施崇精， 袁強(qiáng)華， 謝 凡， 劉 莉， 宋 英?

（1.成都中醫(yī)藥大學(xué)，四川成都 610075；2.成都中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院，四川成都 610075）

中藥顆粒臨床應(yīng)用廣泛，其克服了傳統(tǒng)湯劑煎煮不便、服用量大、不易保存攜帶等缺陷，而且可保持中藥湯劑吸收快、顯效迅速等優(yōu)勢(shì)。但該制劑大多由經(jīng)方、驗(yàn)方等加減而成，藥味多樣，成分復(fù)雜，含有多個(gè)化學(xué)組分群，單一成分含有量測(cè)定難以保證其整體質(zhì)量[1］。而多成分定量測(cè)定能有效全面地優(yōu)化制劑工藝，提升質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，尤其是采用HPLC法時(shí)，不僅精密度高，重復(fù)性好，還具有成本低、耗時(shí)短等優(yōu)勢(shì)，可為中藥制劑多組分含有量測(cè)定提供科學(xué)依據(jù)[2-3］。

加味四妙顆粒是成都中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院研發(fā)的新制劑，它以四妙散為基礎(chǔ)，由大血藤、延胡索、黃柏、甘草、蒼術(shù)、川牛膝、薏苡仁7味藥材組成，方中大血藤、延胡索為君藥，具有活血化瘀、行氣止痛、清熱解毒之功效，其中前者藥效成分紅景天苷具有抗炎、改善血液微循環(huán)、抗病毒等作用[4］，而后者藥效成分延胡索乙素具有顯著的鎮(zhèn)痛、鎮(zhèn)靜作用[5］；臣以黃柏苦寒燥濕，專清下焦?jié)駸幔S柏堿、鹽酸小檗堿是其主要活性成分，具有廣譜抗菌、抗炎、鎮(zhèn)痛等作用[6］；蒼術(shù)、甘草等為佐使藥，可使全方具有燥濕、清熱、活血、止痛之功效，其中甘草苷和甘草酸銨作為甘草中最重要的有效成分，前者可抑制炎癥因子，而后者具有較強(qiáng)的抑制病毒增殖作用[7-8］。前期已有測(cè)定加味四妙顆粒中各藥材所含成分含有量的報(bào)道[5，9-11］。本實(shí)驗(yàn)采用 HPLC法同時(shí)測(cè)定其中紅景天苷、黃柏堿、甘草酸銨、延胡索乙素、鹽酸小檗堿、甘草苷的含有量，以期為該制劑的質(zhì)量控制和評(píng)價(jià)提供科學(xué)依據(jù)。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 Agilent 1260高效液相色譜儀 （美國安捷倫科技公司）；BP-211D電子天平 [十萬分之一，賽多利斯科學(xué)儀器 （中國）有限公司］；LE204E電子天平 （萬分之一，瑞士梅特勒-托利多公司）；KH-250B超聲波清洗器 （昆山禾創(chuàng)超聲儀器有限公司）；DK-98-Ⅱ電熱恒溫水浴鍋 （天津市泰斯特儀器有限公司）。

1.2 試藥 紅景天苷 （批號(hào) 170312，含有量98.0%）、鹽酸小檗堿 （批號(hào) 161203，含有量98.0%）對(duì)照品均購自成都植標(biāo)化純生物科技有限公司；黃柏堿 （批號(hào) 111895-201504，含有量94.9%）、甘草酸銨 （批號(hào)110731-200615，含有量100%）、延胡索乙素 （批號(hào)110726-201112，含有量99.6%）、甘草苷 （批號(hào) 111610-201106，含有量100%）對(duì)照品均購自中國食品藥品檢定研究院。加味四妙顆粒 （批號(hào) 20180105、20180109、20180116）由成都中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院藥劑科制劑室生產(chǎn)。甲醇、乙腈、磷酸為色譜純 （美國Tedia公司）；其他試劑均為分析純；水為超純水（自制）。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件 Agilent ZORBAX SB-C18色譜柱（250 mm×4.6 mm， 5 μm）； 流動(dòng)相乙腈 （A） -0.1%磷酸 （B），梯度洗脫 （0～10 min，8%～11%A； 10～23 min， 11% ～13%A； 23～28 min， 13% ～19%A； 28～35 min， 19% ～20%A； 35～50 min，20%～23%A；50～60 min，23% ～26%A；60～70 min， 26% ～65%A； 70～75 min， 65%A）； 檢測(cè)波長220 nm （0～25、 37～45 min）、 280 nm （25～37、 45～60 min）、 250 nm （60～75 min）； 體積流量1.0 mL／min； 柱溫30℃； 進(jìn)樣量10 μL。

2.2 溶液制備

2.2.1 對(duì)照品溶液 精密稱取對(duì)照品紅景天苷4.78 mg、黃柏堿10.42 mg、甘草酸銨 6.17 mg、延胡索乙素5.17 mg、鹽酸小檗堿19.64 mg、甘草苷9.92 mg，置于5 mL量瓶中，甲醇溶解并定容，搖勻，即得相應(yīng)貯備液，分別精密吸取1、2、2、1、2、1 mL置于10 mL量瓶中，甲醇定容，搖勻，即得 （含有紅景天苷 93.69 μg／mL、 黃柏堿395.54 μg／mL、 甘草酸銨 246.80 μg／mL、 延胡索乙素25.75 μg／mL、 鹽酸小檗堿 769.89 μg／mL、 甘草苷 198.40 μg／mL）。

2.2.2 供試品溶液 取樣品適量，研細(xì)，精密稱取約1.0 g，置于具塞錐形瓶中，精密加入80%甲醇10 mL，密塞，稱定質(zhì)量，加熱回流20 min，放冷，80%甲醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，0.45 μm微孔濾膜過濾，取續(xù)濾液，即得。

2.2.3 陰性供試品溶液 按加味四妙顆粒處方比例和制備工藝，分別制得缺大血藤、黃柏、甘草、延胡索的陰性顆粒，按 “2.2.2”項(xiàng)下方法制備相應(yīng)陰性供試品溶液。

2.3 系統(tǒng)適應(yīng)性試驗(yàn)與專屬性考察 取 “2.2”項(xiàng)下對(duì)照品、供試品、陰性供試品溶液適量，在“2.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定，結(jié)果見圖1。由圖可知，各成分與相鄰色譜峰的分離度均大于1.5，理論塔板數(shù)以各色譜峰計(jì)均大于3 000，陰性無干擾，表明該方法專屬性良好。

2.4 線性關(guān)系考察 精密吸取 “2.2.1”項(xiàng)下對(duì)照品溶液5、 5、 2、3、 2、 1 mL， 置于 5、 10、 5、10、10、10 mL量瓶中，甲醇定容，搖勻，得到6個(gè)不同質(zhì)量濃度溶液，在 “2.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定。以質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo) （X），峰面積為縱坐標(biāo) （Y）進(jìn)行回歸，結(jié)果見表1，可知各成分在各自范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

圖1 各成分HPLC色譜圖Fig.1 HPLC chromatograms of various constituents

表1 各成分線性關(guān)系Tab.1 Linear relationships of various constituents

2.5 精密度試驗(yàn)

2.5.1 日內(nèi)精密度 精密吸取 “2.2.1”項(xiàng)下對(duì)照品溶液10 μL，在 “2.1”項(xiàng)色譜條件下于1 d內(nèi)進(jìn)樣測(cè)定，測(cè)得紅景天苷、黃柏堿、甘草酸銨、延胡索乙素、鹽酸小檗堿、甘草苷峰面積RSD分別為 0.98%、0.77%、1.28%、1.09%、1.79%、1.92%，表明儀器日內(nèi)精密度良好。

2.5.2 日間精密度 精密吸取 “2.2.1”項(xiàng)下對(duì)照品溶液10 μL，在 “2.1” 項(xiàng)色譜條件下于1、2、3、4、5、6 d進(jìn)樣測(cè)定，測(cè)得紅景天苷、黃柏堿、甘草酸銨、延胡索乙素、鹽酸小檗堿、甘草苷峰面積RSD分別為1.22%、0.53%、1.05%、1.12%、2.01%、1.61%，表明儀器日間精密度良好。

2.6 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取樣品 （批號(hào)20180105）適量，按 “2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，于0、3、 6、 9、 12、 18、 24 h在 “2.1” 項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定，測(cè)得紅景天苷、黃柏堿、甘草酸銨、延胡索乙素、鹽酸小檗堿、甘草苷峰面積RSD分別為0.92%、0.81%、1.71%、1.46%、1.73%、1.62%，表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.7 重復(fù)性試驗(yàn) 取樣品 （批號(hào)20180105）6份，按 “2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，在“2.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定，測(cè)得紅景天苷、黃柏堿、甘草酸銨、延胡索乙素、鹽酸小檗堿、甘草苷含有量RSD分別為1.34%、0.67%、1.22%、1.50%、1.29%、1.48%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.8 加樣回收率試驗(yàn) 取含有量已知的樣品 （批號(hào)20180105）適量，研細(xì)，精密稱取0.5 g，共9份，置于具塞錐形瓶中，每3份加入高、中、低質(zhì)量濃度對(duì)照品溶液1 mL，并使其加入量與供試品中成分量的比例分別為1.5∶1、1∶1、0.5∶1，按 “2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，在 “2.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定，計(jì)算回收率。結(jié)果，紅景天苷、黃柏堿、甘草酸銨、延胡索乙素、鹽酸小檗堿、甘草苷平均加樣回收率分別為98.98%、100.03%、99.34%、100.11%、99.00%、100.03%，RSD分 別 為 0.81%、1.35%、0.93%、1.52%、1.30%、1.10%。

2.9 樣品含有量測(cè)定 取3批樣品（批號(hào)20180105、20180109、20180116）適量， 按 “2.2.1” 項(xiàng)下方法制備供試品溶液，在 “2.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定，計(jì)算含有量，結(jié)果見表2。

表2 各成分含有量測(cè)定結(jié)果 （mg／g，n＝3）Tab.2 Results of content determination of various constituents（mg／g， n＝3）

3 討論

3.1 指標(biāo)成分選擇[12-16］本實(shí)驗(yàn)選擇紅景天苷、黃柏堿、甘草酸銨、延胡索乙素、鹽酸小檗堿、甘草苷作為指標(biāo)成分，其藥理活性大多以抗炎、抗菌、抗病毒、改善血液微循環(huán)、鎮(zhèn)痛為主，與治療濕熱瘀結(jié)型盆腔炎性疾病的原則相符，而且均專屬性強(qiáng)、重復(fù)性好。同時(shí)，加味四妙顆粒中薏苡仁、牛膝、蒼術(shù)因指標(biāo)成分不明確、含有量較低、熱穩(wěn)定性較差等因素，未納入本實(shí)驗(yàn)定量測(cè)定中，而是采用TLC法作定性鑒別。另外，方中活性成分綠原酸雖然具有抗菌、抗病毒、抗氧化等藥理作用[17］，但在大血藤、黃柏、蒼術(shù)中均能檢出，不具有專屬性，故也不予考慮。

3.2 檢測(cè)波長選擇 加味四妙顆粒中6種成分的吸收波長差異較大，在單一波長下難以同時(shí)檢測(cè)，而且可能導(dǎo)致極性相似成分的干擾，而波長切換技術(shù)能在不同時(shí)間段切換為待測(cè)組分較佳的吸收波長，從而可在同一色譜圖中有效準(zhǔn)確地顯示出其色譜峰信息。本實(shí)驗(yàn)通過DAD檢測(cè)器對(duì)6種成分進(jìn)行全波長掃描，確定0～25 min時(shí)采用220 nm檢測(cè)紅景天苷和黃柏堿，25～37 min時(shí)采用280 nm檢測(cè)甘草酸銨，37～45 min時(shí)采用220 nm檢測(cè)延胡索乙素，45～60 min時(shí)采用280 nm檢測(cè)鹽酸小檗堿，60～75 min時(shí)采用250 nm檢測(cè)甘草苷，此時(shí)各成分響應(yīng)信號(hào)強(qiáng)而穩(wěn)定，與相鄰峰無干擾。

3.3 供試品溶液制備方法選擇 本實(shí)驗(yàn)對(duì)提取方法 （加熱回流、超聲、索氏、振搖）、溶劑種類（甲醇、乙醇、1%鹽酸甲醇）、溶劑體積分?jǐn)?shù)（40%、60%、80%、100%）、提取時(shí)間 （20、40、60、 80、 100、 120 min）、 液料比 （10 ∶1、 20 ∶1、30∶1、40∶1、50∶1）進(jìn)行考察，發(fā)現(xiàn)提取方法和溶劑種類的影響較大，而溶劑體積分?jǐn)?shù)、提取時(shí)間、液料比的影響較小，同時(shí)考慮到便于操作、節(jié)約溶劑、提高效率等方面，最終采用 “2.1.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液。

4 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)采用HPLC法同時(shí)測(cè)定加味四妙顆粒中紅景天苷、黃柏堿、甘草酸銨、延胡索乙素、鹽酸小檗堿、甘草苷的含有量，該方法簡單可靠，具有較好的精密度、穩(wěn)定性、重復(fù)性，可為其內(nèi)在質(zhì)量的全面控制和評(píng)價(jià)提供科學(xué)依據(jù)。