何金花，楊正修，姜路華，方 磊，趙 燕

（湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)生物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，湖南長(zhǎng)沙 410128）

植物花器官發(fā)育是植物生長(zhǎng)周期的重要過(guò)程，也是發(fā)育生物學(xué)研究引人注目的事件。從最早提出的花器官發(fā)育ABC模型，逐步擴(kuò)展到ABCD模型、ABCDE模型。目前，關(guān)于花器官的發(fā)生和發(fā)育相關(guān)的基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)已經(jīng)積累了大量的信息，發(fā)現(xiàn)并克隆了一系列有關(guān)控制花器官分化和發(fā)育的基因。如控制擬南芥中花瓣、雄蕊、心皮、胚珠發(fā)育所必需的STK、SHP、SEP、AP1、AP3、AG、P1、LFY等基因［1-5］。其中與雌蕊發(fā)育相關(guān)的基因包括 AGAMOUS（AG）、CRABSCLAW（CRC）、SEUSS（SEU）、SPATULA（SPT）、STYLISH1（STY1）等［6］。擬南芥心皮發(fā)育主要受CRC、SPT、AG基因的控制，這3個(gè)基因相互關(guān)聯(lián)并發(fā)生作用［7］，三者屬于MADS-box［8-9］中的成員。Yang等在研究花粉不育的過(guò)程中克隆了擬南芥TAPETUM DETERMINANT（TPD1）基因，TPD1編碼1個(gè)含176個(gè)氨基酸的小蛋白與EMS1基因編碼的1個(gè)LRR-RLK（富亮氨酸）蛋白受體激酶［10-11］共同作用，參與花粉形成的調(diào)控機(jī)制［12］，TPD1主要是在小孢子母細(xì)胞中表達(dá)，其突變體tpd1在花藥細(xì)胞層出現(xiàn)發(fā)育缺陷，突變體的絨氈層細(xì)胞被額外形成的小孢子母細(xì)胞所取代。Yang等通過(guò)進(jìn)一步研究，構(gòu)建了35S：：TPD1過(guò)表達(dá)載體在擬南芥的心皮中進(jìn)行異位表達(dá)，結(jié)果顯示，擬南芥長(zhǎng)果角的心皮形態(tài)變寬變短了［13］。Huang等證實(shí)了AtTPD1基因在胚珠中的表達(dá)［14］，AtTPD1的異位表達(dá)可引起胚珠和種子發(fā)育中的多效缺陷，如改變胚珠發(fā)育期間生長(zhǎng)素信號(hào)基因和核心細(xì)胞周期基因的表達(dá)，使細(xì)胞周期蛋白基因CYCD3和CYCA2在胚珠中的表達(dá)水平增高，一旦CYCD3表達(dá)模式受到影響，細(xì)胞周期則會(huì)發(fā)生紊亂，致使心皮細(xì)胞橫向分裂能力增強(qiáng)最終導(dǎo)致心皮變寬［15］。

擬南芥和薺菜同為十字花科植物，二者在遺傳背景、生理特性上有著較多的相似性，但其心皮形態(tài)差異顯著，擬南芥為二心皮發(fā)育成的柱形長(zhǎng)角果，而薺菜則為二心皮心型短角果，說(shuō)明兩者的同源基因在表達(dá)部位和表達(dá)模式上存在差異。為探討薺菜CbTPD1基因在心皮形態(tài)建成中的作用，本研究構(gòu)建TPD1基因啟動(dòng)子的GUS融合表達(dá)載體，轉(zhuǎn)化擬南芥，以期為探討TPD1基因在擬南芥和薺菜雌蕊（心皮）形態(tài)建成過(guò)程中表達(dá)模式的差異提供重要的生物學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

擬南芥（Arabidopsis thaliana）為Columbia生態(tài)型，薺菜（Capsella bursa-pastori）為野生型，均采集于湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)耘園實(shí)習(xí)基地；根癌農(nóng)桿菌（Agrobacterium tumefactions）GV3101、大腸桿菌（Escherichia coli）DH5α、載 體pCAMBIA1301均由湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)生物科學(xué)技術(shù)學(xué)院細(xì)胞生物學(xué)研究室提供。

1.2 植物培養(yǎng)條件

用0.1%氯化汞對(duì)擬南芥種子進(jìn)行表面消毒8 min，于超凈工作臺(tái)上用無(wú)菌水漂洗8～10次，以適當(dāng)密度播種于含10%蔗糖的1/2MS固體培養(yǎng)基上，避光，在4℃條件下春化3 d，轉(zhuǎn)入光照培養(yǎng)室（光周期晝/夜為16 h/8 h，22℃恒溫，50%恒濕）培養(yǎng)。待其長(zhǎng)至14 d時(shí)，轉(zhuǎn)入盛有浸透營(yíng)養(yǎng)液的人工土壤（腐殖土、蛭石、珍珠巖體積比為3∶1∶1）中，蓋上透明塑料薄膜培養(yǎng)2 d，生長(zhǎng)條件同上。

1.3 pCA1301-CbTPD1pro::GUSWTBZ表達(dá)載體的構(gòu)建及遺傳轉(zhuǎn)化

1.3.1 CbTPD1基因啟動(dòng)子片段的克隆 根據(jù)GenBank公布的紅花薺菜TPD1基因序列推導(dǎo)出上游啟動(dòng)子區(qū)域序列，利用DNAUSERchs軟件，分析CbTPD1pro啟動(dòng)子序列的酶切位點(diǎn)。采用DNAMAN設(shè)計(jì)擴(kuò)增引物CbTPD1pro-UP和CbTPD1pro-DN，在引物的5′端分別引入SmaⅠ和NcoⅠ酶切位點(diǎn)，CbTPD1pro-UP：TCCCCCGGGCTCGTGTGATTCTGATTAC TCTCT；CbTDP1pro-DN：CATGCCATGGGTGGTTAGACGTCGGG AAACT，以薺菜總DNA為模板進(jìn)行PCR（預(yù)變性95℃，7 min；變性94℃，40 s；退火68℃，40 s；延伸72℃，100 s；終末延伸72℃，7 min；共30個(gè)循環(huán)）擴(kuò)增，瓊脂糖凝膠電泳后回收純化目的片段。

1.3.2 pCA1301-CbTPD1pro：：GUS載體構(gòu)建及工程農(nóng)桿菌的制備 用SmaⅠ和NcoⅠ限制性內(nèi)切酶在37℃條件下過(guò)夜雙酶切pCAMBIA1301載體和目的片段，將得到的目的片段和目的載體進(jìn)行回收。用T4連接酶將CbTPD1基因啟動(dòng)子連接至pCAMBIA1301載體的預(yù)期位點(diǎn)。通過(guò)熱激法將重組載體轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DH5α，挑取陽(yáng)性克隆進(jìn)行菌落PCR鑒定并送華大基因測(cè)序以證實(shí)重組質(zhì)粒的正確性，并將測(cè)序得到的薺菜CbTPD1基因啟動(dòng)子序列與擬南芥AtTPD1基因啟動(dòng)子進(jìn)行元件的對(duì)比分析。

挑選測(cè)序正確的重組質(zhì)粒通過(guò)電擊法轉(zhuǎn)化根癌農(nóng)桿菌GV3101，將轉(zhuǎn)化液置于YEB固體培養(yǎng)基（內(nèi)含50 mg/mL利福 平+50 mg/mL慶大霉素+50 mg/mL卡那霉素）上，28℃黑暗過(guò)夜培養(yǎng)，挑取陽(yáng)性克隆進(jìn)行菌落PCR鑒定并進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)，用于植物的轉(zhuǎn)化。

1.4 擬南芥的遺傳轉(zhuǎn)化及轉(zhuǎn)基因植株的鑒定

采用浸花序法轉(zhuǎn)化Columbia生態(tài)型擬南芥。收獲T0代種子播種于含潮霉素（30 mg/L）的1/2MS固體培養(yǎng)基上，在植物生長(zhǎng)室培養(yǎng)2周左右將抗性植株移栽至人工土壤中正常生長(zhǎng)，為檢測(cè)目的片段是否已經(jīng)整合到轉(zhuǎn)化受體的基因組中，當(dāng)植株長(zhǎng)至6～8葉時(shí)，以CTAB法提取抗性植株葉片的DNA為模板，設(shè)計(jì)GUS基因特異性引物PC-TPD1proUP-CTCGT GTGATTCTGATTACTCTCTPC-GUSDn-CGAAACGCAGCACGA TACGC對(duì)轉(zhuǎn)基因植株進(jìn)行PCR檢測(cè)，以Columbia生態(tài)型擬南芥為對(duì)照，鑒定轉(zhuǎn)基因植株。

1.5 轉(zhuǎn)基因植株的GUS組織化學(xué)染色及顯微觀察

取擬南芥轉(zhuǎn)基因植株的幼苗及花序等置于GUS染液中進(jìn)行抽真空，直至材料組織沉入染液底部。置于37℃恒溫箱避光染色12 h左右，脫色后將染色組織置于奧林巴斯SZX10體式顯微鏡下觀察染色結(jié)果并拍照。

2 結(jié)果與分析

2.1 CbTPD1啟動(dòng)子的克隆

根據(jù)GenBank公布的紅花薺菜TPD1基因序列推導(dǎo)出上游啟動(dòng)子區(qū)域序列，設(shè)計(jì)擴(kuò)增引物，以薺菜總DNA為PCR模板進(jìn)行同源克隆，擴(kuò)增出與預(yù)期大小1 561 bp相符的目的片段（圖1），經(jīng)測(cè)序比對(duì)與預(yù)期一致，說(shuō)明成功克隆了薺菜CbTPD1pro的啟動(dòng)子序列。

2.2 pCA1301-CbTPD1pro::GUS載體的構(gòu)建

對(duì)克隆至T載體上的CbTPD1pro片段的重組質(zhì)粒pMD18-CbTPD1pro和植物表達(dá)Ti質(zhì)粒載體pCAMBIA1301用SmaⅠ和NcoⅠ分別進(jìn)行雙酶切，純化酶切產(chǎn)物，進(jìn)行連接反應(yīng)，構(gòu)建pCA1301-CbTPD1pro：：GUS融合表達(dá)載體（圖2）。將連接產(chǎn)物熱激轉(zhuǎn)化到大腸桿菌，然后從大腸桿菌中DH5α提取該重組載體，再轉(zhuǎn)化到農(nóng)桿菌感受態(tài)GV3101中，GV3101菌落PCR檢測(cè)（圖3）和酶切鑒定（圖4），與預(yù)期的CbTPD1pro 1 600 bp左右大小相符，說(shuō)明 pCA1301-CbTPD1pro：：GUS報(bào)告載體構(gòu)建成功。

2.3 CbTPD1基因啟動(dòng)子測(cè)序與啟動(dòng)子元件分析

通過(guò)PlantCARE啟動(dòng)子在線分析軟件，對(duì)薺菜CbTPD1（圖5）、擬南芥AtTPD1基因啟動(dòng)子元件的比較分析（表1）發(fā)現(xiàn)，二者均具有植物啟動(dòng)子最基本的高轉(zhuǎn)錄水平調(diào)控因子、光響應(yīng)元件、茉莉酸酯、赤霉素響應(yīng)等元件。但二者的逆境脅迫響應(yīng)元件存在較大差異，如CbTPD1pro缺乏水楊酸響應(yīng)順式作用元件，赤霉素與茉莉酸酯響應(yīng)元件也與AtTPD1pro有差異，CbTPD1pro元件中包含了參與玉米素代謝途徑，以及在胚乳表達(dá)的順式作用元件，而AtTPD1pro元件中卻沒(méi)有。其主要差異體現(xiàn)在胚乳表達(dá)元件、光響應(yīng)元件以及對(duì)赤霉素、水楊酸的響應(yīng)等方面。

2.4 擬南芥遺傳轉(zhuǎn)化及篩選

將成功轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌的重組載體，通過(guò)浸花法轉(zhuǎn)化Columbia生態(tài)型擬南芥。收獲T0代種子平鋪于篩選培養(yǎng)基（1/2 MS+3%蔗糖+7%瓊脂+30 mg/mL潮霉素）上，7 d左右種子均可萌發(fā)。在植物生長(zhǎng)室培養(yǎng)2周后可觀察到，非轉(zhuǎn)基因的擬南芥幼苗中由于沒(méi)有潮霉素抗性基因的表達(dá)，其根與真葉的分化受到抑制，葉片卷曲、植株無(wú)根，而后慢慢黃化萎蔫；成功轉(zhuǎn)入重組載體的擬南芥幼苗則正常生根，分化真葉，可以長(zhǎng)出蓮座葉（圖6中黑色箭頭所示）。

2.5 轉(zhuǎn)基因植株的鑒定

將抗性苗移栽至營(yíng)養(yǎng)缽，待生長(zhǎng)健壯后取單株葉片提取DNA作模板，用檢測(cè)引物PC-TPD1proUP/PC-GUSDn進(jìn)行PCR分子檢測(cè)。由圖7可知，1號(hào)泳道為野生型陰性對(duì)照，2號(hào)泳道為質(zhì)粒陽(yáng)性對(duì)照，3～12號(hào)泳道為轉(zhuǎn)基因陽(yáng)性植株的分子檢測(cè)，其中除4號(hào)、8號(hào)、12號(hào)泳道檢測(cè)未獲得目的條帶，其余均可擴(kuò)增出預(yù)期大小為1 561 bp的目的條帶，即為轉(zhuǎn)基因植株。PCR擴(kuò)增結(jié)果表明，外源目的基因已整合進(jìn)植株基因組中。

2.6 轉(zhuǎn)基因植株的GUS組織化學(xué)染色及顯微觀察

將轉(zhuǎn)基因擬南芥T1代種子平鋪于篩選培養(yǎng)基（1/2 MS+3%蔗糖+7%瓊脂+30 mg/mL潮霉素）上，置于光照培養(yǎng)室生長(zhǎng)7 d后對(duì)幼苗進(jìn)行GUS染色檢測(cè)，14 d左右移栽至營(yíng)養(yǎng)缽繼續(xù)生長(zhǎng)，對(duì)其花序進(jìn)行GUS染色檢測(cè)，通過(guò)實(shí)體顯微鏡觀察。其染色結(jié)果（圖8、圖9）顯示，轉(zhuǎn)基因擬南芥幼苗中，薺菜CbTPD1pro：：GUS在幼苗期子葉、真葉、根、根毛等部位均可見(jiàn)明顯的GUS著色，表明薺菜CbTPD1啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的GUS報(bào)告基因在擬南芥幼苗各部位均有高水平的表達(dá)（圖8-A、圖8-B為轉(zhuǎn)35S：：GUS陽(yáng)性對(duì)照）?；ㄐ蛑谢ㄆ鞯墓v柄、花絲、蜜腺、柱頭及花瓣的維管束等部位均檢測(cè)到明顯的GUS活性（圖8-E、圖8-F、圖8-G、圖8-H），但在花藥中卻沒(méi)有GUS活性的表達(dá)（圖8-F），這與實(shí)驗(yàn)室前期AtTPD1在擬南芥花藥中的過(guò)表達(dá)結(jié)果不同，擬南芥AtTPD1在花藥中表達(dá)明顯（圖9-A、圖9-B）。從花器發(fā)育的幾個(gè)時(shí)期取材進(jìn)行GUS染色的結(jié)果分析發(fā)現(xiàn)，CbTPD1pro：：GUS在花序幼嫩的花蕾期幾乎不表達(dá)（圖8-C、圖8-E）。當(dāng)花器發(fā)育至第8至第9期左右時(shí)，CbTPD1基因可在雌蕊的柱頭表達(dá)，隨后開(kāi)始在花托、花萼、蜜腺等部位表達(dá)，其中在第12、第13期左右其表達(dá)量達(dá)到峰值，在后續(xù)心皮發(fā)育過(guò)程中，心皮的頂部及基部始終具有較高水平的表達(dá)（圖8-C、圖8-E、圖8-F、圖8-G，圖8-D為野生型花序?qū)φ眨?。其GUS基因在薺菜花器官中的表達(dá)活性和組織定位，為后續(xù)研究CbTDP1基因在薺菜、擬南芥心皮發(fā)育過(guò)程中的不同表達(dá)模式提供了有價(jià)值的依據(jù)。

表1 薺菜與擬南芥TPD1啟動(dòng)子元件分析比對(duì)

3 討論

本研究以pCAMBIA1301為出發(fā)質(zhì)粒構(gòu)建了薺菜CbTPD1基因啟動(dòng)子的GUS融合表達(dá)載體，并通過(guò)轉(zhuǎn)化Columbia生態(tài)型擬南芥獲得了穩(wěn)定遺傳的轉(zhuǎn)基因植株，為進(jìn)一步研究CbTPD1基因的表達(dá)特征提供了可靠的材料?，F(xiàn)有研究表明，AtTPD1在絨氈層發(fā)育時(shí)期主要是在生殖細(xì)胞中表達(dá)，它的突變影響絨氈層細(xì)胞的分化發(fā)育，使花藥細(xì)胞層出現(xiàn)發(fā)育缺陷，其絨氈層細(xì)胞被額外形成的小孢子母細(xì)胞所取代［16］，TPD1可通過(guò)與EMS1互作參與花粉形成的調(diào)控并可在心皮進(jìn)行異位表達(dá)，參與心皮形態(tài)建成。有意思的是，本研究將薺菜CbTPD1啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的GUS基因轉(zhuǎn)化擬南芥后發(fā)現(xiàn)，薺菜CbTPD1卻不在擬南芥的花藥（雄蕊）中表達(dá)，這與Yang等報(bào)道的擬南芥AtTPD1參與絨氈層的形成及小孢子母細(xì)胞的發(fā)育等研究結(jié)果［13］不同，這暗示了CbTDP1基因可能不參與絨氈層和小孢子母細(xì)胞的發(fā)育，而是特異性地在心皮中表達(dá)并影響和促進(jìn)其最終發(fā)育成短角果，或在參與花粉發(fā)育調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的位置上與擬南芥有所差異，TDP1基因在薺菜、擬南芥心皮發(fā)育過(guò)程中的不同表達(dá)模式，影響整個(gè)心皮發(fā)育的基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)而導(dǎo)致了兩者心皮形態(tài)的差異。但植物心皮形態(tài)發(fā)育過(guò)程受多種基因調(diào)控，這些基因協(xié)同參與心皮形態(tài)的建成，除主效基因直接參與調(diào)控心皮發(fā)育外，生長(zhǎng)素的極性運(yùn)輸和濃度分布都對(duì)雌蕊頂端發(fā)育及心皮的形態(tài)建成具有重要作用。本研究通過(guò)對(duì)薺菜CbTPD1啟動(dòng)子在擬南芥中的GUS染色定位分析為深入研究該基因?qū)π钠ば螒B(tài)建成的影響奠定了研究基礎(chǔ)。