李彤，徐家偉，孫瑩璞

細(xì)胞是生物體結(jié)構(gòu)和功能的基本單位，在生物體生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中，因細(xì)胞類型、外界環(huán)境以及內(nèi)部調(diào)節(jié)的不同，其轉(zhuǎn)錄組信息也呈多樣性。細(xì)胞命運(yùn)的決策是單細(xì)胞層面的過(guò)程而非組織層面。由于基因組和表觀遺傳的重編程，以及在細(xì)胞分裂和分化過(guò)程中出現(xiàn)的誤差造成來(lái)自同一細(xì)胞系或個(gè)體的細(xì)胞呈現(xiàn)出不同的基因組、轉(zhuǎn)錄組和表觀基因組，即細(xì)胞異質(zhì)性。例如胚胎發(fā)育早期的細(xì)胞，每個(gè)細(xì)胞的譜系和發(fā)育軌跡也不盡相同。傳統(tǒng)的測(cè)序方法將大量相同類型的細(xì)胞團(tuán)共同提取遺傳物質(zhì)進(jìn)行測(cè)序，忽略了單個(gè)細(xì)胞在遺傳方面的特殊性。單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測(cè)序（single-cell RNA-sequencing，scRNA-seq）技術(shù)對(duì)單個(gè)細(xì)胞進(jìn)行高通量分子檢測(cè)，探索單個(gè)細(xì)胞全基因表達(dá)譜，不僅在解決生物異質(zhì)性方面有著強(qiáng)大的功能，同時(shí)在低數(shù)量的生物材料問(wèn)題上有許多優(yōu)勢(shì)。

在以往基因?qū)用娴臏y(cè)序，需要輸入數(shù)百到數(shù)百萬(wàn)個(gè)細(xì)胞，得出細(xì)胞群的平均讀數(shù)。而單個(gè)細(xì)胞便決定生物發(fā)育過(guò)程。單細(xì)胞組學(xué)技術(shù)將高通量分子技術(shù)轉(zhuǎn)移到單細(xì)胞規(guī)模[1-3]，同時(shí)結(jié)合其他檢測(cè)結(jié)果，如染色質(zhì)可及性等[2,4]，更深入地了解細(xì)胞命運(yùn)調(diào)節(jié)的機(jī)制。自2011年單細(xì)胞測(cè)序技術(shù)被稱為最有期待價(jià)值的技術(shù)[5]，至今在各雜志刊物中大批量出現(xiàn)，單細(xì)胞測(cè)序無(wú)疑是當(dāng)今科學(xué)界的寵兒?，F(xiàn)總結(jié)scRNA-seq所涉及的主要過(guò)程、應(yīng)用優(yōu)勢(shì)以及在生殖發(fā)育領(lǐng)域的作用。

1 scRNA-seq基本方法

1.1 單細(xì)胞捕獲 分離單個(gè)細(xì)胞，常用技術(shù)有：有限稀釋法、顯微操作法、熒光激活細(xì)胞流式分選（fluorescence-activated cell sorting，F(xiàn)ACS）、磁性激活細(xì)胞分選（magnetic-activated cell sorting，MACS）以及激光捕獲顯微切割法等[6]。有限稀釋法利用梯度稀釋細(xì)胞懸液，獲得理想狀態(tài)下的單細(xì)胞懸液。該方法無(wú)選擇偏向性，成本較低，但分離效率低下。顯微操作法即在顯微操作下精確地分選收集單個(gè)細(xì)胞，能夠較好地保持細(xì)胞活性，不影響細(xì)胞的狀態(tài)，分離細(xì)胞也較前者更精確，但同樣不適合大規(guī)模操作，僅適用于細(xì)胞量少且無(wú)法用流式分選儀的情況，例如動(dòng)物胚胎或卵子等，以上兩者均屬低通量方法。

FACS借助于細(xì)胞表面標(biāo)記或細(xì)胞特性對(duì)特定群體的細(xì)胞進(jìn)行分選。FACS能大批量獲得單個(gè)細(xì)胞，技術(shù)較為成熟，實(shí)驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)易于統(tǒng)一，是目前應(yīng)用較廣泛的方法，但一定程度上影響了細(xì)胞狀態(tài)。MACS將結(jié)合特定細(xì)胞表面抗原的抗體附著于磁性納米顆粒[7]，混合孵育珠子和細(xì)胞后轉(zhuǎn)移至強(qiáng)磁場(chǎng)的柱子中分離細(xì)胞，該方法可以針對(duì)特定抗原呈陽(yáng)性或陰性分離。激光捕獲顯微切割法提供了在原始自然環(huán)境中從單個(gè)細(xì)胞中分離DNA的低通量方法，但是來(lái)自顯微切割的單細(xì)胞的測(cè)序數(shù)據(jù)質(zhì)量相對(duì)較差。

除了顯微操作技術(shù)，大多數(shù)單細(xì)胞捕獲需使用酶切技術(shù)解離組織，解離過(guò)程在一定程度上降低了細(xì)胞活性，可能會(huì)改變RNA表達(dá)譜。為解決細(xì)胞原始狀態(tài)被破壞的問(wèn)題，轉(zhuǎn)錄組體內(nèi)分析（transcriptome in vivo analysis，TIVA）法可在體內(nèi)的自然環(huán)境中非侵入性捕獲單個(gè)細(xì)胞，通過(guò)光活化后從活組織中的單個(gè)細(xì)胞捕獲mRNA完成體內(nèi)轉(zhuǎn)錄組分析[8]。此外一些特殊細(xì)胞的分離法因細(xì)胞類型而不同，例如腫瘤細(xì)胞具有遷徙的能力，易與血液中的多種細(xì)胞混合，DEP Array系統(tǒng)便可用非均勻電場(chǎng)固定細(xì)胞[9]，從10萬(wàn)個(gè)細(xì)胞的混合物中分離、移動(dòng)和成像單個(gè)腫瘤細(xì)胞。

1.2 建庫(kù)及數(shù)據(jù)獲得 scRNA-seq數(shù)據(jù)的獲得通常經(jīng)過(guò)細(xì)胞裂解、mRNA反轉(zhuǎn)錄、cDNA擴(kuò)增建庫(kù)的過(guò)程。早期研究者多使用平板法，即在微孔板上分選和裂解細(xì)胞進(jìn)行文庫(kù)制備[10-11]，每個(gè)微孔中便有一個(gè)單細(xì)胞進(jìn)行RNA-Seq。后由學(xué)術(shù)團(tuán)體商業(yè)化開(kāi)發(fā)的機(jī)器和微流體系統(tǒng)逐漸代替[12-13]。平板法傾向于利用較低的細(xì)胞數(shù)量，提供更高質(zhì)量的文庫(kù)，其可以從整個(gè)轉(zhuǎn)錄本中產(chǎn)生讀數(shù)，并檢索剪接變體和等位基因特異性等轉(zhuǎn)錄信息。具有已知表面標(biāo)記的稀有細(xì)胞，通常采用FACS法和平板法。

10×genomics微流控技術(shù)是基于Drop-seq和InDrops方法[12-14]，利用微流體將帶有條形碼的微珠和細(xì)胞一起包裹進(jìn)液滴，裝載入用于擴(kuò)增的條碼引物，建立了快速、廉價(jià)、高通量的scRNA-seq方法，由此檢測(cè)數(shù)以千計(jì)的細(xì)胞。雖敏感度偏低，但其成本較低、速度快、效率高。該方法可能使多個(gè)不同的細(xì)胞被相同的條形碼標(biāo)記，產(chǎn)生多個(gè)重復(fù)的細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組，液滴實(shí)驗(yàn)中的雙重速率與負(fù)載細(xì)胞的數(shù)量成正比。10×genomics技術(shù)在液滴中破壞細(xì)胞膜，游離出來(lái)的mRNA與微珠中的逆轉(zhuǎn)錄酶、引物以及脫氧核糖核苷三磷酸（dNTP）接觸，逆轉(zhuǎn)錄為cDNA供進(jìn)一步建庫(kù)。內(nèi)含子連續(xù)熒光原位雜交（sequential fluorescence in situ hybridization，seqFISH） 技術(shù)利用熒光標(biāo)記內(nèi)含子，當(dāng)基因開(kāi)始表達(dá)時(shí)熒光標(biāo)記便描繪了基因表達(dá)的位置和強(qiáng)度，seqFISH可同時(shí)對(duì)單個(gè)細(xì)胞內(nèi)的1萬(wàn)多個(gè)基因進(jìn)行成像觀察[15]。液滴法提供了高細(xì)胞通量，平板法在每個(gè)單獨(dú)的細(xì)胞中提供更高的分辨率。這些方法的不同實(shí)施方式也會(huì)導(dǎo)致略微不同的輸出，例如研究早期胚胎發(fā)育時(shí)考慮到細(xì)胞數(shù)量少，可選擇平板法；對(duì)于胚胎后期發(fā)育階段，每個(gè)胚胎中有成千上萬(wàn)個(gè)細(xì)胞，細(xì)胞具有高水平的異質(zhì)性，液滴法則更適合。

一個(gè)人類細(xì)胞中RNA總量大約為10 pg左右，其中大部分為rRNA，mRNA的含量?jī)H占2%～3%，mRNA的擴(kuò)增從pg提升至μg，百萬(wàn)倍的擴(kuò)增帶來(lái)的偏差會(huì)隨著聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）的擴(kuò)增呈指數(shù)級(jí)放大。因此減小背景噪音和偏差，提升擴(kuò)增的均一度和覆蓋率是測(cè)序分析的要點(diǎn)。

2009年Tang等[1]開(kāi)發(fā)的單細(xì)胞mRNA-seq全轉(zhuǎn)錄組分析利用PCR原理，并保留了部分非編碼RNA，但無(wú)鏈特異性。Quartz-seq法在Tang等[1]的方法基礎(chǔ)上進(jìn)一步優(yōu)化，操作更簡(jiǎn)單，且降低了副產(chǎn)物的含量[16]。SMART（switching mechanism at 5′end of the RNA transcript）建庫(kù)法以總RNA或polyA RNA為模板，以錨定序列oligo（dT）作為引物，并添加胞嘧啶核苷酸，在反轉(zhuǎn)錄酶作用下合成cDNA的第一條鏈，將胞嘧啶C錨定于轉(zhuǎn)錄本尾端，形成polyC尾，進(jìn)而使隨機(jī)寡核苷酸引物與polyC雜交，合成cDNA第二條鏈。得到的產(chǎn)物經(jīng)PCR和進(jìn)一步純化后用于測(cè)序，SMART-seq和SMART-seq2改進(jìn)SAMRT 5′端測(cè)序的缺點(diǎn)可做到全長(zhǎng)測(cè)序[11,17]。自scRNA-seq發(fā)布以來(lái)，該技術(shù)已發(fā)展成為研究復(fù)雜生物體系細(xì)胞異質(zhì)性以及細(xì)胞軌跡的有效方法。

1.3 多組學(xué)分析 多組學(xué)分析是將多種因素如基因組、蛋白質(zhì)組、轉(zhuǎn)錄組、表觀基因組和微生物組組合同步生物分析的方法，可以有效地分析復(fù)雜的大數(shù)據(jù)，以便輕松找到生物標(biāo)記。例如，G&T-seq將DNA測(cè)序與RNA-seq相結(jié)合[18]，擅長(zhǎng)識(shí)別拷貝數(shù)變化對(duì)轉(zhuǎn)錄的影響。M&T-seq同時(shí)使用NMT-seq捕獲DNA甲基化和轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)[19-20]，使用胞嘧啶-磷酸-鳥(niǎo)嘌呤（CpG）甲基轉(zhuǎn)移酶可獲得染色質(zhì)可及性信息等。迄今為止，大多數(shù)scRNA-seq實(shí)驗(yàn)將細(xì)胞分離出原始空間位置，但空間位置會(huì)影響細(xì)胞接收的信號(hào)，特別是在發(fā)育早期，空間位置的影響足以改變細(xì)胞命運(yùn)，增加多重RNA FISH和其他原位測(cè)序技術(shù)等新方法有望在細(xì)胞的原始空間展開(kāi)分析。多組學(xué)分析已允許對(duì)同一細(xì)胞的表觀基因組、轉(zhuǎn)錄組和染色質(zhì)可及性進(jìn)行綜合分析[20]，用共同坐標(biāo)框架計(jì)算記錄胚胎內(nèi)單個(gè)細(xì)胞的位置，可以進(jìn)行跨樣本比較[21]。同時(shí)計(jì)算胚胎內(nèi)部空間分辨的表達(dá)圖將促進(jìn)信號(hào)梯度的計(jì)算推斷，發(fā)現(xiàn)新的形態(tài)發(fā)生模式。

2 scRNA-seq應(yīng)用優(yōu)勢(shì)

2.1 鑒定細(xì)胞亞群 分析scRNA-seq數(shù)據(jù)第一步需要將細(xì)胞亞群分類，進(jìn)一步選擇感興趣的細(xì)胞亞群，評(píng)估亞群特征如細(xì)胞異質(zhì)性，找到不同條件下的差異表達(dá)基因。特別是細(xì)胞數(shù)量很少的情況，在潛在的小細(xì)胞群或稀有細(xì)胞群（例如原始生殖細(xì)胞）之間進(jìn)行比較，scRNA-seq具有極大的優(yōu)勢(shì)。與常規(guī)RNA-seq相同的是，scRNA-seq也利用分層聚類分析鑒別差異表達(dá)基因[22]，運(yùn)用SINCERA技術(shù)（一種細(xì)胞類型富集分析軟件）進(jìn)行基因群分析[23]，判斷該亞群是否與已知細(xì)胞類型相關(guān)。2015年Zeisel等[24]首先證明了基因表達(dá)譜相似的細(xì)胞可以組合在一起，省略細(xì)胞標(biāo)記來(lái)分析，鑒定出了肺泡上皮雙能祖細(xì)胞。后來(lái)這種所謂的逆向組織工程方法幫助研究人員鑒定出了多種組織中的細(xì)胞，更重要的是識(shí)別了這些細(xì)胞群中的新型細(xì)胞[25]。Macosko等[13]則證明如果評(píng)估完整的轉(zhuǎn)錄本，則有可能揭示基于同種型變體的新型細(xì)胞類型特異性。

2.2 探究細(xì)胞異質(zhì)性 來(lái)自同一細(xì)胞系或個(gè)體的細(xì)胞呈現(xiàn)出不同的基因組、轉(zhuǎn)錄組和表觀基因組，即細(xì)胞異質(zhì)性。在多細(xì)胞生物中，細(xì)胞群中的每種細(xì)胞類型具有不同的作用，依據(jù)不同的轉(zhuǎn)錄譜形成亞群。由于缺乏亞群層面的鑒定，亞群之間基因表達(dá)的相關(guān)性常常會(huì)被遺漏[26]。若表達(dá)譜的變化是由于調(diào)節(jié)作用或組成成分的改變，批量分析則無(wú)法識(shí)別。當(dāng)檢測(cè)細(xì)胞分化水平時(shí)，平均表達(dá)譜僅能夠按時(shí)間排列細(xì)胞，因此無(wú)法顯示細(xì)胞發(fā)育階段內(nèi)特異性基因表達(dá)水平及趨勢(shì)[27]。scRNA-seq允許對(duì)組織中各種細(xì)胞類型及其相應(yīng)的轉(zhuǎn)錄譜進(jìn)行分析，結(jié)合分層聚類等技術(shù)，鑒別亞群中和亞群間差異表達(dá)或高表達(dá)的基因，更好地理解細(xì)胞異質(zhì)性。例如，細(xì)胞異質(zhì)性是腫瘤的重要特征，腫瘤細(xì)胞的異質(zhì)性描述了不同腫瘤細(xì)胞基因型和表型兩個(gè)方面的差異。其中表型異質(zhì)性是指同一腫瘤內(nèi)部存在具有不同基因表達(dá)譜和功能特征的腫瘤細(xì)胞。隨著譜系分化和細(xì)胞周期的進(jìn)行，腫瘤細(xì)胞表型異質(zhì)性逐漸形成。scRNA-seq通過(guò)分析單個(gè)腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組，根據(jù)基因表達(dá)的類型將細(xì)胞分為多個(gè)亞群，可更加清晰地了解腫瘤細(xì)胞的動(dòng)態(tài)演變過(guò)程，揭示腫瘤細(xì)胞形成的相關(guān)基因和通路，發(fā)現(xiàn)一些新的腫瘤分子標(biāo)記物等。循環(huán)腫瘤細(xì)胞（circulating tumor cell，CTC）是從原發(fā)性腫瘤流入血管系統(tǒng)或淋巴管并存在于外周血中的腫瘤細(xì)胞的統(tǒng)稱[28]。CTC是造成大多數(shù)腫瘤轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)的因素。CTC scRNA-seq有助于臨床腫瘤患者早期診斷，檢測(cè)腫瘤轉(zhuǎn)移，制定個(gè)性化治療方案等。

2.3 推斷細(xì)胞發(fā)育軌跡 scRNA-seq的一個(gè)優(yōu)勢(shì)是能夠在單個(gè)實(shí)驗(yàn)中捕捉不同發(fā)育階段的細(xì)胞。通過(guò)觀察各階段基因表達(dá)變化，揭示哪些基因是驅(qū)動(dòng)發(fā)育的關(guān)鍵因素，重建發(fā)育路徑[29-30]。目前這種方法已經(jīng)得到廣泛的應(yīng)用。例如研究人類限制性內(nèi)胚層細(xì)胞的形成與分化，scRNA-seq依據(jù)細(xì)胞發(fā)育路徑將其有序排列，可重建已知標(biāo)記的行為軌跡，同時(shí)發(fā)現(xiàn)一些新的候選調(diào)節(jié)基因，其中包括Krüppel樣轉(zhuǎn)錄因子8（Krüppel-like factor 8，KLF8），后通過(guò)功能獲得和敲低實(shí)驗(yàn)，證明KLF8在調(diào)節(jié)中內(nèi)胚層至限制性內(nèi)胚層分化中起關(guān)鍵作用[31]。

雖然scRNA-seq在研究轉(zhuǎn)錄事件中作用強(qiáng)大，但其無(wú)法捕獲控制每種細(xì)胞類型轉(zhuǎn)錄的染色質(zhì)調(diào)節(jié)區(qū)域，因此發(fā)育軌跡的推斷并不局限于轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，也可以從單細(xì)胞染色質(zhì)可及性等方面進(jìn)行研究。染色質(zhì)可及性測(cè)定常用方法有DNase-seq、MNase-seq和ATAC-seq等，且單細(xì)胞染色質(zhì)可及性推導(dǎo)出的發(fā)育軌跡也與表達(dá)信息的推斷密切相關(guān)[32]。此外單細(xì)胞蛋白表達(dá)也可應(yīng)用于發(fā)育軌跡，Bendall等[33]利用質(zhì)譜流式細(xì)胞技術(shù)（mass cytometry）與自主開(kāi)發(fā)的算法結(jié)合，構(gòu)建了從造血干細(xì)胞到幼稚B細(xì)胞的發(fā)育軌跡，揭示了B細(xì)胞來(lái)源的祖細(xì)胞的新生部分，并將它們與發(fā)育調(diào)控的調(diào)節(jié)信號(hào)傳導(dǎo)和免疫球蛋白重排等細(xì)胞事件進(jìn)行比對(duì)，突出了檢測(cè)點(diǎn)，為B淋巴細(xì)胞生成提供了全面的分析。

3 scRNA-seq在生殖發(fā)育中的應(yīng)用進(jìn)展

3.1 scRNA-seq與配子形成 受精后11周的人類雌性胚胎中的生殖細(xì)胞稱為卵原細(xì)胞，雄性胚胎中的生殖細(xì)胞稱為生殖細(xì)胞或前精原細(xì)胞，二者統(tǒng)稱為人類胚胎生殖細(xì)胞（FGCs），即精子和卵子的前體。FGCs對(duì)物種的維持至關(guān)重要，然而其發(fā)育軌跡和異質(zhì)性在很大程度上是不清楚的[34]。通過(guò)scRNA-seq發(fā)現(xiàn)雌性FGCs經(jīng)歷4個(gè)不同的連續(xù)發(fā)育階段，其特征性活動(dòng)分別是有絲分裂、視黃酸信號(hào)傳導(dǎo)、減數(shù)分裂前期和卵子發(fā)生。雄性FGCs發(fā)育則通過(guò)遷移、有絲分裂和細(xì)胞周期停滯。通過(guò)對(duì)正常睪丸細(xì)胞和來(lái)自非梗阻性無(wú)精子癥（NOA）供體的睪丸細(xì)胞進(jìn)行scRNA-seq分析，建立了3種精原細(xì)胞亞型、7種精母細(xì)胞亞型和4種精子細(xì)胞亞型的連續(xù)發(fā)育分層模型，描述了人類精子發(fā)育的發(fā)展，也進(jìn)一步分析鑒定了人類生殖細(xì)胞的幾個(gè)階段特異性標(biāo)記基因，如HMGA1、PIWIL4、TEX29、SCML1和CXC112等[35]。

3.2 scRNA-seq與卵母細(xì)胞發(fā)育 人類卵母細(xì)胞與其周圍卵丘顆粒細(xì)胞（GC）的scRNA-seq分析揭示了轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控網(wǎng)絡(luò)對(duì)人類卵母細(xì)胞和GC相互作用的特征，在特定發(fā)育階段卵母細(xì)胞與GC分別表達(dá)不同的特定基因，如RBM24僅在原始卵泡和初級(jí)卵泡中表達(dá)，甘油-3-磷酸脫氫酶1（GPD1）主要在次級(jí)卵泡和竇卵泡階段表達(dá)，NTF4和LCP2在竇卵泡期特異性表達(dá)等。與之前的研究不同的是，scRNA-seq數(shù)據(jù)表示隨著卵母細(xì)胞成熟，DNA甲基化程度不斷增加[36]。卵丘GC中，甾體類固醇產(chǎn)生相關(guān)的基因在竇卵泡中上調(diào)，在排卵前卵泡中達(dá)到峰值。在卵母細(xì)胞介導(dǎo)的GC增殖和分化中，Notch通路在卵細(xì)胞驅(qū)動(dòng)機(jī)制下被激活[34]，KITLG-kit通路由旁分泌效應(yīng)中GCs表達(dá)的KITLG啟動(dòng)[37]。通過(guò)scRNA-seq確定了影響卵泡發(fā)育、卵巢儲(chǔ)備以及可能控制原始卵泡活化的5種途徑，可為卵巢功能不全的女性提供新的治療策略。

3.3 scRNA-seq與早期胚胎發(fā)育 哺乳動(dòng)物早期胚胎發(fā)育階段細(xì)胞數(shù)量極少，直到囊胚之前胚胎以有絲分裂的形式進(jìn)行發(fā)育，未產(chǎn)生細(xì)胞分化，故早期胚胎細(xì)胞命運(yùn)決定及細(xì)胞異質(zhì)性的研究尤其需要進(jìn)行scRNA-seq分析。近年來(lái)，關(guān)于哺乳動(dòng)物和脊椎動(dòng)物胚胎早期發(fā)育階段的scRNA-seq分析陸續(xù)被報(bào)道。來(lái)自斑馬魚早期胚胎發(fā)育7個(gè)階段的scRNA-seq提供了所有細(xì)胞狀態(tài)組合而成的樹(shù)狀圖，結(jié)合跨時(shí)間相關(guān)細(xì)胞的狀態(tài)，發(fā)現(xiàn)并記錄每種細(xì)胞類型的初轉(zhuǎn)錄現(xiàn)象，并識(shí)別在不同分化狀態(tài)細(xì)胞間差異表達(dá)的基因，記錄每個(gè)譜系的基因表達(dá)變化以及每個(gè)細(xì)胞狀態(tài)的特定標(biāo)記基因[38]。與此同時(shí)，研究者開(kāi)發(fā)了包括人工DNA條形碼追蹤“Tracer-Seq”等技術(shù)，對(duì)野生型斑馬魚轉(zhuǎn)錄組的聚類能夠揭示發(fā)育時(shí)間內(nèi)表皮、神經(jīng)、中胚層和內(nèi)胚層細(xì)胞狀態(tài)集合，其中許多可以基于標(biāo)記基因的表達(dá)特別注釋，且形成細(xì)胞類型的轉(zhuǎn)錄程序的穩(wěn)定性不受信號(hào)干擾影響[39]。

4 結(jié)語(yǔ)

第一個(gè)人類基因組測(cè)序點(diǎn)燃了基因組學(xué)高通量時(shí)代，scRNA-seq的出現(xiàn)可能是我們對(duì)人類胚胎發(fā)育以及疾病細(xì)胞多樣性理解的分水嶺。隨著技術(shù)的革新，scRNA-seq將有助于我們研究早期發(fā)育階段高度異質(zhì)性的細(xì)胞群，但該技術(shù)仍有待進(jìn)一步優(yōu)化與完善，如捕獲效率的增加、技術(shù)噪聲的屏蔽、空間位置對(duì)細(xì)胞接收信號(hào)的影響、基因的自然變異以及基因網(wǎng)絡(luò)傳播調(diào)控等產(chǎn)生的影響等。目前多組學(xué)方法可以整合分析同一細(xì)胞內(nèi)多個(gè)分子層的結(jié)合細(xì)胞在胚胎中的位置信息，逐漸進(jìn)入對(duì)同一細(xì)胞的表觀基因組、轉(zhuǎn)錄組和染色質(zhì)可及性綜合分析的時(shí)代，更深入地了解驅(qū)動(dòng)基因表達(dá)變化的機(jī)制。隨著單細(xì)胞測(cè)序研究的不斷進(jìn)展，我們正在揭開(kāi)細(xì)胞命運(yùn)選擇整體模型的面紗，即生命的發(fā)生過(guò)程，相信單細(xì)胞測(cè)序技術(shù)將推動(dòng)精準(zhǔn)醫(yī)學(xué)的發(fā)展，并對(duì)發(fā)育生物學(xué)產(chǎn)生深遠(yuǎn)的影響。