眼免疫赦免狀態(tài)中也發(fā)揮了重要的作用。免疫調(diào)節(jié)的核心是抑制效應(yīng)T細(xì)胞產(chǎn)生炎性因子及1型輔助性T(Th1)細(xì)胞引起的遲發(fā)型免疫反應(yīng)(delayed-type hypersensitivity，DTH)。調(diào)節(jié)性T細(xì)胞是維持免疫耐受狀態(tài)的關(guān)鍵因素，其主要機制是通過細(xì)胞表面分子與其他淋巴細(xì)胞相應(yīng)配體結(jié)合，以細(xì)胞-細(xì)胞接觸依賴的方式，發(fā)揮抑制效應(yīng)細(xì)胞增殖和分化的作用；或者通過分泌免疫抑制性細(xì)胞因子，如TGF-β、IL-10來間接發(fā)揮抑制作用[13-15]。

1.1眼部Treg的來源

1.1.1炎癥情況下從引流淋巴結(jié)遷移而來當(dāng)眼部組織發(fā)生感染、過敏、自身免疫病等炎癥反應(yīng)時，抗原刺激免疫細(xì)胞在外周免疫系統(tǒng)中分化增殖，經(jīng)引流淋巴結(jié)遷移至炎癥部位，其中大量效應(yīng)T細(xì)胞浸潤及炎癥因子高表達(dá)促使病情發(fā)展；同時Treg細(xì)胞也遷移至病灶部位，發(fā)揮抗炎作用，抑制病程進展[16-18]。

1.1.2通過前房相關(guān)免疫偏倚產(chǎn)生目前普遍認(rèn)為前房相關(guān)免疫偏倚(anterior chamber associated immune deviation, ACAID)是維持眼部免疫耐受的主要機制，不斷有研究證實，ACAID與角膜移植、自身免疫性葡萄膜炎以及眼內(nèi)腫瘤的發(fā)病機制都密切相關(guān)[8, 19-20]。當(dāng)抗原進入前房，誘導(dǎo)出一種特殊的全身性免疫現(xiàn)象——F4/80+抗原提呈細(xì)胞(antigen presenting cells，APCs)捕獲眼部來源的抗原并運送至脾臟，使CD4+和CD8+α/β調(diào)節(jié)性T細(xì)胞抑制輔助性T細(xì)胞(Th1和Th2)的表達(dá)，發(fā)揮抑制免疫應(yīng)答的作用[19]。在誘導(dǎo)ACAID發(fā)生過程中胸腺、脾臟、交感神經(jīng)系統(tǒng)各司其職，發(fā)揮著重要的作用。研究發(fā)現(xiàn)，脾臟切除或胸腺切除可抑制成年鼠眼前房抗原誘導(dǎo)ACAID發(fā)生，導(dǎo)致嚴(yán)重的排斥反應(yīng)[20]。利用6-羥基多巴胺(6-OHDA)化學(xué)性去交感神經(jīng)法可以抑制小鼠胸腺NK T細(xì)胞和脾臟CD8+Treg細(xì)胞的產(chǎn)生，進而阻礙ACAID[21]。

1.1.3炎癥情況下在眼睛內(nèi)部誘導(dǎo)產(chǎn)生除了通過ACAID途徑誘導(dǎo)Treg生成，眼房水構(gòu)成的眼內(nèi)微環(huán)境在Treg的分化及免疫調(diào)節(jié)反應(yīng)中也發(fā)揮著重要的作用。房水主要由虹膜和睫狀體色素上皮細(xì)胞分泌，房水中的TGF-β和維甲酸(RA)是Treg細(xì)胞生成的關(guān)鍵因子，此外，多種神經(jīng)肽成分：α-促黑素(α-MSH)、血管活性長肽(VIP)、降鈣素基因相關(guān)肽(CGRP)和生長抑素(SOM)等都影響Treg分化及功能[22-24]。有研究通過收集小鼠眼房水，體外培養(yǎng)Na?ve CD4+T 細(xì)胞，可誘導(dǎo)生成CD4+Foxp3+Treg細(xì)胞，推測眼房水多種細(xì)胞因子構(gòu)成的微環(huán)境影響Treg生成。此外，該研究發(fā)現(xiàn)Treg細(xì)胞可在眼內(nèi)直接誘導(dǎo)生成，小鼠EAU模型的眼組織內(nèi)Treg細(xì)胞比例增高，明顯高于外周血和引流淋巴結(jié)中Treg百分率。推測炎癥反應(yīng)破壞眼部血-眼屏障，大量CD4+T細(xì)胞進入眼內(nèi)，進而誘導(dǎo)生產(chǎn)Treg細(xì)胞，有利于控制炎癥；當(dāng)Treg細(xì)胞的抑制能力超過Th1、Th17的致炎作用時，可誘發(fā)免疫耐受作用，保護眼組織[25]。

1.2調(diào)控眼部Treg產(chǎn)生的相關(guān)因子叉頭蛋白Foxp3(forkhead box protein 3)是調(diào)控Treg細(xì)胞發(fā)育和功能的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子，大量研究顯示Foxp3+Treg細(xì)胞在不同物種的免疫耐受方面起著重要的調(diào)控作用[26]。目前已發(fā)現(xiàn)IL-2R/STAT、TGF-β/SMAD、Notch1等多條信號通路參與Foxp3轉(zhuǎn)錄[27-29]，但關(guān)于調(diào)控眼部Foxp3表達(dá)的分子機制的報道較少。c-Rel作為NF-κB家族成員之一，可在Treg細(xì)胞發(fā)育的早期階段促使Foxp3表達(dá)，從而特異性上調(diào)CD4+CD25+胸腺Treg細(xì)胞的發(fā)育[30-31]。已有研究發(fā)現(xiàn)，在缺失c-Rel的OTⅡ轉(zhuǎn)基因小鼠眼前房中注射卵清蛋白OVA誘導(dǎo)炎癥反應(yīng)，發(fā)現(xiàn)CD4+CD25+Foxp3+細(xì)胞比例和絕對值均明顯降低，而且Foxp3的mRNA水平明顯下調(diào)，因此推測c-Rel在眼內(nèi)Treg細(xì)胞的產(chǎn)生過程中發(fā)揮了重要的作用[32]。

2 Treg細(xì)胞功能異常與角膜移植排斥之間的關(guān)系

正位穿透性角膜移植術(shù)是指供體植片位于角膜中央或旁中央的移植手術(shù)，不破壞角鞏膜緣正常解剖結(jié)構(gòu)，術(shù)后轉(zhuǎn)歸與前房水中抗炎、免疫抑制相關(guān)細(xì)胞因子有直接關(guān)系。經(jīng)典的角膜移植排斥理論認(rèn)為：當(dāng)眼部接受了同種異體角膜移植后，異體抗原被角膜緣處的APCs識別、俘獲，提呈給次級淋巴器官的T 細(xì)胞并使其活化，活化的T 細(xì)胞經(jīng)體循環(huán)和角膜新生血管/淋巴管轉(zhuǎn)送至角膜，對異體角膜發(fā)動免疫攻擊，引起免疫排斥反應(yīng)[33]。這種精密調(diào)控的免疫反應(yīng)高度依賴于免疫細(xì)胞向淋巴組織或炎癥部位的定向遷移和歸巢，并受黏附分子、趨化因子的復(fù)雜調(diào)控[34-35]。

研究表明，Treg細(xì)胞可參與眼局部免疫微環(huán)境的穩(wěn)定調(diào)節(jié)，在角膜移植免疫排斥反應(yīng)中發(fā)揮著重要作用。Chauhan等[36]在小鼠行同種異體角膜移植術(shù)后，檢測術(shù)后耐受與發(fā)生排斥小鼠的植片和局部引流淋巴結(jié)內(nèi)Treg細(xì)胞的數(shù)量及功能，證實Foxp3+Treg細(xì)胞在眼局部參與了角膜移植術(shù)后免疫耐受的形成。實驗發(fā)現(xiàn)，耐受組和排斥組的引流淋巴結(jié)(下頜淋巴結(jié)、頸部淋巴結(jié))和供體角膜中Treg的比例無明顯變化，耐受組小鼠引流淋巴結(jié)Treg細(xì)胞中Foxp3蛋白和mRNA水平均高于排斥組，推測眼部引流淋巴結(jié)Treg細(xì)胞中Foxp3的表達(dá)情況與免疫耐受程度相關(guān)，高表達(dá)Foxp3的Treg細(xì)胞具有更強的免疫抑制功能。一般認(rèn)為，Treg細(xì)胞主要在引流淋巴結(jié)和炎癥組織發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用[37-38]，但也有研究報道，在角膜排斥模型中，Treg細(xì)胞是在引流淋巴結(jié)中抑制T細(xì)胞的致敏效應(yīng)，而對炎癥反應(yīng)部位——移植角膜組織中的效應(yīng)T細(xì)胞并沒有理想的抑制作用；相對于排斥組，移植成功組淋巴結(jié)的Treg細(xì)胞有較強的抑制T細(xì)胞活化的作用[36]。

角膜移植過程中外來抗原不可避免地進入前房，從而誘導(dǎo)發(fā)生ACAID，由ACAID產(chǎn)生的Treg細(xì)胞是否抑制排斥反應(yīng)，目前尚無明確的定論。雖然角膜移植后誘導(dǎo)產(chǎn)生的Treg表型是CD4+CD25+Foxp3+，但ACAID發(fā)揮作用的是CD8+Treg細(xì)胞[1,36]。有研究報道，在豚鼠-兔之間異種角膜移植過程中，通過T細(xì)胞免疫受體動物，產(chǎn)生的CD8+Treg細(xì)胞可抑制角膜排斥反應(yīng)[39]。相反地，另有研究報道，阻斷CD8+T細(xì)胞產(chǎn)生可抑制ACAID發(fā)生，但不影響角膜供體的存活時間[40]。

除了ACAID途徑，有報道稱Treg細(xì)胞相關(guān)性角膜移植耐受是通過“糖皮質(zhì)激素誘導(dǎo)型腫瘤壞死因子家族相關(guān)性配體(GITRL)”依賴性程序調(diào)控完成，GITRL主要在角膜內(nèi)皮、虹膜睫狀體細(xì)胞中表達(dá)，行角膜移植術(shù)后3wk，成功的供體角膜可見Foxp3+GITR+CD25+CD4+T細(xì)胞浸潤。使用GITRL阻斷性抗體可使CD4+Foxp3+細(xì)胞明顯減少，導(dǎo)致所有同種異體角膜移植模型發(fā)生排斥，但不阻止ACAID發(fā)生，推測GITR/GITRL介導(dǎo)的角膜移植保護機制并非通過ACAID實現(xiàn)[41]。另外有研究報道指出，角膜供體移植后產(chǎn)生CD4+CD25+Foxp3+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞，可以直接抑制供體特異性遲發(fā)型超敏反應(yīng)[40-41]。

3 Treg細(xì)胞與角膜移植排斥治療

由于藥物治療排斥反應(yīng)的作用非常有限，免疫細(xì)胞治療已成為目前研究的新領(lǐng)域，通過不同的給藥途徑，如過繼轉(zhuǎn)移技術(shù)，靶向Treg細(xì)胞來治療角膜移植排斥反應(yīng)，不斷增加的實驗性研究為提高移植物存活率帶來新希望。

3.1增加體內(nèi)Treg細(xì)胞的總數(shù)量

3.1.1直接注射Treg細(xì)胞增加體內(nèi)正常Treg細(xì)胞數(shù)量，發(fā)揮免疫耐受功能是治療角膜移植排斥的主要觀點。有研究通過分離正常小鼠來源的Treg細(xì)胞或經(jīng)體外擴增Treg細(xì)胞，經(jīng)尾靜脈注射途徑可增加角膜移植成功率[42]。相反地，Antonia等[43]研究報道，分離大鼠脾臟中Treg(CD4+CD25+)，通過尾靜脈注射、球結(jié)膜下注射兩種方式治療不同年齡(3周齡和10周齡)的角膜移植大鼠，球結(jié)膜下注射可降低3周齡組66.7%的排斥率，10周齡組可降低33.3%，推測可能與效應(yīng)T細(xì)胞 (Teffs) 數(shù)量不同有關(guān)，成年大鼠體內(nèi)Teffs較多，相同數(shù)量Treg干預(yù)后影響就會較小；但尾靜脈注射的方法未能明顯抑制排斥反應(yīng)，推測可能是由于細(xì)胞在血液中受白蛋白或其他抗體破壞，無法有效到達(dá)眼部發(fā)揮作用。此外，輸注的細(xì)胞數(shù)量(1×105/只)較其他報道(1×106/只)的少也可能是影響實驗結(jié)果的主要原因之一。

3.1.2刺激體內(nèi)Treg細(xì)胞的分化和擴增

3.1.2.1全反式維甲酸和TGF-βWang等[44]研究發(fā)現(xiàn)小鼠行角膜移植術(shù)后聯(lián)合使用全反式維甲酸和TGF-β，可出現(xiàn)外周血、脾臟和引流淋巴結(jié)中Treg數(shù)量增加，F(xiàn)oxp3表達(dá)比例增高等現(xiàn)象，術(shù)后移植排斥率明顯降低，推測維甲酸和TGF-β可通過擾亂Treg/Th17平衡、增加Treg分化、誘導(dǎo)免疫耐受來發(fā)揮抗排斥作用。

3.1.2.2白介素-2細(xì)胞因子之間通過相互影響調(diào)節(jié)細(xì)胞生長、分化，調(diào)控免疫應(yīng)答，白介素-2受體α鏈(IL-2Rα/CD25)被認(rèn)為是調(diào)節(jié)CD4+T細(xì)胞活化、分化的關(guān)鍵性分子，雖然所有活化的T細(xì)胞均表達(dá)IL-2Rα，但只有Treg細(xì)胞持續(xù)高表達(dá)，因此可以低劑量使用IL-2來選擇性活化Treg細(xì)胞而不影響其他效應(yīng)T細(xì)胞，從而達(dá)到治療的目的[45]：通過腹腔內(nèi)低劑量注射IL-2體內(nèi)擴增Treg細(xì)胞，可增加小鼠角膜移植成功率[46]。

3.1.2.3雷帕霉素雷帕霉素(rapamycin)屬于大環(huán)內(nèi)酯類抗生素，起初被研究作為低毒性的抗真菌藥物，而后期有研究發(fā)現(xiàn)，行高危角膜移植術(shù)的患者使用雷帕霉素后可提高供體成活率[6]。Wang等[47]學(xué)者在小鼠行異體角膜移植術(shù)前2wk腹腔注射雷帕霉素，研究發(fā)現(xiàn)，術(shù)前和術(shù)后小鼠外周血、引流淋巴結(jié)中CD4+CD25+Foxp3+Treg細(xì)胞比例明顯增加，并且有大量CD4+CD25+T細(xì)胞浸潤角膜供體、結(jié)膜組織，供體中Foxp3 mRNA水平表達(dá)增加，推測雷帕霉素可增加Treg細(xì)胞的產(chǎn)生從而發(fā)揮免疫抑制作用。以上結(jié)論與Shin等[48]關(guān)于骨髓移植的研究一致：雷帕霉素與白介素2(IL-2)聯(lián)合運用可誘導(dǎo)CD25-T細(xì)胞向Treg分化，從而抑制移植物抗宿主病。因此，為了維持穩(wěn)定的免疫抑制狀態(tài)，雷帕霉素-殼聚糖/聚乳酸納米顆粒已被用于延長角膜供體成活的相關(guān)研究[49]。

3.1.2.4FTY720FTY720(fingolimod)是近幾年研發(fā)的一種新型免疫抑制劑，通過結(jié)合1-磷酸鞘氨醇(sphingosine-1-phosphate)受體影響相關(guān)信號通路，抑制T細(xì)胞從胸腺和二級淋巴組織中遷出[50]。Miller等[51]發(fā)現(xiàn)FTY720不會抑制抗原特異性CD4+T細(xì)胞的應(yīng)答反應(yīng)，而是通過增加Treg細(xì)胞在淋巴結(jié)中的數(shù)量；增強Treg細(xì)胞功能來發(fā)揮免疫抑制作用。局部使用0.5% FTY720可提高小鼠角膜移植成功率，同時可在頸部引流淋巴結(jié)中檢測到更高比例的的CD4+Treg細(xì)胞[52]。

3.2增加眼局部的Treg細(xì)胞數(shù)量除了增加全身Treg細(xì)胞數(shù)量，也可通過誘導(dǎo)Treg細(xì)胞遷移至病灶來降低排斥。來源于同種異體角膜移植受體引流淋巴結(jié)的Treg細(xì)胞高表達(dá)CCR7、CD62L，這些歸巢受體控制Treg細(xì)胞從胸腺遷移至淋巴結(jié)皮質(zhì)，移植成功組比排斥組Treg細(xì)胞高表達(dá)CCR7，間接體內(nèi)實驗通過CCL21刺激原始Treg細(xì)胞表達(dá)CCR7，可促進Treg細(xì)胞歸巢引流淋巴結(jié)，并提高角膜移植成功率[53-54]

4小結(jié)

Treg細(xì)胞在維持免疫穩(wěn)態(tài)、預(yù)防自身免疫和慢性炎癥方面發(fā)揮著重要的作用，通過調(diào)控Treg細(xì)胞來誘導(dǎo)免疫耐受的免疫治療具有良好的運用前景，特別在器官移植和自身免疫性疾病等領(lǐng)域。盡管人類對Treg細(xì)胞的分化和功能的認(rèn)識不斷更新，但仍有大量的問題尚未解決，譬如細(xì)胞表面標(biāo)記多樣化，對Treg細(xì)胞的分型、功能沒有統(tǒng)一且全面的認(rèn)識；機體中Treg細(xì)胞數(shù)量少、難獲得；免疫治療過程中Treg細(xì)胞的穩(wěn)定性、效能、純度等問題。相信隨著對Treg細(xì)胞的免疫抑制機制、表型可塑性和功能適應(yīng)性等研究的不斷深入,將會大大促進利用Treg細(xì)胞來降低角膜移植排斥的應(yīng)用。