李國(guó)勇，許抗抗，楊文佳，駱建林，曹 宇，李 燦

（貴陽學(xué)院大學(xué)科技園/貴州省山地珍稀動(dòng)物與經(jīng)濟(jì)昆蟲重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，貴州貴陽 550005）

熱激蛋白（heat shock protein，簡(jiǎn)稱Hsp）是細(xì)胞或生物體在受到外界環(huán)境的刺激（例如高溫、干旱、饑餓、病原物侵入、重金屬離子等）誘導(dǎo)后產(chǎn)生的一類應(yīng)激性蛋白，它廣泛存在于動(dòng)物、植物和微生物體內(nèi)［1-2］。Hsp可以促進(jìn)蛋白質(zhì)的正確折疊和組裝，阻止變性蛋白聚體，從而將變性蛋白降解或重折疊，在維持生物體正常的生理代謝活動(dòng)中起著重要作用。根據(jù)分子量大小、同源性和分子能可將熱激蛋白分為6個(gè)家族，即 Hsp10、Hsp90、Hsp70、Hsp60、Hsp40和 分 子 量 小Hsp等［3］。

Hsp90蛋白的分子量約為82～90 ku，它是生物體內(nèi)最豐富的蛋白質(zhì)之一，在正常情況下約占胞質(zhì)蛋白的1%～2%。Hsp90家族高度保守，其蛋白質(zhì)包含3個(gè)結(jié)構(gòu)域：N-端保守ATP（腺嘌呤核苷三磷酸）結(jié)合結(jié)構(gòu)域、中間結(jié)構(gòu)域和C-端多肽結(jié)合結(jié)構(gòu)域。Hsp90具有多種生物學(xué)功能，它不僅參與熱害、干旱、高鹽等脅迫響應(yīng)，還可以參與組裝、穩(wěn)定和激活轉(zhuǎn)錄因子、激素受體以及蛋白激酶等關(guān)鍵信號(hào)蛋白［4］。目前，關(guān)于HSP90基因的研究多集中于昆蟲，已有多種昆蟲的Hsp90基因被克隆鑒定。研究發(fā)現(xiàn)，這些基因在應(yīng)對(duì)極端溫度、重金屬離子以及殺蟲劑等各類非生物逆境脅迫中發(fā)揮著關(guān)鍵作用［5-11］。

中國(guó)大鯢（Andrias davidianus）俗稱娃娃魚，屬于兩棲綱（Amphibia）有尾目（Caudata）隱鰓鯢科（Cryptobranchidae）大鯢屬（Andrias），是現(xiàn)存?zhèn)€體最大的兩棲動(dòng)物，為中國(guó)珍稀、瀕危物種，是國(guó)家二級(jí)保護(hù)動(dòng)物，已被列入瀕危野生動(dòng)植物種國(guó)際貿(mào)易公約（簡(jiǎn)稱CITES公約）附錄Ⅰ中［12-15］。由于大鯢具有極高的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值、經(jīng)濟(jì)價(jià)值和科研價(jià)值，其養(yǎng)殖在中國(guó)華中、西南及西北等地區(qū)迅速發(fā)展，并逐步形成了適度規(guī)?；牡胤絻?yōu)勢(shì)特色。但是受到近幾年來全球氣候變暖的影響，極端天氣也頻繁出現(xiàn)，對(duì)大鯢免疫系統(tǒng)的正常運(yùn)行產(chǎn)生了嚴(yán)重影響，從而導(dǎo)致大鯢疾病的頻發(fā)。

本研究以高溫、低溫2種極端溫度脅迫下的大鯢為研究對(duì)象，分別克隆獲得CgHsp901、CgHsp902這個(gè)2個(gè)基因的全長(zhǎng)序列，分析不同組織中這2個(gè)基因的表達(dá)變化，試圖了解該基因在大鯢應(yīng)對(duì)極端溫度脅迫中所發(fā)揮的作用，為深入開展大鯢繁殖與疾病預(yù)防研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料準(zhǔn)備與高溫處理

大鯢幼體來源于貴州省大鯢養(yǎng)殖基地，挑選平均體質(zhì)量為250～300 g的幼體大鯢，用長(zhǎng)25 cm、寬10 cm、高13 cm的塑料盆飼養(yǎng)在溫度分別為0、5、15、20、25℃的人工培養(yǎng)箱中，每個(gè)溫度梯度飼養(yǎng)1盆共4尾幼體大鯢，飼養(yǎng)時(shí)間分別為24、48 h。為了模擬大鯢的洞穴生存環(huán)境，培養(yǎng)箱內(nèi)不開光照燈，試驗(yàn)重復(fù)3遍。處理完成后，統(tǒng)計(jì)各溫度下大鯢幼體的存活率，對(duì)大鯢的心臟、肝臟、胃、脾、肌肉、皮膚和腸道7個(gè)不同組織進(jìn)行取樣。樣品取出后馬上放入液氮中凍存，然后置于-81℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 主要試劑

TRIzol試劑（TRIzol Regent，Invitrogen公司）；反轉(zhuǎn)錄試劑盒（PrimeScript RT Reagent Kit，TaKaRa公 司）；Taq酶（TaKaRa公司）；膠回收試劑盒（Gel Extraction Kit，Omega公司）；載體（pCEM-T EasyVector，Promega公司）；感受態(tài)細(xì)胞DH5α（北京全式金公司）；qPCR試劑（Go Taq qPCR Master Mix，Promega公司）。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 大鯢幼體組織總RNA的提取及第一鏈cDNA的合成根據(jù)TRIzol試劑盒說明書提取大鯢幼體組織的總RNA，用瓊脂糖凝膠電泳和NanoDrop 2000核酸蛋白濃度測(cè)定儀檢測(cè)總RNA的完整性和濃度。取1μg總RNA，按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒的操作說明合成第一鏈cDNA，稀釋2倍后保存于-20℃冰箱備用。

1.3.2 Hsp90基因全長(zhǎng)cDNA的克隆 根據(jù)貴州省山地珍稀動(dòng)物與經(jīng)濟(jì)昆蟲省級(jí)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室前期測(cè)定的大鯢轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，利用NCBI（美國(guó)國(guó)立生物技術(shù)信息中心）站點(diǎn)的ORF（開放閱讀框）Finder軟件（http：//www.ncbi.nlm.hih.gov/gorf/or-fig.cgi）對(duì)所獲得的Hsp90基因進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)1個(gè)具有完整開放閱讀框的cDNA序列，用Primer Premier 5.0軟件設(shè)計(jì)特異性引物（表1）進(jìn)行PCR擴(kuò)增。RT-PCR反應(yīng)體系如下：2.5μL 10×PCR緩沖液，2.5μLMgCl2，2μL dNTPs，各1μL上下游引物，1.0μL cDNA，0.25μL Taq酶以及15μL ddH2O。

表1 引物相關(guān)信息

擴(kuò)增條件如下：95℃預(yù)變性5 min；95℃變性30 s，56℃退火30 s，72℃延伸2.5 min，35個(gè)循環(huán)；72℃延伸10 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)1.5% 瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)后，利用Gel Extraction Mini Kit回收目的條帶并連接至pGEM-T Easy載體上，再將其轉(zhuǎn)化到DH5α大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞中，經(jīng)藍(lán)白斑篩選和PCR鑒定后進(jìn)行測(cè)序驗(yàn)證。本試驗(yàn)中所用引物和DNA測(cè)序由成都擎科生物技術(shù)有限公司完成。

1.3.3 序列分析 利用DNAMAN 6.0（Lynnon Biosoft）對(duì)測(cè)序結(jié)果進(jìn)行編輯和分析，并采用BLAST（http：//www.ncbi.nlm.gov/BLAST/）工具進(jìn)行同源性比對(duì)分析。利用在線數(shù)據(jù)庫Prosite（http：//prosite.expasy.org/）分析保守區(qū)域。利用ProtParam（http：//web.expasy.org/）和NetNGlyc 1.0 server（http：//www.cbs.dtu.dk/services/NetNGlyc/）推測(cè)該氨基酸序列的理化性質(zhì)和N-糖基化位點(diǎn)。

1.3.4 Hsp90基因在溫度脅迫下的相對(duì)表達(dá)量 采用實(shí)時(shí)定量PCR技術(shù)檢測(cè)不同溫度脅迫后幼體大鯢Hsp90基因的相對(duì)表達(dá)量。根據(jù)“1.1”節(jié)的方法，用不同溫度處理大鯢，分別取7個(gè)組織，提取總RNA并反轉(zhuǎn)錄合成cDNA用于實(shí)時(shí)定量PCR，每個(gè)處理設(shè)4次重復(fù)。使用在線軟件Primer 3.0（http：//frodo.wi.mit.edu/）設(shè)計(jì)定量PCR引物，內(nèi)參基因選取EF1α基因，引物序列信息見表1。PCR反應(yīng)體系如下：10μLGo Taq qPCR Master Mix、1μL cDNA、7μL nucleasefreewater（去核酸酶的水）和各1μL上下游引物，混勻，輕微離心，放入CFX96TM Real-Time System實(shí)時(shí)定量PCR儀（Bio-Rad）中進(jìn)行擴(kuò)增，反應(yīng)條件如下：95℃預(yù)變性2 min；95℃變性15 s，60℃退火30 s，72℃延伸30 s，共40個(gè)循環(huán)；于60～95℃進(jìn)行熔解曲線分析以保證反應(yīng)的特異性。用2-ΔΔCT方法計(jì)算目的基因的相對(duì)表達(dá)量［16］。

1.4 數(shù)據(jù)分析

采用SPSS 17.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，應(yīng)用單因素方差分析（ANOVA）對(duì)不同溫度脅迫后大鯢幼體的存活率及其體內(nèi)Hsp90基因的相對(duì)表達(dá)量進(jìn)行差異顯著性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 中國(guó)大鯢CgHsp901、CgHsp902基因的cDNA克隆及序列分析

采用RT-PCR技術(shù)，從中國(guó)大鯢體內(nèi)克隆了熱激蛋白90基因，命名為CgHsp901、CgHsp902。CgHsp901基因cDNA全長(zhǎng)為2 619 bp，開放閱讀框?yàn)? 388 bp，編碼795個(gè)氨基酸；CgHsp902基因cDNA全長(zhǎng)3 024 bp，開放閱讀框?yàn)? 184 bp，編碼727個(gè)氨基酸。2個(gè)基因都具有Hsp90家族特有的標(biāo)簽序列，與其他兩棲動(dòng)物等物種的Hsp90有較高的同源性。2個(gè)基因的理論分子量都為90 ku，等電點(diǎn)分別為4.81、5.32。由CgHsp901推導(dǎo)的氨基酸序列包含Hsp90家族的4個(gè)簽名序列：第95～124位的NKEIFLRELISNSSDALDKIR、第161～169位的LGTIAKSGT、第403～412位的IKLYVRRVFI、第429～433位的GVVDSDDLPLNISRE（圖1）。由CgHsp902推導(dǎo)的氨基酸序列包含Hsp90家族的5個(gè)簽名序列：第39～59位 的 NKEIFLRELISNSSDALDKIR、第 106～114 位 的LGTIAKSGT、第129～145位的MIGQFGVGFYSAYLVAE、第336～345 位 的 IKLYVRRVFI、第 362～376 位 的GVVDSEDLPLNISRE，以及氨基酸C-端末尾基序MEEVD（圖2）。利用NetNGlyc 1.0 server進(jìn)行分析可知，CgHsp901存在5個(gè)N-糖基化位點(diǎn)，分別為N143、N253、N477、N543和N548；而CgHsp902存在4個(gè)N-糖基化位點(diǎn)，分別為N150、N386、N492和N717。

2.2 2個(gè)基因在不同溫度脅迫下的應(yīng)激表達(dá)

利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR（RT-qPCR）檢測(cè)這2個(gè)基因在中國(guó)大鯢心臟、肝臟、胃、胰腺、肌肉、皮膚和腸道7個(gè)不同組織中低溫（0、5℃）和高溫（20、25℃）脅迫下mRNA表達(dá)量的差異，結(jié)果顯示，大鯢幼體經(jīng)低溫處理24、48 h后，CgHsp901 mRNA的相對(duì)表達(dá)量在腸道、胰腺、胃和肝臟中不高，甚至在胰腺和肝臟中的部分表達(dá)量顯著下調(diào)（圖3、圖4）。但在皮膚、肌肉和心臟組織中，CgHsp901 mRNA的相對(duì)表達(dá)量整體上顯著升高。0℃處理24 h后，CgHsp901 mRNA在皮膚中的相對(duì)表達(dá)量是同溫度下腸道、胰腺中表達(dá)量的400倍，是肝臟組織中表達(dá)量的40倍；肌肉、心臟組織中CgHsp901 mRNA的相對(duì)表達(dá)量同樣升高，但是只有對(duì)照組的1～2倍。當(dāng)處理溫度升高到5℃后，CgHspP901 mRNA在皮膚、肌肉和心臟組織中的表達(dá)量較0℃處理時(shí)顯著下降。

另外，當(dāng)大鯢幼體處于20、25℃高溫脅迫時(shí)，該基因在大部分組織中的mRNA相對(duì)表達(dá)量都上調(diào)。其中在25℃高溫處理后，其在肌肉、胃、皮膚、心臟和肝臟中的表達(dá)量顯著上調(diào)。另外，對(duì)圖3、圖4比較可以看出，隨著處理時(shí)間的延長(zhǎng)，CgHsp901基因的mRNA相對(duì)表達(dá)量沒有明顯升高，說明處理時(shí)間長(zhǎng)短不影響CgHsp901基因的表達(dá)。以上結(jié)果說明，高溫、低溫脅迫能夠顯著誘導(dǎo)CgHsp901基因在大鯢體內(nèi)表達(dá)，且mRNA表達(dá)量與脅迫程度成正比。

本研究對(duì)CgHsp902基因同樣進(jìn)行了低溫（0、5℃）和高溫（20、25℃）脅迫處理，結(jié)果顯示，CgHsp902基因在腸道、胰腺和胃組織中的相對(duì)表達(dá)量明顯低于其在肌肉、皮膚、心臟和肝臟組織中的表達(dá)量。與CgHsp901基因一樣，CgHsp902基因在低溫、高溫脅迫下在皮膚、肌肉、心臟和肝臟中的mRNA相對(duì)表達(dá)量整體表現(xiàn)為顯著升高，而且表達(dá)量比CgHsp901基因高（圖5、圖6）。這同樣說明，高溫、低溫脅迫能夠顯著誘導(dǎo)CgHsp901基因在大鯢體內(nèi)的表達(dá)，且mRNA表達(dá)量與脅迫程度成正比。

3 討論

大鯢喜棲息于山澗水深、水質(zhì)清涼、泥潭水流急湍及巖石空洞較多的山溪中，對(duì)溫度變化非常敏感，棲息地氣候溫涼濕潤(rùn)，年平均氣溫為12～17℃，最冷月平均氣溫2℃以上，最熱月平均氣溫在27℃以下，低溫和高溫暴露都可能造成其感染病菌，甚至死亡，從而影響種群發(fā)展［12］。本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，在0、5℃的低溫及20、25℃高溫下分別處理24、48 h后，并未發(fā)現(xiàn)大鯢死亡。在溫度脅迫下大鯢只是將胃中內(nèi)容物吐出，低溫時(shí)不吃不動(dòng)，高溫時(shí)則到處游蕩。從這個(gè)結(jié)果可以看出，大鯢對(duì)短時(shí)低溫或高溫環(huán)境有較強(qiáng)的適應(yīng)性。

熱激蛋白可以分為組成型熱激蛋白和誘導(dǎo)型熱激蛋白。組成型熱激蛋白在正常生理?xiàng)l件下的細(xì)胞中就大量存在，高溫等刺激不會(huì)誘導(dǎo)其大量表達(dá)，大多與維持細(xì)胞基本生理功能和形態(tài)建成密切相關(guān)，而誘導(dǎo)型熱激蛋白在正常生理?xiàng)l件下不存在或表達(dá)量低，但在高溫等逆境刺激下能被強(qiáng)烈誘導(dǎo)表達(dá)，具有保護(hù)細(xì)胞的功能。熱激蛋白90在海洋魚類適應(yīng)海水溫度變化以及體內(nèi)外滲透壓變化等不利條件方面起著重要的作用。熱激蛋白不僅是熱脅迫時(shí)大量表達(dá)的蛋白，也是其他環(huán)境脅迫時(shí)大量表達(dá)的蛋白，如低溫、干旱、高滲透壓及重金屬等環(huán)境因素都能促使生物體表達(dá)熱激蛋白。在很多昆蟲種類中，Hsp90得到了大量的研究。然而有關(guān)大鯢熱激蛋白方面的研究很少，關(guān)于大鯢Hsp90的熱激蛋白基因家族中Hsp90B1、Hsp90AA1基因的研究幾乎未見報(bào)道。本試驗(yàn)利用RT-PCR技術(shù)克隆了大鯢的Hsp90 cDNA片段，為進(jìn)一步明確低溫和高溫脅迫與Hsp90基因表達(dá)量之間的相互關(guān)系奠定了基礎(chǔ)。本試驗(yàn)克隆出的CgHsp901、CgHsp902在正常條件下檢測(cè)到少量存在于肌肉、皮膚、心臟和肝臟中，而當(dāng)大鯢在0℃或25℃下脅迫24、48 h后，2個(gè)基因在皮膚中的表達(dá)量與對(duì)照組相比分別上升了5、20倍，說明這2個(gè)基因誘導(dǎo)表達(dá)的都是誘導(dǎo)型熱激蛋白。而大鯢在低溫、高溫的長(zhǎng)時(shí)間脅迫下能夠全部存活，很可能是皮膚中CgHsp901、CgHsp902基因上調(diào)，在抵抗低溫和高溫脅迫過程中發(fā)揮了重要作用，也可以說明在遇到溫度脅迫時(shí)皮膚是抵御其影響的第一道屏障。另外肌肉、心臟和肝臟組織在低溫和高溫脅迫下CgHsp901、CgHsp902基因的相對(duì)表達(dá)量也高于對(duì)照組，并且它們的平均值都顯著高于腸道、胃和胰腺組織中的相對(duì)表達(dá)量。這說明前三者在應(yīng)對(duì)溫度脅迫的時(shí)候也發(fā)揮了一定的作用，而后面3個(gè)組織則不起作用。