安佰義，賈博雅，丁曉麗，劉曉嘉，包文慧

（吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝學(xué)院，吉林長春 130118）

玉扇（Haworthia truncata）是百合科十二卷屬具有代表特征的植物，因其特殊的觀賞價值多用于觀賞性栽培與繁殖。該屬植物主要通過播種和葉插進行繁殖，但播種受環(huán)境約束較大，對環(huán)境溫度、濕度都有要求，且播種繁殖有些性狀難以穩(wěn)定遺傳；葉插成活率較低，且培育時間較長，產(chǎn)量較低，對母本易造成損傷，因此其新品種苗供應(yīng)速度較慢，生產(chǎn)速度較為滯后。

近年來關(guān)于玉扇的研究較少［1-3］，且缺乏全面性。本試驗以玉扇的葉片和花莖作為外植體，采用正交試驗法，挑選最適宜激素配比方案，以提高繁殖系數(shù)，定向選取生長途徑和縮短繁殖周期，為該種植物的擴大生產(chǎn)和今后研究提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

取種植于吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝學(xué)院教學(xué)實驗基地的3年實生玉扇植株，取其健壯、無病蟲害葉片及花莖為外植體。

1.2 方法

1.2.1 外植體的消毒處理 取玉扇葉片和花莖為外植體，用自來水沖洗30 s，然后在超凈工作臺上用分別用75%乙醇浸洗30 s，無菌水沖洗3次，然后0.1%氯化汞分組處理3、5、7、10 min，無菌水沖洗5次，或直接用0.1%氯化汞分組處理3、5、7、10 min，無菌水沖洗5次。

1.2.2 啟動培養(yǎng)基成分及培養(yǎng)條件 將滅菌處理過的外植體接種到含有0.1 mg/L 6-BA和0.1 mg/L NAA的啟動培養(yǎng)基中，基礎(chǔ)培養(yǎng)基為MS，添加9.5 g/L瓊脂，3%蔗糖，pH值為5.8～5.9之間。1周后觀察外植體的滅菌及生長情況，統(tǒng)計污染率和褐化率。前期培養(yǎng)條件為（25±2）℃，光照度約為40μmol/（m2·s），光源為熒光燈，光照時間為12 h/d。后期栽培條件為溫度（25±2）℃，給予日光光照。

1.2.3 增殖培養(yǎng)基成分 將經(jīng)過啟動培養(yǎng)的外植體接種在添加不同濃度組合的植物激素配比的培養(yǎng)基上，基礎(chǔ)培養(yǎng)基為MS，采用L16（43）正交試驗設(shè)計，其中6-BA（細胞分裂素）濃度為0、1、2、3 mg/L，NAA（萘乙酸）濃度為0、0.1、0.3、0.5 mg/L，KT（激動素）濃度為0、0.5、1、1.5 mg/L，20 d后觀察愈傷及不定芽分化情況。將生長狀況良好的愈傷繼續(xù)轉(zhuǎn)入正交設(shè)計培養(yǎng)基中，50 d后觀察、記錄愈傷組織分化情況。

1.2.4 根的誘導(dǎo) 將單個不定芽接種在添加不同蔗糖、活性炭和不同濃度激素組合的培養(yǎng)基上，基礎(chǔ)培養(yǎng)基為1/2MS，采用正交設(shè)計L9（34），其中NAA濃度為0、0.5、1.5 mg/L，（吲哚丁酸）濃度為0、1.5、3 mg/L，蔗糖添加量為10、30、50 g/L，活性炭添加量為0、5、7 g/L，觀察并記錄根的分化過程，分析后選出最優(yōu)生根培養(yǎng)基。

1.2.5 煉苗及移栽 選擇根健壯的組培苗，將其培養(yǎng)瓶的瓶蓋逐漸打開，在瓶內(nèi)加入無菌水，防止試管苗污染，待溫室內(nèi)溫度達22～26℃時，將組培苗移入溫室內(nèi)煉苗。采用泥炭土∶蛭石∶珍珠巖＝2∶1∶1（體積比）為基質(zhì)，經(jīng)過煉苗處理后均勻插入移栽的基質(zhì)中。培養(yǎng)溫度：（24±2）℃，相對濕度70%，給予自然光照。

1.2.6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計 采用Excel 2007和SPSS 17.0對數(shù)據(jù)進行處理分析，對試驗結(jié)果進行方差分析和相關(guān)性分析。

污染率＝污染的外植體數(shù)/接種外植體數(shù)×100%；

褐化率＝褐化的外植體數(shù)/接種外植體數(shù)×100%；

成活率＝存活的外植體數(shù)/接種外植體數(shù)×100%；

愈傷組織誘導(dǎo)率＝形成愈傷組織的外植體數(shù)/接種的外植體總數(shù)×100%；

愈傷組織分化率＝分化出新芽的愈傷組織塊數(shù)/接種的愈傷組織總塊數(shù)×100%；

出芽率＝萌生叢芽的外植體數(shù)/未污染的外植體數(shù)×100%；

生根率＝生根的芽數(shù)/接種的芽總數(shù)×100%。

2 結(jié)果與分析

2.1 最佳消毒處理的篩選

由于取材部位的不同，不同植物器官的耐受性也有所差異，因此本試驗針對不同取材部位進行了分類研究，將進行分組消毒滅菌處理的外植體接種在啟動培養(yǎng)基上，15 d后觀察其污染、褐化情況，得出結(jié)果（表1）。

采用75%乙醇、0.1%氯化汞對玉扇的葉片、花莖進行8組不同的時間的處理，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，不同滅菌試劑的選用及處理時長，對葉片和花莖的影響均不相同。當氯化汞處理時間為10 min時，組8花莖污染率最低，為1.3%，同時組4也出現(xiàn)了最高的褐化率48.3%，在使用30 s乙醇處理的前提下，氯化汞處理5～7 min時，花莖的污染率、褐化率較低，為玉扇花莖的最佳滅菌處理方案。綜合組3、4、7、8可以看出，葉片在氯化汞處理7～10 min時出現(xiàn)了較低污染率，但在氯化汞處理10 min時，褐化率最高，為46.3%。因此，當選用選用乙醇處理30 s、氯化汞處理7～10 min時，葉片存活率較高，污染率和褐化率均較低。使用75%乙醇與0.1%氯化汞共同處理外植體可以明顯降低外植體的污染率，并降低褐化率。

表1 不同滅菌處理對外植體的影響

2.2 增殖培養(yǎng)基的篩選

將經(jīng)過啟動培養(yǎng)的外植體分別接入16個正交培養(yǎng)基中，根據(jù)實際生長情況，可以采用誘導(dǎo)愈傷組織和直接誘導(dǎo)不定芽2種方式進行增殖培養(yǎng)，分別統(tǒng)計其愈傷組織誘導(dǎo)率、出芽率和愈傷組織分化率（表2）。

由圖1、圖2可知，外植體接入培養(yǎng)基，葉片的啟動時間較花莖晚4～5 d，20 d左右在花莖和葉片傷口附近開始產(chǎn)生白色的小型顆粒物（圖1-A、圖1-B），并且很快分化為不定芽或愈傷組織，但此時常伴有褐化現(xiàn)象，應(yīng)及時更換新的培養(yǎng)基將材料轉(zhuǎn)移，并將褐化部分進行切除，防止已生愈傷組織退化。花莖取材部位含有花蕾時，花蕾迅速膨大，并在膨大處產(chǎn)生較多不定芽和愈傷組織（圖1-C）。因此，在16組培養(yǎng)基中根據(jù)外植體初始反應(yīng)的差異，基本分為直接生成不定芽（圖2-A、圖2-D），生成愈傷組織（圖2-C、圖2-F）和不定芽與愈傷組織同時產(chǎn)生（圖2-B、圖2-E）3種生長途徑。不同生長途徑對生產(chǎn)培育的指導(dǎo)意義不同，生成愈傷途徑有助于植株及品種的擴繁，生成不定芽途徑有助于快速生產(chǎn)和一步成苗等技術(shù)的研究。將16組玉扇不同部位愈傷組織誘導(dǎo)率、出芽率和愈傷組織分化率進行極差分析，結(jié)果見表3。

2.2.1 愈傷組織誘導(dǎo) 隨著6-BA濃度的變化，不同培養(yǎng)基內(nèi)產(chǎn)生的愈傷組織也發(fā)生了變化。當6-BA濃度為3.0 mg/L時，花莖產(chǎn)生的愈傷組織較多，但顏色多為黃白色，適當?shù)亟档?-BA濃度，花莖的愈傷組織多為黃綠色，且較飽滿；當6-BA濃度過高時，葉片的愈傷組織生長狀況較差，且出現(xiàn)玻璃化現(xiàn)象，適當加入KT可以減少并有效抑制6-BA濃度較高所引起的玻璃化現(xiàn)象。2種外植體在加入KT和低濃度NAA時都可以得到較好的愈傷組織誘導(dǎo)的效果，愈傷組織飽滿且顏色更為翠綠。

就愈傷組織誘導(dǎo)率的極差分析可以看出6-BA濃度是對愈傷組織誘導(dǎo)率影響最大的因素，這與試驗結(jié)果相同。根據(jù)各因素極差大小順序，并結(jié)合試驗情況，得出花莖的最佳愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基為MS+1.0 mg/L 6-BA+0.1 mg/L NAA+0.5 mg/L KT，葉片的最佳愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基為MS+0.3 mg/L NAA+0.5 mg/L KT。

2.2.2 不定芽誘導(dǎo) 當花莖取材部位含有花蕾時，大部分花蕾在6-BA濃度較高時仍然可以直接分化為大量的不定芽。由表3可知，3種因素對出芽率的影響順序依次為6-BA濃度＞KT濃度＞NAA濃度。將玉扇不同部位愈傷組織誘導(dǎo)率、出芽率進行方差分析，可知6-BA濃度、NAA濃度、KT濃度這3個因素均顯著影響玉扇的愈傷組織誘導(dǎo)率和出芽率（P＝0＜0.05）。綜合試驗結(jié)果和極差分析可知，花莖出芽率最高的培養(yǎng)基選擇為MS+0.1 mg/L NAA+0.5 mg/L KT，葉片出芽率最高的培養(yǎng)基為MS+1.0 mg/L 6-BA+0.3 mg/L NAA+1.0 mg/L KT。選用葉片作為外植體時，當培養(yǎng)基中6-BA的濃度與NAA比值趨近1∶2時，外植體更易優(yōu)先產(chǎn)生粗壯的根系（圖3-A），然后從根系上誘導(dǎo)出大量黃白色愈傷，一段時間后黃白色變綠，愈傷組織變亮，與葉片直接產(chǎn)生的愈傷基本一致，并能快速分化成不定芽（圖3-B）。

2.2.3 愈傷組織分化 將直接誘導(dǎo)生成的不定芽轉(zhuǎn)至生根培養(yǎng)，花莖和葉片所產(chǎn)生的愈傷組織經(jīng)過增殖培養(yǎng)后進入分化階段，花莖所產(chǎn)生的黃白色團狀愈傷體積增大且顏色愈加翠綠（圖3-C），與葉片生成的愈傷組織形態(tài)趨近，構(gòu)成愈傷組織的顆粒頂端逐漸膨大并開始出現(xiàn)不定芽的分化，顆粒底部則聚合在一起形成白色塊狀物（圖3-D）。待顆粒頂端分化出不定芽形態(tài)后，應(yīng)及時對底部的白色塊狀物進行切割，每塊保留3～4個不定芽，以利于不定芽的繼續(xù)生長（圖3-E）；若切割不及時，不定芽易產(chǎn)生畸形，且分化的葉片偏細長。不定芽的分化及生長狀況受3種激素共同調(diào)節(jié)影響，本試驗選用6-BA、NAA和KT 3種激素搭配，并進行篩選，發(fā)現(xiàn)3種激素組合使用愈傷分化效果最佳。從對愈傷組織分化率的極差分析和方差分析中可以看出，不同激素對愈傷分化率的影響大小為6-BA＞NAA＞KT，綜合愈傷組織分化率各因素的極差大?。ū?）可知，MS+1.0 mg/L 6-BA+0.1 mg/L NAA+0.5 mg/L KT為玉扇愈傷組織分化最佳培養(yǎng)基。

表2 玉扇不同部位愈傷組織誘導(dǎo)率、出芽率和愈傷組織分化率

2.3 最佳生根培養(yǎng)基的篩選及移栽

本試驗在前期預(yù)試驗中發(fā)現(xiàn)，各激素配比濃度相同條件下，選用1/2MS為基礎(chǔ)培養(yǎng)基比用MS所產(chǎn)生的新根更健康，植株更飽滿，因此試驗選取了1/2 MS為基礎(chǔ)生根培養(yǎng)基。

將已成功培養(yǎng)的2種植物不定芽分別接種在9種不同的正交培養(yǎng)基中，統(tǒng)計其生根率、生根株數(shù)及不定根生長情況（表4）。添加活性炭的處理組生根狀況明顯優(yōu)于未添加活性炭的處理組，適當調(diào)節(jié)NAA與IBA的濃度可以使植株更加飽滿，且生根效果更好（圖5-F）。

從玉扇生根率的極差分析（表5）可知，4種因素的極差值大小依次為活性炭添加量＞IBA濃度＞NAA濃度＞蔗糖，活性炭對生根誘導(dǎo)影響最大。由生根率的方差分析（表6）可知，NAA、IBA和活性炭濃度這3種因素與生根率均呈顯著相關(guān)，其中活性炭濃度F值最高，達到極顯著水平，這與極差分析結(jié)果一致。綜合分析可以得出生根的最優(yōu)培養(yǎng)基，為1/2MS+0.5 mg/L NAA+3.0 mg/L IBA+10 g/L蔗糖+7 g/L活性炭，活性炭添加量是生根培養(yǎng)的關(guān)鍵影響因子。選用最佳生根培養(yǎng)基進行生根誘導(dǎo)，所產(chǎn)生的根系健康，煉苗后轉(zhuǎn)入栽培基質(zhì)中，移栽成活率可達80%以上。

3 結(jié)論與討論

在外植體的選擇上，選取葉片作為外植體，其出菌率約為花莖的4倍，選取內(nèi)輪新葉作為外植體比老葉出愈率、出芽率高，且繼代次數(shù)的胚性也較老葉強，這與何佳越等對同科屬植物玉露的外植體選取研究結(jié)論［4］相同。本研究發(fā)現(xiàn)，選取花莖作為外植體時，帶花蕾的部分更易直接誘導(dǎo)產(chǎn)生不定芽，且不定芽長勢良好，株型美觀，成活率較高。熊丙全等應(yīng)用根的橫切片作為外植體，在較短時間內(nèi)獲得了玉扇成株［5］，本研究中一些葉片作為外植體時會先產(chǎn)生粗壯的根系，并可從根系進一步發(fā)育，因此可以認為當選取根莖橫切片作為外植體進行組培體系建立時耗時最短。

針對褐化現(xiàn)象，在后期試驗中選取在培養(yǎng)基內(nèi)培養(yǎng)了20、50 d的葉片與生長在原生境的玉扇葉片，用Filion酚法［6］對3種取材進行酚類化合物總含量進行測定，發(fā)現(xiàn)3種材料酚類化合物含量差別微弱，分別為15.07、15.58、14.01 mg/100 g，因此可以初步排除褐化是因為酚類化合物氧引起的，但具體原因還有待進一步研究。

表4 不同對照組對生根誘導(dǎo)的影響

表5 玉扇生根率的極差分析

表6 玉扇生根率的方差分析

表7 玉扇不同階段最適宜誘導(dǎo)培養(yǎng)基

經(jīng)過研究分析，本試驗得出玉扇不同階段最適宜誘導(dǎo)培養(yǎng)基（表7）。6-BA的添加對愈傷組織分化有顯著影響，這與王燕等對壽錦的組培研究結(jié)果［7］一致。根據(jù)6-BA添加的不同濃度和與其他激素的組合可以使外植體向產(chǎn)生愈傷和產(chǎn)生不定芽2種生長途徑定向發(fā)展，生成愈傷途徑有助于植株及品種的擴繁，生成不定芽途徑有助于快速生產(chǎn)和一步成苗等技術(shù)的研究，這為該植物在后期的研究和生產(chǎn)擴繁中提供了參考，且選用直接誘導(dǎo)出芽途徑，所產(chǎn)生的不定芽外形美觀，植株飽滿，成活率高，更大程度上繼承了母本的一些形態(tài)特征，耗時較短。

在生根誘導(dǎo)過程中，發(fā)現(xiàn)活性炭的添加對根系的生長尤為重要。已發(fā)表的玉扇組培體系研究［1-3］中，得出最佳生根培養(yǎng)基為MS+0.1 mg/L NAA濃度，并未見活性炭成分的添加，且本試驗將NAA濃度、IBA、蔗糖和活性炭進行了組合篩選，得到了較為高效的生根誘導(dǎo)培養(yǎng)方案。

玉扇作為百合科十二卷屬的精品代表植物，市場價格一直居高不下，對于玉扇組培體系的研究雖有過報道，但在激素的選擇和配比上卻不盡完善，商品化生產(chǎn)的組培苗品質(zhì)參差不齊。本試驗通過總結(jié)該屬其他植物及玉扇已報道過的激素配比與外植體選擇，將激素濃度、配比選取不同的外植體進行全面的篩選與研究，最終得出較好的激素組合方案，所培育的組培苗植株飽滿，耗時較短，成活率高。調(diào)節(jié)6-BA濃度從而對不同的生長途徑進行調(diào)控，有利于從不同方向?qū)ΨN苗進行產(chǎn)業(yè)化推廣，這對玉扇的規(guī)?；a(chǎn)具有指導(dǎo)意義，也為該植物的組培快繁及科學(xué)研究提供了參考。