劉 丹，畢德瀧，陳 鑫，王立鳳

（牡丹江師范學院，黑龍江牡丹江 157012）

狗棗獼猴桃（Actinidia kolomikta）別名狗棗子，是獼猴桃科（Actinidiacese）獼猴桃屬（Actinidia）多年生落葉藤本植物，是最為耐寒的獼猴桃種類之一。主要分布于我國東三省、四川、云南等高山地區(qū)，俄羅斯、日本及朝鮮半島也有分布。喜生于闊葉、針葉混交灌木林且通風良好、土質(zhì)濕潤、腐殖質(zhì)肥沃的自然環(huán)境中。其果實富含維生素C、有機酸、蛋白質(zhì)、多種糖類及人體所需的多種微量元素和氨基酸。狗棗獼猴桃的抗逆性強，還具有藥物開發(fā)、食用保健等經(jīng)濟效益。是東北地區(qū)蘊藏豐富的野生漿果資源，是珍貴的抗寒種質(zhì)資源［1-2］。胚胎發(fā)育晚期富集蛋白（late embryogenesis abundant protein，LEA），分子量在10～30 ku之間，具有高親水性，屬于逆境脅迫響應(yīng)蛋白［3-4］。1989年Dure等在棉花種子中首次發(fā)現(xiàn)LEA的存在，后在大豆、水稻、擬南芥、葡萄等植物中陸續(xù)發(fā)現(xiàn)［5］，LEA的結(jié)構(gòu)和功能一直以來都吸引著眾多科學家的興趣和重視，廣泛存在于植物中。到目前為止已克隆獲得上百種LEA基因［6］，通過各種分子生物學手段，人們發(fā)現(xiàn)，植物營養(yǎng)組織遭受干旱、低溫、ABA處理及鹽脅迫等逆境脅迫后，會產(chǎn)生許多新的mRNA和蛋白質(zhì)，該蛋白質(zhì)中相當大一部分均與LEA蛋白有同源性［7］。眾多研究表明LEA基因的功能主要與抗逆性有關(guān)，植物營養(yǎng)組織遭受逆境脅迫后均能誘導(dǎo)LEA基因的表達［8］。許多LEA基因轉(zhuǎn)化試驗也表明，LEA可顯著提高植物的抗逆性。LEA蛋白富含賴氨酸、甘氨酸、組氨酸等極性氨基酸，缺乏色氨酸和半胱氨酸，無明顯的二級結(jié)構(gòu)，以一種無序狀態(tài)存在于溶液中。目前，LEA基因的研究越來越廣泛，大多研究集中在植物抗逆性方面［9］。鑒于LEA蛋白在植物抗逆性方面的重要作用，本研究以狗棗獼猴桃轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)為參考，篩選到LEA蛋白的cDNA序列，利用生物信息學方法對棗獼猴桃胚胎發(fā)育晚期富集蛋白的理化性質(zhì)、疏水性/親水性、蛋白結(jié)構(gòu)功能域、二級結(jié)構(gòu)、三級結(jié)構(gòu)及同源性等方面進行預(yù)測和分析，以期為狗棗獼猴桃抗寒能力形成的相關(guān)研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料來源

狗棗獼猴桃胚胎發(fā)育晚期富集蛋白cDNA序列從筆者所在實驗室轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中獲得；山黃麻（Parasponia andersonii）、東方苔草（Trema orientale）、歐洲栓皮櫟（Quercus suber）、荷花（Nelumbo nucifera）、中華獼猴桃原變種（Actinidia chinensis var.chinensis）、蘋果（Malus domestica）、土瓶草（Cephalotus follicularis）、博落回（Macleaya cordata）、可可樹（Theobroma cacao）、甜椒（Capsicum annuum）、巴 卡廷辣椒（Capsicum baccatum）、番茄（Solanum lycopersicum）、向日葵（Helianthus annuus）、香 青 蒿（Artemisia annua）、楊 樹（Populus trichocarpa）、石榴（Punica granatum）等植物氨基酸序列在NCBI數(shù)據(jù)庫中下載。

1.2 方法

狗棗獼猴桃AkLEA的理化性質(zhì)用Prot Param（https：//web.expasy.org/cgi-bin/protparam/protparam）進行分析；NCBI-CDD進行保守結(jié)構(gòu)域及蛋白家族預(yù)測（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/）；Inter-Prot Scan（http：//www.ebi.ac.uk/interpro/search/sequence-search）預(yù)測功能位點；NetNGlyc（http：//www.cbs.dtu.dk/services/NetNGlyc/）對N-糖基化位點進行預(yù)測；NetOGlyc（http：//www.cbs.dtu.dk/services/NetOGlyc/）對O-糖基化位點進行預(yù)測；采用Predict Protein數(shù)據(jù)庫（https：//www.predictprotein.org/）對AkLEA蛋白進行二級結(jié)構(gòu)預(yù)測；使用SWISS-MODEL（http：//swissmodel.Expasy.org/）在線軟件預(yù)測蛋白質(zhì)三級結(jié)構(gòu)。從NCBI（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/）數(shù)據(jù)庫中獲得19條不同植物的LEA氨基酸序列信息，利用MEGA 5.0軟件的Neighbor-joining法構(gòu)建蛋白質(zhì)系統(tǒng)進化樹。

2 結(jié)果與分析

2.1 LEA理化性質(zhì)預(yù)測

利用Prot Param軟件對狗棗獼猴桃AkLEA氨基酸序列進行分析，結(jié)果表明，狗棗獼猴桃AkLEA基因cDNA全長為1 292 bp，編碼區(qū)（CDS）為cDNA上第247～912個堿基，共編碼221個氨基酸，分子量24 130.33 u，理論等電點為10.40，負電荷殘基總數(shù)（Asp+Glu）為49，正電荷殘基總數(shù)（Arg+Lys）為12，分子式為C1052H1770N314O306S13，總原子數(shù)3 455，親水性（GRAVY）的平均水平：0.152。不穩(wěn)定指數(shù)（instability index，Ⅱ）為33.97，說明該蛋白較為穩(wěn)定。該蛋白中含量最多的為亮氨酸，占12.2%，其次為異亮氨酸和蘇氨酸，各占10.9%和8.6%。含量最少的為谷氨酰胺、谷氨酸、組氨酸、酪氨酸，均為1.8%（圖1）。有研究表明，大部分植物中的LEA蛋白富含賴氨酸、甘氨酸、組氨酸等極性氨基酸，缺乏色氨酸和半胱氨酸，本研究中狗棗獼猴桃色氨酸缺乏，但是存在半胱氨酸，這是狗棗獼猴桃不同于已研究的其他植物的一個特性。

在自然界中常見的氨基酸均具有親水性和疏水性，其排列順序側(cè)鏈基因之間的相互作用決定了其合成蛋白質(zhì)三維空間結(jié)構(gòu)的主要原因，通過測定和分析可以為高級結(jié)構(gòu)的預(yù)測提供參考。通過Prot Scale軟件分析預(yù)測，結(jié)果表明：該基因蛋白的整個肽鏈中均含有親水性和疏水性氨基酸，得分最大值為3.867，在56、57、58個氨基酸處，最小值為-2.600，在第36個氨基酸處。根據(jù)蛋白質(zhì)親水和疏水的得分判定該蛋白為親水蛋白（圖2）。

2.2 AkLEA信號肽和跨膜結(jié)構(gòu)

有些蛋白質(zhì)合成以后，需要轉(zhuǎn)移到特定位置發(fā)揮作用，信號肽就是引導(dǎo)蛋白質(zhì)到達特定位置的特殊氨基酸序列，一般位于蛋白質(zhì)的N端，長約10～30個氨基酸，包含信號肽的C端、N端和疏水核心區(qū)。SignalP-4.1預(yù)測AkLEA蛋白不含信號肽，也不存在跨膜結(jié)構(gòu)（圖3）。

2.3 狗棗獼猴桃AkLEA功能位點和結(jié)構(gòu)域預(yù)測

通過氨基酸序列的比對，對狗棗獼猴桃AkLEA保守序列及蛋白家族進行預(yù)測，結(jié)果表明，狗棗獼猴桃AkLEA是LEA基因家族的LEA2成員，它的第100～200氨基酸之間的序列區(qū)域為LEA2組的保守結(jié)構(gòu)域（圖4）。NCBI-CDD 和Inter-ProtScan預(yù)測結(jié)果表明，67～221氨基酸為狗棗獼猴桃AkLEA的N端序列，1～39氨基酸為狗棗獼猴桃AkLEA的C端序列。

2.4 AkLEA二級、三級結(jié)構(gòu)預(yù)測

用Predictprotein對AkLEA的二級結(jié)構(gòu)進行預(yù)測，結(jié)果表明，組成AkLEA的221個氨基酸中，其中8.14%的氨基酸可能會形成螺旋（helix），43.44%的氨基酸可能形成延伸鏈（strand），48.42%的氨基酸可能形成環(huán)（loop），無二硫鍵的形成，沒有特殊的二級結(jié)構(gòu)。用SWISS-MODEL對AkLEA蛋白進行三級結(jié)構(gòu)的預(yù)測，結(jié)果如圖5所示。

2.5 蛋白質(zhì)修飾位點的預(yù)測

蛋白質(zhì)磷酸化是調(diào)節(jié)和控制蛋白質(zhì)活力和功能的最基本、最普遍，也是最重要的機制。通過predictprotein分析表明，AkLEA上含有5個糖基化位點（c N-glycosylation site）、7個蛋白激酶C磷酸化位點（Protein kinase C phosphorylation site）、1個酪蛋白磷酸激酶Ⅱ磷酸化位點（Casein kinaseⅡphosphorylation site）、5個十四烷?；稽c（N-myristoylation site）（表1）。

蛋白質(zhì)的N-糖基化修飾是生物體調(diào)控蛋白質(zhì)在組織和細胞中的定位、功能、活性、壽命和多樣性的一種普遍的翻譯后修飾。通過NetNGlyc1.0 server對N-糖基化位點進行預(yù)測，結(jié)果表明，該蛋白內(nèi)有5個潛在的N-糖基化位點，分別在93（NLTV）、146（NMTI）、172（NMSS）、198（NCTM）及204（NATS）氨基酸處。O-糖基化是另一種重要的蛋白質(zhì)翻譯后修飾，O-糖鏈能維持所連接蛋白質(zhì)部分的空間構(gòu)象，NetOGlyc4.0 server對O-糖基化位點進行預(yù)測，預(yù)測分數(shù)均大于0.5的認為是陽性，故推測該蛋白內(nèi)含3個O-糖基化位點，分別在22、26、108氨基酸處。

表1 AkCHS1蛋白修飾位點的預(yù)測

2.6 氨基酸序列同源性對比

在NCBI數(shù)據(jù)庫中分別下載山黃麻、東方苔草、歐洲栓皮櫟、荷花、中華獼猴桃原變種、蘋果、土瓶草、博落回、可可樹、甜椒、巴卡廷辣椒、番茄、向日葵、香青蒿、楊樹、石榴等17種植物的LEA序列，與狗棗獼猴桃AkLEA氨基酸序列進行同源性分析，結(jié)果表明，狗棗獼猴桃AkLEA與中華獼猴桃原變種親緣關(guān)系較近，而與楊樹、石榴等植物親緣關(guān)系較遠（圖6）。

3 討論

本研究利用已測的狗棗獼猴桃轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，篩選出狗棗獼猴桃AkLEA基因cDNA序列信息，并對其進行了生物信息學分析。結(jié)果表明，AkLEA基因cDNA總長1 292 bp，CDS為657 bp，編碼蛋白由221個氨基酸構(gòu)成。具有LEA的保守序列，是LEA2（PLN03160）超家族的一員，是一個親水性、穩(wěn)定的蛋白。LEA＿2組中的蛋白大多為非典型的LEA蛋白，它們與其他分組之間存在著較低的序列同源關(guān)系［10］，AkLEA基因在NCBI數(shù)據(jù)庫中進行Blast，結(jié)果顯示在與狗棗獼猴桃LEA蛋白相比的98條LEA基因的氨基酸序列中，一致性最高的為93.15%，最低的為44.44%。該結(jié)果與Galau等的研究結(jié)果［10］相符。LEA2分組中的非典型LEA蛋白，與典型的LEA蛋白相比，往往具有較高疏水特性，并且具有較為穩(wěn)定的結(jié)構(gòu)。典型的LEA蛋白具有較強的親水特性，它們在脫水條件下可以起到親水性溶質(zhì)的作用，進而維持蛋白結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定。因此，為了鑒定AkLEA基因cDNA序列是否也具有非典型LEA蛋白的這些特性，本研究通過Prot Param在線軟件進行了疏水性鑒定，但是結(jié)果預(yù)測該AkLEA蛋白為親水性蛋白。這一結(jié)果表明了AkLEA蛋白可能擁有不同于非典型的LEA蛋白的功能。選取17條氨基酸序列與狗棗獼猴桃的氨基酸序列進行比對，經(jīng)MAGA 5.0分析，結(jié)果表明，狗棗獼猴桃AkLEA與中華獼猴桃變種親緣關(guān)系較近，而與楊樹、石榴等植物親緣關(guān)系較遠。