李 俊， 劉孟源， 方升平， 王維香

（西華大學(xué)食品與生物工程學(xué)院，四川成都 610039）

油橄欖又名洋橄欖、齊敦果，是以 “高產(chǎn)、優(yōu)質(zhì)、高效”為特征的世界名貴常綠木本油料和果用樹種[1］，國(guó)外學(xué)者已從中分離得到100多個(gè)化合物，其中油橄欖葉中含有的抗氧化活性成分較果實(shí)更突出，主要為多酚類[2-4］。研究表明，油橄欖葉提取物有著降血脂、降血糖、降血壓作用，并且可預(yù)防老年癡呆和癌癥，治療膽結(jié)石，抑制病毒和細(xì)菌[5-7］，同時(shí)具有很強(qiáng)的抗氧化活性，可取代化學(xué)防腐劑用于食品保鮮[8-11］，國(guó)外已將其廣泛用于化妝品、食品和藥品。油橄欖葉多酚類成分的分離提取技術(shù)包括有機(jī)溶劑萃取[6］、超聲輔助浸提[12-13］、 微波輔助浸提[14］、 超臨界流體萃取[15］、吸附法[16］等，其中吸附法對(duì)酚類／多酚類物質(zhì)的分離濃縮有明顯優(yōu)勢(shì)[17］。

油橄欖引入我國(guó)后受到政府大力扶持，已經(jīng)初具規(guī)模，特別是四川、云南、甘肅等地已經(jīng)出現(xiàn)較具規(guī)模的大型基地，但僅利用了其果實(shí)，而大量葉被廢棄，造成資源浪費(fèi)，目前回收利用該部位葉中的活性成分越來越受到重視[18-21］。因此，本實(shí)驗(yàn)比較9種大孔吸附樹脂對(duì)油橄欖葉中總黃酮的吸附、解吸、動(dòng)力學(xué)特性，從中篩選出選擇性好、吸附率高、易解吸的樹脂，同時(shí)優(yōu)化其吸附與解吸條件，為提高其質(zhì)量提供指導(dǎo)意義。

1 材料

油橄欖葉采自涼山州會(huì)理縣豐達(dá)生態(tài)農(nóng)業(yè)有限公司油橄欖種植基地，經(jīng)西華大學(xué)食品與生物工程學(xué)院楊文宇副教授鑒定為木犀科木犀欖屬常綠喬木油橄欖Olea europaea L.的葉，將其自然晾干粉碎后過100目篩，40℃下干燥至恒定質(zhì)量。UV-2600紫外可見分光光度計(jì) （上海尤尼柯儀器有限公司）；RE-52B真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 （上海亞榮生化儀器廠）；TDL-40B臺(tái)式低速離心機(jī) （湖南星科科技儀器有限公司）；ST-02A多功能粉碎機(jī) （永康市帥通工具有限公司）；層析柱 （上海嘉鵬科技有限公司）；BS-100A自動(dòng)分部收集器、HL-2恒流泵 （上海滬西分析儀器廠）。大孔吸附樹脂基本信息見表1。蘆丁對(duì)照品 （上海試劑二廠）；其他試劑均為分析純 （成都市科龍化工試劑廠）。

表1 大孔吸附樹脂基本信息Tab.1 Basic information of macroporous adsorption resins

2 方法

2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制[4］以蘆丁對(duì)照品質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo) （X），吸光度為縱坐標(biāo) （A）進(jìn)行回歸，得到回歸方程為A＝0.735 2X-0.001 9，在0.09～1.075 mg／mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.2 總黃酮質(zhì)量濃度測(cè)定 稱取干燥至恒定質(zhì)量的油橄欖葉144.8 g，1 L 70%乙醇在80℃下水浴提取2 h，4 000 r／min離心10 min，收集上清液，同法提取殘?jiān)?，合?次上清液，40℃、50 r／min下濃縮至 870 mL，加入 0.4%殼聚糖醋酸溶液100 mL，過濾，濾液用70%乙醇稀釋至2 180 mL，測(cè)定總黃酮質(zhì)量濃度。

2.3 大孔吸附樹脂篩選[22-25］

2.3.1 預(yù)處理 非極性樹脂用95%乙醇浸泡24 h，充分溶脹，95%乙醇沖洗至洗出液加適量蒸餾水無白色渾濁，再用雙蒸水洗至無醇味；陰離子交換樹脂用1 mol／L HCl浸泡2～3 h后，蒸餾水洗至近中性，再用1 mol／L NaOH浸泡2～3 h后蒸餾水洗至近中性；D296樹脂依次用丙酮和乙醇浸泡24 h，再用雙蒸水洗至無醇味。

2.3.2 靜態(tài)飽和吸附量測(cè)定 稱取預(yù)處理后的樹脂各1.000 g，加入 100 mL樣液，室溫下振蕩24 h，于1、2、4、6、8、24 h取1 mL上清液測(cè)定總黃酮含有量，計(jì)算樹脂對(duì)總黃酮的飽和吸附量，公式為飽和吸附量＝ （C0-Ct）Vy／Ws， 其中 C0為吸附前樣品溶液中總黃酮質(zhì)量濃度，Ct為吸附后樣品溶液中總黃酮質(zhì)量濃度，Vy為樣品溶液體積，Ws為樹脂質(zhì)量。

2.3.3 靜態(tài)解吸率測(cè)定 將吸附飽和的樹脂置于250 mL錐形瓶中，加入100 mL 70%乙醇振蕩6 h后靜置24 h，取1 mL上清液，測(cè)定解吸液中總黃酮含有量，計(jì)算樹脂靜態(tài)解吸率，公式為解吸率＝[（CjVj） ／（QWs）]×100%， 其中， Cj為解吸后上清液中總黃酮質(zhì)量濃度，Vj為解吸后上清液體積，Ws為樹脂質(zhì)量，Q為樹脂靜態(tài)飽和吸附量。

2.4 HPD-300型大孔吸附樹脂吸附總黃酮的條件

2.4.1 正交試驗(yàn) 在預(yù)試驗(yàn)基礎(chǔ)上，選擇總黃酮質(zhì)量濃度 （A）、上樣液體積流量 （B）、上樣液pH值 （C）、洗脫液體積流量 （D）作為影響因素，每個(gè)因素3個(gè)水平，通過L9（34）表進(jìn)行設(shè)計(jì)。因素水平見表2。

表2 因素水平Tab.2 Factors and levels

然后，取25 mL樹脂裝柱，層析柱徑高比1∶10，油橄欖葉提取液上柱量16 BV，70%乙醇洗脫，收集洗脫液，每組200 mL，測(cè)定總黃酮含有量，計(jì)算樹脂動(dòng)態(tài)吸附率，公式為吸附率＝[ （C0Vy-CiVi） ／（C0Vy）]×100%， 其中C0為上樣液中總黃酮質(zhì)量濃度，Vy為上樣液體積，Cl為流出液中黃酮質(zhì)量濃度，Vl為流出液體積。

2.4.2 吸附泄漏曲線考察 條件為上柱液總黃酮質(zhì)量濃度3.25 mg／mL，pH值5.0，上柱體積流量2 BV／h，層析柱徑高比 1∶10，收集流出液，1 BV／管，測(cè)定每管收集液中總黃酮質(zhì)量濃度，繪制吸附泄漏曲線。

3 結(jié)果

3.1 總黃酮質(zhì)量濃度測(cè)定 表3顯示，總黃酮平均質(zhì)量濃度為1.945 mg／mL。從144.8 g干燥油橄欖葉中提取分離出的總黃酮質(zhì)量為4.24 g，油橄欖葉中總黃酮得率為2.93%。

表3 總黃酮質(zhì)量濃度測(cè)定結(jié)果Tab.3 Results of concentration determination of total flavonoids

3.2 大孔吸附樹脂篩選 表4顯示，強(qiáng)極性樹脂D296、S-8對(duì)總黃酮的吸附作用較好，但解吸率極低；弱極性樹脂AB-8、S-8雖然有較大的比表面積，但吸附量和解吸率都較低；非極性樹脂LS-8比表面積較小，吸附性能較差；非極性樹脂HPD-300、D140比表面積較大，孔徑較小，對(duì)總黃酮的吸附性很強(qiáng)，解吸率也較高，尤其是前者有更大的比表面積，吸附作用更強(qiáng)。另外，總黃酮在強(qiáng)極性樹脂上具有很強(qiáng)的吸附能力，但解吸難，而在非極性或弱極性樹脂上有更好的吸附效果，故本實(shí)驗(yàn)選擇非極性樹脂HPD-300進(jìn)行后續(xù)研究。

表4 大孔吸附樹脂吸附量、解吸率Tab.4 Adsorption quantities and desorption rates of macroporous adsorption resins

3.3 吸附總黃酮條件

3.3.1 動(dòng)態(tài)吸附 表5～6顯示，各因素影響程度依次為A＞C＞B＞D，最優(yōu)工藝為A1B3C3D3，即徑高比1∶10，上樣液質(zhì)量濃度3.25 mg／mL，體積流量2 BV／h，pH值5.0，體積16 BV，洗脫液體積流量1 BV／h，總黃酮吸附率最高，為83.5%。另外，低質(zhì)量濃度下總黃酮不利于吸附，當(dāng)上樣液質(zhì)量濃度為3.25 mg／mL時(shí)其吸附率最大，超過該質(zhì)量濃度后反而下降，可能產(chǎn)生泄漏，導(dǎo)致處理量下降。

表5 試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Tab.5 Design and results of tests

表6 方差分析Tab.6 Analysis of variance

3.3.2 吸附泄漏曲線 圖1顯示，上樣液體積在5 BV后開始泄漏，到16 BV時(shí)泄漏液中總黃酮質(zhì)量濃度為 3.20 mg／mL，接近上樣液質(zhì)量濃度（3.25 mg／mL），可認(rèn)為樹脂柱吸附量達(dá)到飽和。因此，確定最大上樣液體積為16 BV左右。

圖1 總黃酮吸附泄露曲線Fig.1 Adsorption leakage curve for total flavonoids

3.3.3 吸附洗脫曲線 圖2顯示，洗脫曲線峰型集中，無明顯拖尾現(xiàn)象，總黃酮洗脫集中出現(xiàn)在1～5 BV區(qū)域，以此為富集段，測(cè)得總黃酮洗脫率為94%，富集率為346.7%，即是原來的3.47倍。

圖2 總黃酮吸附洗脫曲線Fig.2 Adsorption elution curve for total flavonoids

3.3.4 驗(yàn)證試驗(yàn) 采用 “3.3.1”項(xiàng)下最優(yōu)工藝進(jìn)行3次驗(yàn)證試驗(yàn)，結(jié)果見表7。由表可知，經(jīng)過樹脂純化后可去除大量雜質(zhì)，從而提高總黃酮量。

表7 驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果 （n＝3）Tab.7 Results of verification tests（n＝3）

4 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)通過測(cè)定9種大孔吸附樹脂對(duì)油橄欖葉總黃酮的吸附特性，綜合比較吸附量、解吸率、解吸物中總黃酮質(zhì)量濃度。結(jié)果，非極性樹脂HPD-300對(duì)總黃酮的分離純化效果最佳，故確定其作為最佳吸附樹脂。最佳純化工藝為樹脂柱徑高比1∶10，總黃酮質(zhì)量濃度 3.25 mg／mL，上樣體積16 BV，體積流量2 BV／h，蒸餾水洗脫3 BV后再用8 BV 70%乙醇洗脫，收集洗脫液，回收乙醇，干燥，此時(shí)總黃酮吸附率為83.5%，洗脫率為94%，富集率為346.7%，制得產(chǎn)品中其得率為10.19%，質(zhì)量分?jǐn)?shù)為87.38%，回收率為80.74%。