李 菁， 馬東來， 劉宏偉， 馮建明， 李靜娟， 鄭玉光

（河北中醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院，河北石家莊 050200）

金銀花為忍冬科植物忍冬 Lonicera japonica Thunb.的干燥花蕾，具有清熱解毒、抗菌消炎等功效，是傳統(tǒng)的藥食兩用大宗藥材，近些年由于需求增加，其種植面積不斷擴(kuò)大[1-3］。金銀花鮮品含水量約為80%，顏色綠白、氣味清香，藥效成分含有量高，而2015版 《中國藥典》規(guī)定按干燥品計算，含木犀草苷不得少于0.050%，綠原酸不得少于1.5%，但它在貯存、運(yùn)輸、干燥過程中木犀草苷含有量時常下降，低于藥典要求。課題組前期研究結(jié)果表明，金銀花在干燥過程中會產(chǎn)生不同程度褐變，造成外觀顏色劣變，并伴隨有綠原酸、木犀草苷等藥效成分降解，導(dǎo)致其藥用價值降低，并直接影響其品質(zhì)、外觀和商業(yè)價值[4-6］。

金銀花在加工中出現(xiàn)的顏色劣變屬于酶促褐變[7］，主要是由多酚氧化酶催化酚羥基類化合物，再發(fā)生反應(yīng)生成醌類化合物及其聚合物的過程。目前，防止金銀花褐變的主要措施有熱風(fēng)干燥、真空干燥、微波真空聯(lián)合干燥、熱泵遠(yuǎn)紅外聯(lián)合干燥等，但存在設(shè)備投資大、對金銀花中指標(biāo)性成分木犀草苷含有量提高不明顯等問題[8-11］；近年來，也有采用抗壞血酸、4-己基間苯二酚、L-半胱氨酸、檸檬酸、丙酮等單一抑制劑對金銀花多酚氧化酶進(jìn)行體外抑制的報道[12］。

本實驗通過單一抑制劑處理金銀花，經(jīng)熱風(fēng)干燥后，考察其對木犀草苷、綠原酸含有量的影響，然后在此基礎(chǔ)上篩選多酚氧化酶復(fù)合抑制劑，為減少貯藏和加工過程中金銀花產(chǎn)生褐變及藥效成分損失提供理論依據(jù)。

1 材料

1.1 儀器 LC-20A型高效液相色譜儀，配置SPD-20A檢測器 （日本島津公司）；Milli-Q?Referenen系統(tǒng)超純水機(jī) （北京博奧恒信生物有限公司）；PH-140A型立式電熱鼓風(fēng)干燥箱 （上海一恒科學(xué)儀器有限公司）；ME204E型電子天平 [十萬分之一，梅特勒-托利多儀器 （上海）有限公司］；高速中藥粉碎機(jī) （浙江榮浩工貿(mào)有限公司）；KQ-250DE型超聲波清洗器 （昆山市超聲儀器有限公司）。

1.2 試藥 維生素C、β-環(huán)糊精、植酸、檸檬酸、曲酸、L-半胱氨酸、4-己基間苯二酚 （食品級，河南天興食品添加劑有限公司）；無碘食鹽 （中鹽河北鹽業(yè)專營有限公司）；木犀草苷、綠原酸對照品（中國食品藥品檢定研究院）。乙腈、甲醇為色譜純 （美國Fisher公司）；甲醇、乙醇、冰醋酸、磷酸、磷酸氫二鈉均為分析純；水為高純水（自制）。

1.3 藥材 金銀花采自河北中醫(yī)學(xué)院藥園、河北省邢臺市巨鹿縣堤村鄉(xiāng)紀(jì)家寨，經(jīng)河北中醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院鄭玉光教授鑒定為忍冬科植物忍冬Lonicera japonica Thunb.的干燥花蕾。

2 方法

2.1 木犀草苷、綠原酸含有量測定 綠原酸含有量測定方法采用2015版 《中國藥典》，木犀草苷含有量測定方法在藥典基礎(chǔ)上進(jìn)行改進(jìn)。色譜條件為 Intertsil?ODS-3色譜柱 （4.6 mm×250 mm，5 μm）；流動相乙腈-0.5%冰醋酸，梯度洗脫 （0～15 min，10%～19%乙腈；15～32 min，19%乙腈；32～38 min， 19% ～35% 乙腈； 38～40 min， 35% ～10%乙腈； 40～50 min， 10% 乙腈）[2］； 體積流量1.0 mL／min；柱溫20℃；檢測波長350 nm。

2.2 單因素試驗

2.2.1 pH值 取25 g新鮮金銀花，共5份，置于pH值4、5、6、7、8的250 mL磷酸緩沖液中浸泡60 min，取出，瀝干，40℃熱風(fēng)干燥至恒定質(zhì)量，測定木犀草苷、綠原酸含有量。

2.2.2 浸泡時間 取25 g新鮮金銀花，共5份，置于pH值為5的250 mL磷酸緩沖液中浸泡0、20、40、60、120、240 min，取出，瀝干，40℃熱風(fēng)干燥至恒定質(zhì)量，測定木犀草苷、綠原酸含有量。

2.2.3 料液比 取25 g新鮮金銀花，共5份，加入pH值為 5的磷酸緩沖液 0、100、150、200、250、300 mL，浸泡時間為最佳時間，取出，瀝干，40℃熱風(fēng)干燥至恒定質(zhì)量，測定木犀草苷、綠原酸含有量。

2.2.4 單一抑制劑試驗設(shè)計 以木犀草苷、綠原酸含有量為評價指標(biāo)，將維生素C、食鹽、β-環(huán)糊精、曲酸、4-己基間苯二酚、檸檬酸，半胱氨酸、植酸配制成不同質(zhì)量濃度溶液 （表1），在最佳浸泡時間、料液比條件下進(jìn)行單因素試驗，考察其對金銀花褐變的抑制效果。

表1 單一抑制劑試驗設(shè)計Tab.1 Design of tests for single inhibitors

2.2.5 復(fù)合抑制劑試驗設(shè)計 根據(jù)單一抑制劑試驗設(shè)計結(jié)果，選取抑制效果較好的維生素C、曲酸、β-環(huán)糊精、食鹽，通過Box-Behnken響應(yīng)面法進(jìn)行復(fù)合抑制劑組成優(yōu)化。因素水平見表2。

表2 因素水平Tab.2 Factors and levels

3 結(jié)果

3.1 單因素試驗 圖1A顯示，pH值為5時綠原酸、木犀草苷含有量最高，故確定pH值為5。圖1B顯示，浸泡時間40、60、120 min時木犀草苷含有量均較高，而120 min時綠原酸含有量最高，故確定浸泡時間為120 min。圖1C顯示，料液比為1∶8時綠原酸含有量最高，而木犀草苷含有量也接近最高值，故確定料液比為1∶8。

3.2 單一抑制劑

3.2.1 維生素C、食鹽 維生素C具有還原性，可促使內(nèi)源性酚類物質(zhì)氧化成的鄰醌還原，此外還能作為酶螯合劑作用于多酚氧化酶中的銅離子，從而起到抑制褐變的作用[13］。圖2A顯示，維生素C可明顯提高木犀草苷、綠原酸含有量，其質(zhì)量濃度為0.2 mg／mL時達(dá)到最高；但其質(zhì)量濃度繼續(xù)提高時兩者含有量反而有所下降，這與 “3.1.1”項下pH值結(jié)果相符，溶液pH過低，抑制效果也有所下降。

圖1 各因素對木犀草苷、綠原酸含有量的影響Fig.1 Effects of various factors on galuteolin and chlorogenic acid contents

食鹽中的Na+可與多酚氧化酶結(jié)構(gòu)中的Cu2+產(chǎn)生競爭，降低其活性，從而抑制褐變[14］。圖2B顯示，當(dāng)食鹽質(zhì)量濃度為10.0 mg／mL以上時綠原酸含有量明顯增加，20.0 mg／mL時最高；對于木犀草苷而言，食鹽質(zhì)量濃度在2.0～40.0 mg／mL之間時其含有量均明顯提高，而且無顯著差異。

3.2.2 β-環(huán)糊精、曲酸 β-環(huán)糊精既可抑制鄰苯醌及以后聚合物質(zhì)的生成，又能與多酚氧化酶結(jié)合而抑制后者活性[13］。圖3A顯示，β-環(huán)糊精對木犀草苷、綠原酸含有量均有一定程度提高，其質(zhì)量濃度在0.5 mg／mL以上時木犀草苷含有量提高程度較穩(wěn)定，而在1.0 mg／mL時綠原酸含有量最高。

曲酸是微生物產(chǎn)生的一種代謝物弱酸，可抑制多酚氧化酶活性，并具有抑菌作用[15］。圖3B顯示，曲酸可明顯提高木犀草苷含有量，其質(zhì)量濃度為5.0 mg／mL時提高了48.21%，并對綠原酸含有量也有一定程度提高。

圖2 維生素C （A）、食鹽 （B）對木犀草苷、綠原酸含量的影響Fig.2 Effects of vitamin C （A） and salt（B） on galuteolin and chlorogenic acid contents

圖3 β-環(huán)糊精 （A）、曲酸 （B）對木犀草苷、綠原酸含有量的影響Fig.3 Effects of β-cyclodextrin （A） and kojic acid （B）on galuteolin and chlorogenic acid contents

圖4 酸性抑制劑對木犀草苷、綠原酸含有量的影響Fig.4 Effects of acid inhibitors on galuteolin and chlorogenic acid contents

3.2.3 酸性抑制劑 檸檬酸抑制褐變機(jī)制是分子中的羧基對多酚氧化酶中的銅離子有較強(qiáng)絡(luò)合作用[13］，但圖4A顯示它對木犀草苷、綠原酸含有量的提高程度不明顯，這是因為該成分還可降低體系pH值以促進(jìn)褐變進(jìn)行，故對金銀花多酚氧化酶活性的抑制效果較差。4-己基間苯二酚抑制褐變機(jī)制是與多酚氧化酶結(jié)合使其失去催化活性[13］；L-半胱氨酸是一種可溶性氨基酸，結(jié)構(gòu)中的巰基（-SH）可與酶促褐變產(chǎn)生的醌形成穩(wěn)定無色化合物，從而抑制褐變[16］；植酸又名肌醇六磷酸，其結(jié)構(gòu)中的6個磷酸基團(tuán)使其具有很強(qiáng)的絡(luò)合能力，而且在很寬的pH值范圍內(nèi)可絡(luò)合多酚氧化酶中的銅輔基，從而抑制褐變[17］，但圖4B～4D顯示這3種抑制劑對木犀草苷、綠原酸含有量均無明顯提高作用。

3.3 復(fù)合抑制劑 在單一抑制劑實驗結(jié)果基礎(chǔ)上，以維生素C （A）、β-環(huán)糊精 （B）、 曲酸 （C）、食鹽 （D）質(zhì)量濃度為影響因素，木犀草苷含有量提高率為評價指標(biāo) （Y），Box-Behnken響應(yīng)面法優(yōu)化復(fù)合抑制劑組成，結(jié)果見表3。

表3 試驗設(shè)計及結(jié)果Tab.3 Design and results of tests

然后，通過Design Expert 8.0.6軟件對表3數(shù)據(jù)結(jié)果作多元回歸分析，得到多元二次回歸方程為Y＝32.14+1.29A+1.07B+11.14C-6.73D+5.13AB+2.92AC-2.60AD+0.23BC+0.41BD-2.81CD+2.43A2-5.07B2+0.026C2+0.34D2， 方差分析[18］見表4。由表可知，模型P＜0.000 1，表明模型極顯著；失擬項P＞0.05，表明模型擬合程度良好；R2為0.971 5， R2adj為0.943 1，表明模型與數(shù)據(jù)擬合合理，精度較好，而且實驗值與預(yù)測值之間存在較高的相關(guān)性；因素C、D、AB、B2對木犀草苷含有量提高率影響極顯著 （P＜0.01），AC、AD、CD、A2對其影響較顯著 （P＜0.05）；各因素影響程度依次為 C＞D＞A＞B。

響應(yīng)面分析見圖5，可知與方差分析結(jié)果一致。通過Design-Expert 8.0.6軟件，得到復(fù)方抑制劑最佳組成為 0.2 mg／mL維生素 C，2.3 mg／mL β-環(huán)糊精， 8.0 mg／mL 曲酸， 10.6 mg／mL 食鹽，木犀草苷含有量提高率56.18%。再以最佳組成進(jìn)行3批驗證試驗，測得木犀草苷含有量提高率分別為55.13%、56.79%、54.92%，平均55.61%，與預(yù)測值56.18%相當(dāng) （偏差率為1.73%），表明模型合理，預(yù)測性良好；綠原酸含有量提高率分別為10.69%、9.23%、9.45%，平均 9.79%，表明復(fù)合抑制劑能很好地提高金銀花品質(zhì)。

4 結(jié)論

圖5 各因素響應(yīng)面圖Fig.5 Response surface plots for various factors

表4 方差分析Tab.4 Analysis of variance

本實驗篩選金銀花多酚氧化酶抑制劑，得到其復(fù)方抑制劑最佳組成為 0.2 mg／mL維生素 C，2.3 mg／mL β-環(huán)糊精， 8.0 mg／mL 曲酸， 10.6 mg／mL食鹽，在料液比1∶8條件下浸泡金銀花120 min后經(jīng)熱風(fēng)干燥，測得木犀草苷含有量提高率達(dá)到55.61%，可有效改善其他加工方法對其含有量提高不明顯的狀況，并且與預(yù)測值56.18%高度吻合，模型擬合度較好。此外，該復(fù)合抑制劑對綠原酸含有量也有一定程度提高，對金銀花產(chǎn)地加工具有較高的實用價值。