胡昭君， 陳 斌， 余岳林， 張少敏

（上海市靜安區(qū)食品藥品檢驗(yàn)所，上海 200435）

陳香露白露片由甘草、次硝酸鉍、陳皮、碳酸鎂、川木香、氧化鎂、大黃、碳酸氫鈉、石菖蒲組成，功效健胃和中、理氣止痛，主要用于胃酸過多、慢性胃炎引起的胃脘痛等癥狀。目前，陳香露白露片質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)[1］中的含有量測(cè)定僅針對(duì)化藥次硝酸鉍，尚未涉及甘草、陳皮等中藥成分；前期報(bào)道有測(cè)定次硝酸鉍中鉍含有量的[2］，測(cè)定陳皮中橙皮苷含有量的[3-6］，測(cè)定甘草中甘草酸銨、甘草次酸含有量的[7-8］，分別測(cè)定陳皮中橙皮苷、甘草中甘草酸銨含有量的[9］，但對(duì)其他中藥成分含有量測(cè)定均無報(bào)道。陳香露白露片中甘草有補(bǔ)中益氣、緩急止痛、清熱解毒的作用[10］，主要成分為甘草酸銨；陳皮有理氣健脾、燥濕化痰的作用[11］，主要成分為橙皮苷；川木香在治療胃腸道疾病方面有比較好的療效，其主要活性成分為木香烴內(nèi)酯和去氫木香內(nèi)酯[12］。本實(shí)驗(yàn)通過HPLC法同時(shí)測(cè)定陳香露白露片中甘草酸銨、橙皮苷、木香烴內(nèi)酯、去氫木香內(nèi)酯的含有量，方法快速簡(jiǎn)便，穩(wěn)定可靠，可更有效地控制該制劑內(nèi)在質(zhì)量，并為保證其臨床用藥安全提供依據(jù)。

1 材料

1.1 儀器 Waters E2695高效液相色譜儀，配置真空脫氣機(jī)、四元泵、自動(dòng)進(jìn)樣系統(tǒng)、柱溫箱、二極陣列管檢測(cè)器、色譜工作站 （美國(guó) Waters公司）；Branson B55000S-MT超聲波清洗器 （上海必能信超聲有限公司）；ME-235S／CP124S電子天平（德國(guó)賽多利斯公司）。

1.2 試藥 橙皮苷 （110721-201617， 含有量96.1%）、 甘草酸銨 （110731-201619， 含有量93.0%）、木香烴內(nèi)酯 （111524-201710， 含有量99.5%）、去氫木香內(nèi)酯 （111525-201711，含有量99.8%）對(duì)照品均購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究院。甲醇為色譜純 （德國(guó)Merck公司）；其他試劑均為分析純；水為超純水。5批陳香露白露片均購(gòu)自藥店，來自5家生產(chǎn)企業(yè) （批號(hào)170105、20170502、161201、 160411、 A161260）。

2 方法與結(jié)果

2.1 溶液制備

2.1.1 對(duì)照品溶液 精密稱取對(duì)照品橙皮苷9.83 mg、甘草酸銨19.34 mg、木香烴內(nèi)酯9.50 mg、去氫木香內(nèi)酯9.37 mg，置于4個(gè)50 mL量瓶中，甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，作為貯備液。分別精密量取4種貯備液5、2、1、1 mL置于同一20 mL量瓶中，50%甲醇稀釋定容至刻度，搖勻，即得。

2.1.2 供試品溶液 取質(zhì)量差異項(xiàng)下片劑研勻，精密稱取約0.5 g，置于50 mL量瓶中，加適量50%甲醇超聲提取30 min，取出，放冷，50%甲醇稀釋定容至刻度，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.1.3 陰性樣品溶液 按處方比例及工藝，分別制備缺陳皮、甘草、川木香的陰性樣品，按“2.1.2”項(xiàng)下方法制備相應(yīng)溶液，即得。

2.2 色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗(yàn) Agilent Eclipse C18色譜柱 （250 mm×4.6 mm， 5 μm）； 流動(dòng)相甲醇 （A） -0.1%磷酸 （B）， 梯度洗脫 （0～20 min，70%～60%B； 20～30 min， 60% ～40%B； 30～50 min， 40% ～30%B； 50～51 min， 30% ～10%B；51～56 min， 10%B； 56～57 min， 10% ～70%B；57～67 min， 70%B）； 體積流量 1.0 mL／min； 柱溫30℃；檢測(cè)波長(zhǎng)230 nm；進(jìn)樣量20 μL。理論塔板數(shù)按橙皮苷計(jì)均大于8 000，各成分色譜峰與相鄰峰的分離度均大于3.0。

2.3 專屬性試驗(yàn) 取對(duì)照品、供試品、陰性樣品溶液適量，在 “2.2”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定，結(jié)果見圖1。由圖可知，供試品在對(duì)照品相同保留時(shí)間處有色譜峰，陰性無干擾，待測(cè)成分與其他成分分離度良好。

2.4 線性關(guān)系考察 精密稱取橙皮苷對(duì)照品20.62 mg，置于100 mL量瓶中，甲醇稀釋定容至刻度，作為橙皮苷對(duì)照品貯備液；精密稱取甘草酸銨對(duì)照品19.80 mg、木香烴內(nèi)酯對(duì)照品11.38 mg、去氫木香內(nèi)酯對(duì)照品10.76 mg，置于同一20 mL量瓶中，甲醇稀釋定容至刻度，作為混合對(duì)照品貯備液。分別精密量取前一種對(duì)照品貯備液2.5、5、10、15、30 mL，后一種對(duì)照品貯備液0.25、0.5、1.0、2.0、4.0 mL，置于50 mL量瓶中，50%甲醇稀釋定容至刻度，搖勻，作為相應(yīng)對(duì)照品溶液，在“2.2”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣20 μL測(cè)定。以對(duì)照品質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo) （X），峰面積積分值為縱坐標(biāo)（Y）進(jìn)行回歸，結(jié)果見表1，可知各成分在各自范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

圖1 各成分HPLC色譜圖Fig.1 HPLC chromatograms of various constituents

表1 各成分線性關(guān)系Tab.1 Linear relationships of various constituents

2.5 精密度試驗(yàn) 取供試品溶液 （批號(hào)170105）1份，在 “2.2”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定6次，測(cè)得橙皮苷、甘草酸銨、木香烴內(nèi)酯、去氫木香內(nèi)酯峰面積 RSD分別為 0.31%、0.38%、0.32%、1.07%，表明儀器精密度良好。

2.6 重復(fù)性試驗(yàn) 取同一批號(hào) （170105）片劑，按 “2.1.2”項(xiàng)下方法平行制備6份供試品溶液，在 “2.2”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定，測(cè)得橙皮苷、甘草酸銨、木香烴內(nèi)酯、去氫木香內(nèi)酯含有量RSD分別為1.07%、0.84%、1.23%、0.61%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.7 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取供試品溶液 （批號(hào)170105）1 份， 于 0、 4、 8、 12、 16、 20、 24、 28、 32、36 h在 “2.2”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定，測(cè)得橙皮苷、甘草酸銨、木香烴內(nèi)酯、去氫木香內(nèi)酯峰面積RSD分別為0.60%、0.53%、0.79%、0.36%，表明供試品溶液在36 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.8 加樣回收率試驗(yàn) 精密稱取橙皮苷、甘草酸銨、木香烴內(nèi)酯、去氫木香內(nèi)酯對(duì)照品適量，50%甲醇稀釋，制成每1 mL分別含上述對(duì)照品0.188 9、0.047 56、 0.041 16、 0.041 60 mg／mL的對(duì)照品溶液。精密稱取 “2.6”項(xiàng)下含有量已知的片劑 （批號(hào)170105）0.25 g，共9份，置于50 mL量瓶中，精密加入對(duì)照品溶液4、5、6 mL，再加入適量50%甲醇，按 “2.1.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，在 “2.2”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定，計(jì)算回收率，結(jié)果見表2。

2.9 樣品含有量測(cè)定 取5批片劑，按 “2.1.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，在 “2.2”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定，外標(biāo)法計(jì)算含有量，結(jié)果見表3。

3 討論

3.1 流動(dòng)相選擇 參照2015年版 《中國(guó)藥典》中陳皮、甘草、川木香含有量測(cè)定條件，本實(shí)驗(yàn)考察了乙腈-0.1%磷酸、甲醇-水、乙腈-水、甲醇-0.1%磷酸，發(fā)現(xiàn)各成分色譜峰峰形在甲醇-0.1%磷酸中較好，而且與相鄰雜質(zhì)峰的分離度均能達(dá)到要求，故選擇其作為流動(dòng)相。

表2 各成分加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果 （n＝9）Tab.2 Results of recovery tests for various constituents（n＝9）

3.2 檢測(cè)波長(zhǎng)選擇 本實(shí)驗(yàn)采用二極管陣列檢測(cè)器，在190～380 nm波長(zhǎng)范圍內(nèi)進(jìn)行掃描，發(fā)現(xiàn)橙皮苷在194、284、328 nm附近有最大吸收，而且在230 nm處有1個(gè)肩峰，其吸收值高于 284、328 nm；甘草酸銨在194、251 nm附近有最大吸收，而且在250 nm處呈肩峰；木香烴內(nèi)酯和去氫木香內(nèi)酯在194 nm附近有最大吸收，而且其吸收值隨著波長(zhǎng)增加呈下降趨勢(shì)，300 nm以上基本無吸收，考慮到194 nm為末端吸收，溶劑及雜質(zhì)干擾會(huì)比較大，而在230、251 nm附近4種成分都會(huì)有一定吸收，故選擇230、251 nm作為檢測(cè)波長(zhǎng)。然后，考察各成分響應(yīng)值及雜質(zhì)對(duì)測(cè)定的干擾，發(fā)現(xiàn)在230 nm波長(zhǎng)處各成分響應(yīng)值均較高，與雜質(zhì)峰分離良好；在251 nm處木香烴內(nèi)酯、去氫木香內(nèi)酯響應(yīng)值太低。最終，選擇230 nm作為檢測(cè)波長(zhǎng)。

3.3 提取條件選擇 本實(shí)驗(yàn)考察以甲醇、75%甲醇、50%甲醇、稀乙醇為溶劑超聲30 min的提取效果，發(fā)現(xiàn)溶于50%甲醇時(shí)不僅各成分峰形良好，而且雜質(zhì)對(duì)目標(biāo)成分測(cè)定基本無干擾，故選擇50%甲醇作為溶劑。再考察超聲30 min、加熱回流30 min、室溫浸漬過夜的提取效果，發(fā)現(xiàn)室溫浸漬過夜時(shí)提取率最低，而加熱回流提取率略高于超聲，但雜質(zhì)明顯更多，甚至有1個(gè)已經(jīng)干擾到目標(biāo)成分測(cè)定，故選擇超聲作為提取方法。然后，考察超聲15、30、45、60 min時(shí)的提取率，發(fā)現(xiàn)提取45、60 min時(shí)的提取率接近30 min，高于15 min，故選擇30 min作為提取時(shí)間。

3.4 含有量分析 表3顯示，5批陳香露白露片中4種成分含有量存在顯著差異，以木香成分木香烴內(nèi)酯、去氫木香內(nèi)酯最明顯，RSD分別高達(dá)64.1%、83.3%，而陳皮成分橙皮苷RSD也高達(dá)33.2%。由于陳香露白露片中各藥材均以原粉入藥，故推測(cè)上述現(xiàn)象可能是投料用飲片質(zhì)量參差不齊所致，為了保證該制劑臨床用藥安全有效，需要對(duì)其中所含成分的含有量進(jìn)行監(jiān)控。