王彤淼，秦 波

作者單位：1(518061)中國廣東省深圳市，深圳大學(xué)；2(518040)中國廣東省深圳市，暨南大學(xué)附屬深圳眼科醫(yī)院 深圳大學(xué)眼視光學(xué)院 深圳眼科學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 深圳眼外傷治療與干細(xì)胞定向分化公共服務(wù)平臺

0引言

年齡相關(guān)性黃斑變性(ARMD)是一種異質(zhì)性疾病，主要表現(xiàn)為黃斑區(qū)的色素性改變和視網(wǎng)膜下沉積物，即玻璃膜疣。隨病程的進(jìn)展，ARMD可發(fā)展為“干性”(萎縮型)，表現(xiàn)為視網(wǎng)膜色素上皮(RPE)、脈絡(luò)膜毛細(xì)血管和光感受器的地圖樣萎縮，或發(fā)展為進(jìn)展更迅速的“濕性”(滲出型)，表現(xiàn)為新生血管從脈絡(luò)膜侵入并穿透Bruch膜，導(dǎo)致血管滲漏、出血和瘢痕形成[1]。干性ARMD更為常見，而濕性ARMD脈絡(luò)膜新血管形成(CNV)是患者嚴(yán)重視力喪失的主要原因。

準(zhǔn)確的疾病動物模型可極大地幫助研發(fā)新療法。目前已成功建立了多種ARMD動物模型，并已揭示該疾病潛在的多種重要病理學(xué)機(jī)制。盡管許多模型模擬出了ARMD的一些重要病理特征，但尚無一種模型能復(fù)制其所有表型。嚙齒類動物模型的優(yōu)勢在于成本低、實(shí)驗(yàn)周期短、遺傳操作相對容易。本文旨在提供關(guān)于ARMD嚙齒類動物模型的全面和最新報道。

1干性黃斑變性的嚙齒動物模型

1.1補(bǔ)體因子途徑補(bǔ)體因子H(CFH)基因的多態(tài)性與ARMD風(fēng)險增加有關(guān)[2]。CFH是Bruch膜(BM)中補(bǔ)體旁路途徑中重要的抑制劑，其不同氧化還原形式在預(yù)防ARMD中具有雙重作用[3]。其他補(bǔ)體因子(如因子B、C2、C3)的多態(tài)性也與ARMD發(fā)生發(fā)展過程中的保護(hù)性或易感性有關(guān)[4]。

1.1.1Cfh-/-小鼠CFH在旁路途徑中起重要的調(diào)節(jié)作用，其功能缺失將導(dǎo)致旁路途徑失調(diào)，從而使全身C3水平降低、腎小球基底膜中C3沉積，最終導(dǎo)致膜增生性腎小球腎炎(MPGN)Ⅱ型。同時，這些患者的眼底表現(xiàn)出類似ARMD的黃斑玻璃膜疣[5]。經(jīng)基因工程改造的缺乏CFH的小鼠也會出現(xiàn)MPGN及類似于ARMD的視網(wǎng)膜異常[6]。這些動物兩歲時出現(xiàn)視力下降、與視桿細(xì)胞有關(guān)的ERG a-和b-波反應(yīng)降低、視網(wǎng)膜下自發(fā)熒光增加、視網(wǎng)膜內(nèi)補(bǔ)體沉積和光感受器外節(jié)解體。

1.1.2轉(zhuǎn)基因CFHY402H小鼠為進(jìn)一步闡明CFH突變導(dǎo)致ARMD的機(jī)制，構(gòu)建了人ApoE啟動子調(diào)控下表達(dá)Y402H多態(tài)性的轉(zhuǎn)基因小鼠品系[7]。ApoE基因編碼用于脂質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)的載脂蛋白E。該動物模型1歲時眼底較野生型或Cfh-/-小鼠相比，出現(xiàn)的玻璃膜疣樣沉積物更多。免疫組織化學(xué)顯示視網(wǎng)膜下小膠質(zhì)細(xì)胞和巨噬細(xì)胞數(shù)量增加，電子顯微鏡顯示Bruch膜增厚、基底膜C3d沉積。與Cfh-/-小鼠相比，轉(zhuǎn)基因CFH Y402H小鼠未出現(xiàn)光感受器萎縮，可能由于CFH蛋白存在部分功能活性，阻止旁路途徑進(jìn)一步失調(diào)。

1.1.3過表達(dá)C3轉(zhuǎn)基因小鼠補(bǔ)體因子C3通過整合來自3個不同激活途徑的信號在補(bǔ)體激活中起關(guān)鍵作用。用表達(dá)C3的腺病毒轉(zhuǎn)染的小鼠在CMV啟動子的調(diào)節(jié)下高表達(dá)C3[8]。病毒注射區(qū)域附近可觀察到ARMD的幾種特征，包括RPE的破壞、補(bǔ)體的沉積和光感受器外節(jié)的萎縮。該模型可用于評估補(bǔ)體在視網(wǎng)膜病理學(xué)中的作用以及研發(fā)與補(bǔ)體激活相關(guān)的視網(wǎng)膜疾病的抗補(bǔ)體療法。然而，與注射GFP載體的動物相比，C3過表達(dá)動物視網(wǎng)膜脫離的發(fā)生率增加，這可能與腺病毒本身對病理特征的影響有關(guān)。

1.1.4C3a和C5a受體-/-小鼠已在玻璃膜疣中發(fā)現(xiàn)補(bǔ)體成分C3和C5。它們除了具有調(diào)理和形成膜攻擊復(fù)合物的作用外，還可通過激活內(nèi)源性受體引發(fā)其他生物效應(yīng)。缺乏C3a或C5a受體的小鼠在激光誘導(dǎo)形成的CNV模型(下文描述)中具有損傷更小、VEGF表達(dá)水平降低、白細(xì)胞募集受損的特點(diǎn)[9]。

1.1.55XFAD小鼠5XFAD小鼠是一種阿爾茨海默病(AD)的動物模型，具有5個家族性AD突變。老年5XFAD小鼠出現(xiàn)血-視網(wǎng)膜屏障破壞與Aβ積累，表現(xiàn)出與干性ARMD一致的超微結(jié)構(gòu)變化，包括RPE頂端微絨毛喪失、Bruch膜增厚、基底層狀和線性沉積物、脂褐素顆粒的積累[10]。另外，Aβ是玻璃膜疣的組成成分，是補(bǔ)體系統(tǒng)的已知激活劑[11]。5XFAD小鼠可用于研究Aβ相關(guān)病理學(xué)并開發(fā)新的治療方法。

1.2趨化因子趨化因子是一組介導(dǎo)白細(xì)胞遷移的小分子量蛋白，既可促進(jìn)炎癥進(jìn)展，又可維持內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)，根據(jù)其半胱氨酸殘基分為4個家族：CXC、CX3C、CC和C[12]。已用這些配體/受體的基因敲除小鼠創(chuàng)建了具有ARMD特征的多種動物模型。趨化因子受體是G蛋白耦連受體，可介導(dǎo)不同第二信使的信號傳導(dǎo)使炎癥細(xì)胞靶向募集。特別是CCL2/CCR2和CX3CL1/CX3CR1配體/受體對，分別通過影響巨噬細(xì)胞和小膠質(zhì)細(xì)胞的趨化聚集作用參與ARMD的發(fā)生。

1.2.1Ccl2-/-和Ccr2-/-小鼠Ccl2也稱單核細(xì)胞趨化蛋白1(MCP-1)，介導(dǎo)單核細(xì)胞與血管的結(jié)合使組織外滲[13]。氧化應(yīng)激可上調(diào)RPE細(xì)胞Ccl2的表達(dá)。已發(fā)現(xiàn)缺乏CC-配體(Ccl2-/-)或受體(Ccr2-/-)的小鼠具有ARMD的特征。這些動物在9mo后出視網(wǎng)膜下玻璃膜疣樣聚集、Bruch膜增厚、自發(fā)熒光和脂褐素顆粒增加、光感受器功能障礙和CNV[14]。這說明吞噬清除的功能失調(diào)可能在ARMD中發(fā)揮關(guān)鍵作用。該模型對激光誘導(dǎo)形成CNV不敏感。

1.2.2Cx3cr1-/-小鼠配體CX3CL1在視網(wǎng)膜內(nèi)皮細(xì)胞、Muller和神經(jīng)節(jié)細(xì)胞中高表達(dá)，其受體Cx3cr1僅在視網(wǎng)膜小膠質(zhì)細(xì)胞表達(dá)。兩個獨(dú)立的Cx3cr1缺陷小鼠的研究實(shí)驗(yàn)[15-16]都發(fā)現(xiàn)了與ARMD一致的改變。Cx3cr1-/-小鼠12mo時出現(xiàn)玻璃膜疣樣沉積物，這些沉積物由視網(wǎng)膜下充滿脂質(zhì)的小膠質(zhì)細(xì)胞積聚而成。與野生型相比，Cx3cr1-/-小鼠18mo時視網(wǎng)膜顯著變薄(40%)。視網(wǎng)膜小膠質(zhì)細(xì)胞CX3CL1功能的缺乏使其從視網(wǎng)膜中流出障礙，從而導(dǎo)致視網(wǎng)膜下沉積物的形成。

1.2.3Ccl2-/-Cx3cr1-/-雙基因敲除小鼠單基因敲除小鼠直到老齡(分別為16mo和18mo)才表現(xiàn)出ARMD的一些特征，且表型不完全。為明確Ccl2和Cx3cr1丟失是否具有協(xié)同效應(yīng)，建立了Ccl2-/-Cx3cr1-/-雙基因敲除小鼠模型[17]。與單基因敲出模型相比，聯(lián)合Ccl2-/-Cx3cr1-/-小鼠早在6wk即出現(xiàn)視網(wǎng)膜變化，并隨著年齡增長逐漸增大，為研究提供了更便利的模型。免疫染色顯示Bruch膜、RPE和脈絡(luò)膜毛細(xì)血管的補(bǔ)體水平增加[18]。此外，雙基因敲除小鼠出現(xiàn)Bruch膜局部增厚、A2E水平增加、小膠質(zhì)細(xì)胞浸潤和光感受器萎縮。老齡動物中可觀察到萎縮區(qū)和脈絡(luò)膜視網(wǎng)膜瘢痕。約15%的模型眼中CNV最早出現(xiàn)在第12wk。

1.3氧化損傷模型許多證據(jù)表明，氧化損傷可能在ARMD的發(fā)展中起作用。視網(wǎng)膜由于高代謝需求、高濃度的可氧化多不飽和脂肪酸及光敏分子(如視紫紅質(zhì)或脂褐素)的存在而特別容易受到氧化損傷[19]。

1.3.1用羧乙基吡咯加合蛋白進(jìn)行免疫二十二碳六烯酸(DHA，視網(wǎng)膜中最常見的脂肪酸之一)的氧化可形成羧乙基吡咯(CEP)加合蛋白。這些修飾蛋白存在于玻璃膜疣中，ARMD眼組織中血漿CEP加合蛋白水平更高，且存在抗CEP抗體[20]。為驗(yàn)證氧化損傷產(chǎn)生的CEP與ARMD炎癥的因果關(guān)系，Hollyfield等用CEP加合的小鼠血清蛋白免疫小鼠模型，并將動物分為兩組：短期組接受3mo強(qiáng)免疫應(yīng)激，長期組接受1a弱免疫應(yīng)激[21]。結(jié)果兩組都出現(xiàn)了抗CEP抗體。短期組3mo時出現(xiàn)Bruch膜補(bǔ)體C3d的沉積、RPE下沉積物、RPE腫脹和裂解、巨噬細(xì)胞的侵襲和光感受器的固縮。長期組Bruch膜增厚3～5倍。病理改變的嚴(yán)重程度與CEP特異性抗體水平相關(guān)。兩組小鼠皆未觀察到新血管形成，證明該模型僅適用于干性ARMD，對濕性ARMD不適用。該模型的一個優(yōu)點(diǎn)是不需要基因操作或極端光照條件。

1.3.2血漿銅藍(lán)蛋白/亞鐵氧化酶雙基因敲除小鼠模型鐵是氧化應(yīng)激的有效產(chǎn)生者，其體內(nèi)水平隨衰老而增加。銅藍(lán)蛋白是一種鐵氧化酶，介導(dǎo)鐵的胞外運(yùn)輸?；加秀~藍(lán)蛋白血癥的人因缺乏功能性銅藍(lán)蛋白會出現(xiàn)玻璃膜疣和視網(wǎng)膜色素性改變[22]。缺乏血漿銅藍(lán)蛋白的小鼠僅表現(xiàn)出輕微的視網(wǎng)膜變化，可能由于第二種鐵氧化酶-亞鐵氧化酶彌補(bǔ)部分損失[23]。為分析鐵超負(fù)荷對ARMD病理過程的潛在影響，建立了缺乏血漿銅藍(lán)蛋白和亞鐵氧化酶的小鼠模型。這些動物在6～9mo后，局部中周視網(wǎng)膜出現(xiàn)了RPE肥大和色素減退、視網(wǎng)膜下沉積物、光感受器萎縮和視網(wǎng)膜下新生血管形成。第12mo時小鼠表現(xiàn)出巨噬細(xì)胞浸潤、局部區(qū)域高自發(fā)熒光和補(bǔ)體沉積[24]。該模型的局限性在于大多數(shù)雙基因敲除動物早期死于運(yùn)動相關(guān)疾病，這限制了對衰老小鼠長期效應(yīng)的研究。

1.3.3SOD1-/-小鼠超氧化物歧化酶(SOD)是一種強(qiáng)抗氧化劑，有三種表達(dá)形式，其中SOD1在視網(wǎng)膜含量最高，主要位于細(xì)胞質(zhì)。SOD1-/-小鼠7mo前的視網(wǎng)膜與野生型無差別。7mo后，其RPE和Bruch膜間出現(xiàn)黃色玻璃膜疣樣沉積物，用玻璃膜疣的生物標(biāo)志物染色后證明其包括：玻連蛋白、羧甲基賴氨酸和組織抑制劑金屬蛋白酶3(TIMP3)[25]。有證據(jù)表明，RPE的氧化損傷、Bruch的增厚以及光照暴露以劑量依賴方式加速玻璃膜疣的出現(xiàn)。大約10%的SOD1-/-小鼠通過眼底檢查或組織學(xué)證實(shí)CNV的存在[26]。SOD1-/-小鼠是研究活性氧物種介導(dǎo)的視網(wǎng)膜變性較好的模型系統(tǒng)。

1.3.4SOD2-/-和SOD2敲低小鼠SOD2基因的多態(tài)性與ARMD發(fā)病風(fēng)險增加有關(guān)。然而，SOD2-/-小鼠出生后很快死于擴(kuò)張型心肌病的缺點(diǎn)限制了它們作為ARMD模型的應(yīng)用。少數(shù)存活至3wk的動物視網(wǎng)膜組織表現(xiàn)為內(nèi)層視網(wǎng)膜變薄和線粒體功能障礙[27]。為研究SOD2對視網(wǎng)膜功能的影響，Justilien等創(chuàng)建了一種小鼠模型，其視網(wǎng)膜和RPE被腺病毒轉(zhuǎn)染可表達(dá)降解SOD2的核酶。這些小鼠出現(xiàn)氧化損傷標(biāo)志物的增加，組織學(xué)顯示Bruch膜增厚、RPE變性、自發(fā)熒光增加、A2E水平升高和光感受器萎縮。然而，該模型中未觀察到CNV的出現(xiàn)[28]。

1.3.5吸煙/氫醌香煙煙霧中含有許多促氧化劑，如一氧化氮、一氧化碳和氫醌。吸煙是ARMD最重要的可預(yù)防性風(fēng)險因素[29]。已經(jīng)在若干動物模型中研究了香煙煙霧誘導(dǎo)或加重ARMD的作用，以及藍(lán)光和高脂肪飲食的氧化附加風(fēng)險。Espinosa-Heidmann等發(fā)現(xiàn)暴露于整支香煙煙霧或食物中添加氫醌的小鼠表現(xiàn)出基底層狀沉積物、Bruch膜彌漫性增厚和脈絡(luò)膜毛細(xì)血管內(nèi)皮肥大，提示煙霧相關(guān)氧化劑可能是脈絡(luò)膜毛細(xì)血管和RPE的另一種氧化損傷刺激物，這可解釋吸煙與早期ARMD之間的關(guān)聯(lián)[30]。飲食中添加氫醌的野生型小鼠RPE和脈絡(luò)膜中Ccl2的表達(dá)降低，且促血管生成的VEGF與抗血管生成的PEDF比例增加[31]。該研究表明，氫醌可通過改變血管生長因子的平衡進(jìn)一步增加CNV的風(fēng)險。

1.4脂質(zhì)/葡萄糖代謝長期以來人們懷疑脂質(zhì)和葡萄糖代謝在ARMD的發(fā)展中起作用。隨著年齡的增長，脂質(zhì)和膽固醇會沉積于Bruch膜進(jìn)而干擾RPE和脈絡(luò)膜毛細(xì)血管間代謝物的運(yùn)輸，導(dǎo)致基底層狀和線樣沉積物的形成[32]。此外，載脂蛋白的基因多態(tài)性通過參與介導(dǎo)脂質(zhì)運(yùn)輸與ARMD的發(fā)病風(fēng)險有關(guān)[33]。下面將詳細(xì)描述用于探索脂質(zhì)代謝與ARMD之間關(guān)系的一些動物模型。

1.4.1高血糖指數(shù)飲食模型低血糖指數(shù)(GI)飲食與降低ARMD發(fā)生和發(fā)展有關(guān)。已發(fā)現(xiàn)晚期糖基化終產(chǎn)物(AGEs)是玻璃膜疣的組成組分。Uchiki等試圖確定GI升高飲食是否會導(dǎo)致動物模型中ARMD病變的發(fā)展[34]。與高GI飲食相比，低GI飲食的衰老動物基底層狀沉積物更少、更小，且保留更多RPE基底皺褶，且視網(wǎng)膜AGEs水平更低。高GI飲食可能由于增加了視網(wǎng)膜中毒性AGEs的沉積，加速了小鼠與年齡相關(guān)視網(wǎng)膜病變的出現(xiàn)，高GI喂養(yǎng)的C57BL/6小鼠可用于模擬ARMD的早期階段并用于藥品研發(fā)。

1.4.2ApoE-/-小鼠ApoE的小鼠表現(xiàn)出非常高的循環(huán)膽固醇水平。8mo時組織學(xué)檢查顯示Bruch膜增厚及電致發(fā)光顆粒和膜結(jié)合物的存在，該物質(zhì)與ARMD中的基底線性沉積物具有相似的超微結(jié)構(gòu)[35]。

1.4.3APOEe2/e4轉(zhuǎn)基因小鼠為了模擬和研究人類中觀察到的各種APOE等位基因，用人類APOE等位基因(即e2、e3、e4)替代小鼠APOE制造出轉(zhuǎn)基因動物。高脂肪飲食16mo以上的APOEe2和APOEe4小鼠出現(xiàn)Bruch膜增厚、RPE下沉積物及RPE萎縮。極端情況下，APOE4小鼠會出現(xiàn)明顯的脈絡(luò)膜新生血管形成。飼喂高脂肪膽固醇飲食的轉(zhuǎn)基因APOEe4小鼠出現(xiàn)人玻璃膜疣組分淀粉樣蛋白β(Aβ)的累積。在這些動物全身使用Aβ40和Aβ42抗體可起到視覺保護(hù)作用，這表明Aβ參與ARMD的發(fā)病過程[36]。與APOEe2相比，人類APOEe4基因在ARMD發(fā)病中起到相對保護(hù)性作用，而在小鼠中的作用似乎是相反的[36-37]。目前尚不清楚不同物種間存在這種差異的原因。

1.4.4APOB100轉(zhuǎn)基因小鼠+高脂肪飲食載脂蛋白B100(APOB100)是低密度脂蛋白(LDL)的主要載脂蛋白。Bruch膜中的脂蛋白顆粒含有APOB100。為研究APOB100在 ARMD脂蛋白沉積物中的作用，一些研究小組建立了表達(dá)人型APOB100的小鼠。飼喂高脂肪飲食并暴露于藍(lán)綠光的年輕APOB100小鼠出現(xiàn)了基底層狀沉積物。老齡APOB100小鼠飼喂正常飲食后出現(xiàn)Bruch膜增厚、RPE基底折疊消失及基底層狀沉積物[38]。額外飼喂高脂肪飲食時可加劇表型變化，出現(xiàn)基底線性沉積物。產(chǎn)生APOB100脂蛋白的小鼠僅出現(xiàn)Bruch膜的改變，不會出現(xiàn)玻璃膜疣[39]。

1.4.5Ldl受體-/-小鼠+高脂肪飲食Ldl受體-/-小鼠由于不能胞內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)膽固醇，導(dǎo)致血漿膽固醇水平升高及Bruch膜中膜半透明顆粒增加[40]。飼喂高脂肪飲食導(dǎo)致Bruch膜的進(jìn)一步增厚，且與RPE和外層視網(wǎng)膜中促血管生成因子VEGF的表達(dá)增加相關(guān)。

1.4.6Vldl受體-/-小鼠編碼極低密度脂蛋白(VLDL)受體的基因突變純合子小鼠不會出現(xiàn)血脂異常，但從2周齡開始出現(xiàn)視網(wǎng)膜新生血管。這些血管向視網(wǎng)膜下腔生長，1～2mo可形成脈絡(luò)膜血管吻合或引起視網(wǎng)膜出血。對該模型的進(jìn)一步研究證實(shí)了CNV的形成、VEGF水平的升高和Wnt途徑的失調(diào)[41]。這些發(fā)現(xiàn)表明VLDL受體對CNV起負(fù)調(diào)節(jié)作用。因此，VLDL受體的調(diào)節(jié)可作為ARMD治療的新途徑。

1.4.7CD36-/-小鼠CD36是氧化低密度脂蛋白(OxLDL)的清道夫受體，在RPE頂端和基底外側(cè)膜中表達(dá)。CD36缺乏的小鼠飼喂常規(guī)飲食也會出現(xiàn)視網(wǎng)膜下OxLDL累積。這些動物表現(xiàn)出Bruch膜增厚，與ApoE-/-Cd36-/-雙敲除小鼠雜交產(chǎn)生ApoE-/-時，這種癥狀會加重。還報道了CD36-/-小鼠出現(xiàn)年齡依賴性脈絡(luò)膜退化，其可能繼發(fā)于COX2(VEGF上游激活劑)的下調(diào)[42]。

1.4.8Mcd/mcd小鼠(轉(zhuǎn)基因突變體組織蛋白酶D) 組織蛋白酶D是一種天冬氨酸蛋白酶，在RPE中高度表達(dá)并在光感受器外節(jié)的降解中起重要作用，其以酶原的形式分泌，需進(jìn)一步翻譯加工后活化。非活性形式組織蛋白酶原D的積累與RPE功能障礙有關(guān)[43]。為了研究其積聚對光感受器的影響，建造了表達(dá)突變型組織蛋白酶(mcd)的轉(zhuǎn)基因小鼠。轉(zhuǎn)基因的純合小鼠(mcd/mcd)9mo時出現(xiàn)RPE萎縮區(qū)[44]。10～18mo出現(xiàn)RPE肥大區(qū)、光感受器萎縮和ERG減少。另外，這些動物眼底可觀察到黃色斑點(diǎn)，組織學(xué)上與基底層狀及線性沉積物相似，自發(fā)熒光成像表現(xiàn)出類似脂褐素沉積的高自發(fā)熒光區(qū)域。與mcd1/mcd1小鼠相比，mcd2/mcd2小鼠可表達(dá)更高水平的無活性組織蛋白酶原，且時間更早(3mo即出現(xiàn))[45]。

1.5 ARMD的其他嚙齒動物模型

1.5.1快速衰老小鼠快速衰老小鼠(SAM)模型最初由選擇性繁殖用于快速衰老的AKR/J小鼠衍變而來。隨后擴(kuò)增至9個衰老易感系(SAMP)和4個衰老抵抗系(SAMR)。表型特征因品系而異，但SAMP系動物的共同點(diǎn)為早期即出現(xiàn)老年淀粉樣變性、骨質(zhì)疏松癥、退行性關(guān)節(jié)病、白內(nèi)障、聽力障礙和腦萎縮，并伴有學(xué)習(xí)和記憶缺陷[46]。已顯示SAMP1小鼠表現(xiàn)出Bruch膜的增厚和RPE變化，包括基底層皺褶的腫脹和脂褐素顆粒的累積。10mo的SAMP8小鼠出現(xiàn)Bruch膜增厚、RPE下基底層狀沉積物、基底線狀沉積物和Bruch膜內(nèi)小區(qū)域的新生血管[46]。

1.5.2導(dǎo)致黃斑營養(yǎng)不良的單基因突變已構(gòu)建了一些由單個基因突變引起的遺傳性黃斑營養(yǎng)不良的動物模型，并將其用作ARMD的研究模型。其中包括Timp3-/-小鼠(Sorsby 眼底營養(yǎng)不良模型)、Abcr-/-小鼠(常染色體隱性Stargardt病模型)、ELOVL4轉(zhuǎn)基因小鼠(常染色體顯性Stargardt病模型)和fibulin-3轉(zhuǎn)基因小鼠(人EFEMP1突變模型)。

2濕性黃斑變性的嚙齒動物模型

2.1激光誘導(dǎo)CNV1989年Dobi等[47]首次使用647nm氪激光(100μm，50～160mW，0.1s)建立了大鼠模型。他們對誘導(dǎo)產(chǎn)生CNV所需功率的初步觀察結(jié)果至今仍有參考意義：不足以產(chǎn)生Bruch膜斷裂的灼燒(60mW)不會引起CNV；灼燒過強(qiáng)(130mW及以上)導(dǎo)致大量脈絡(luò)膜出血，最終的無血管瘢痕不會引起CNV；產(chǎn)生白色凝固斑伴中央氣泡形成的灼燒(研究中為120mW)，無論有無相關(guān)出血，都可誘導(dǎo)Bruch膜的破裂并產(chǎn)生CNV。1998年第一只小鼠模型由Tobe等[48]建立，同樣使用氪激光(50μm，350～400mW，0.05s)在視網(wǎng)膜后極部進(jìn)行3次灼燒，2wk時87%的小鼠灼燒區(qū)出現(xiàn)CNV。該作者指出，有氣泡形成的灼燒中CNV形成率較高(氣泡表示Bruch膜的破裂)。

激光誘導(dǎo)CNV的發(fā)展階段：早期膜形成、成熟纖維血管網(wǎng)的建立和退化[49]。小鼠和大鼠激光后CNV的形成過程相似，早期病變出現(xiàn)在第1wk，大多數(shù)研究中成熟CNV出現(xiàn)在第10～14d[48, 50]。嚙齒動物激光損傷模型是一種急性炎癥損傷模型，不是長期衰老變性和慢性炎癥的結(jié)果，其發(fā)病機(jī)制與人眼ARMD有所不同，且激光光凝對神經(jīng)視網(wǎng)膜造成的損害程度顯著大于人類ARMD的典型損傷，目前尚不知道此會在何種程度上改變實(shí)驗(yàn)性CNV的周圍環(huán)境。

2.2視網(wǎng)膜下注射誘導(dǎo)CNV在視網(wǎng)膜神經(jīng)上皮層和RPE之間注射促血管生成物質(zhì)，注射對RPE造成的干擾聯(lián)合血管生成因子的共同作用，可形成延伸至視網(wǎng)膜下腔的CNV[52]。

2.2.1視網(wǎng)膜下基質(zhì)膠注射液基質(zhì)膠(matrigel)是由Engelbreth-Holm-Swarm小鼠肉瘤細(xì)胞分泌的細(xì)胞外基質(zhì)蛋白混合物，包括FGF-2在內(nèi)的各種生長因子。該混合物在4℃時為液態(tài)，并在24℃～37℃(體內(nèi)注射)時固化，其固體形式可有效捕獲生長因子并使其緩慢釋放[52]。通過小鼠周邊眼底視網(wǎng)膜下注射基質(zhì)膠，在Ccl2缺陷小鼠和野生型小鼠中誘導(dǎo)形成CNV，并觀察到RPE和光感受器變性、RPE細(xì)胞遷移[53]。在RPE和視網(wǎng)膜神經(jīng)層間注入基質(zhì)膠后，RPE細(xì)胞穿過沉積物遷移以重建與光感受器的聯(lián)系，產(chǎn)生RPE下沉積物，隨后來自脈絡(luò)膜的新生血管穿透Bruch膜形成CNV[52]，這證明了在預(yù)防CNV方面RPE和Bruch膜之間的必要聯(lián)系。

2.2.2視網(wǎng)膜下VEGF基因治療VEGF在眼內(nèi)血管生成中的核心作用已得到證明。RPE是VEGF的主要分泌者，其功能障礙在CNV的發(fā)病機(jī)制中起關(guān)鍵作用。2000年Baffi[54]和Spilsbury等[55]通過視網(wǎng)膜下注射表達(dá)VEGF的腺病毒載體，建立了各自的CNV大鼠模型。兩組均在注射后4wk通過血管造影和組織學(xué)檢測到CNV的形成，且經(jīng)組織學(xué)檢測第80d仍可觀察到新生血管復(fù)合物。

轉(zhuǎn)基因小鼠闡明了視網(wǎng)膜下注射的重要性。在誘導(dǎo)RPE表達(dá)VEGF增加的rho/VEGF小鼠及VMD2/VEGF小鼠中，可觀察到來自視網(wǎng)膜深層毛細(xì)血管的新生血管延伸、破壞RPE[56]，但未觀察到CNV的形成。當(dāng)破壞RPE的完整性后再視網(wǎng)膜下注射裸腺病毒載體，可觀察到CNV的形成[57]。另外，Schmack等[58〗發(fā)現(xiàn)視網(wǎng)膜下注射RPE細(xì)胞可誘導(dǎo)CNV形成，他們把這歸于注射的RPE可產(chǎn)生VEGF及注射過程中對RPE造成的機(jī)械性損傷。值得注意的是，他們在視網(wǎng)膜下注射對照物質(zhì)的眼底發(fā)現(xiàn)了CNV，盡管其程度較輕。

2.2.3視網(wǎng)膜下注射巨噬細(xì)胞和脂質(zhì)過氧化物與聚乙二醇巨噬細(xì)胞是CNV形成中重要的細(xì)胞參與者，可分泌多種血管生成相關(guān)因子。Jo等[59]通過對C57BL/6或Ccl2基因敲除小鼠行視網(wǎng)膜下巨噬細(xì)胞注射研究CNV的纖維化特征，發(fā)現(xiàn)實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ椭蠧NV與纖維化共存。

Baba等[60]將視網(wǎng)膜下注射脂質(zhì)過氧化物(HpODE)用于大鼠模型，觀察到光感受器變性、載脂巨噬細(xì)胞、RPE細(xì)胞和CNV。他們試圖排除視網(wǎng)膜下注射時Bruch膜破裂的動物，并假定HpODE誘導(dǎo)RPE、內(nèi)皮細(xì)胞及炎癥細(xì)胞分泌蛋白酶損傷Bruch膜。他們的觀察結(jié)果強(qiáng)調(diào)了對Bruch膜干擾和持續(xù)刺激對新血管形成的必要性。

Lyzogubov等[61]視網(wǎng)膜下注射聚乙二醇(PEG)-8創(chuàng)建了CNV新模型。在該模型中，PEG-8注射誘導(dǎo)補(bǔ)體級聯(lián)反應(yīng)的激活和劑量依賴性CNV產(chǎn)生，并持續(xù)存在至最后研究時間點(diǎn)(第42d)。

3小結(jié)

目前，嚙齒動物模型已能夠重建ARMD的許多組織學(xué)特征，共同幫助發(fā)現(xiàn)如遺傳多態(tài)性氧化損傷、脂質(zhì)和碳水化合物代謝以及補(bǔ)體失調(diào)等不同病理機(jī)制的作用。嚙齒動物ARMD模型由于缺乏黃斑結(jié)構(gòu)而具有一定局限性，這可能解釋了為什么沒能從這些模型中觀察到ARMD從早期到晚期的演變過程。然而毫無疑問的是，隨著對ARMD遺傳和環(huán)境因素新見解的出現(xiàn)，及對潛在病理機(jī)制理解程度的增加，嚙齒動物模型將繼續(xù)在ARMD模型中保持前沿地位，并將能更準(zhǔn)確地重建疾病的組織和功能學(xué)改變，從而成為測試新療法的更優(yōu)化平臺。