劉正泰， 劉朝奇， 何毓敏， 張長城， 袁 丁， 袁成福

（三峽大學醫(yī)學院，湖北宜昌 443002）

大量研究顯示[1］，隨著機體老齡化，脂肪組織從皮下轉移到腹部、肌肉、肝臟、骨髓等其他異位位點，其中前脂肪細胞的分化增殖能力也會隨著年齡增長而下降，進而釋放出過多的游離脂肪酸，使機體處于脂毒性狀態(tài)[2］。功能障礙會使前脂肪細胞分泌促炎及趨化因子，招募更多巨噬細胞，其分泌的細胞因子進一步刺激前脂肪細胞釋放游離脂肪酸，加劇機體脂毒性，進而誘導并加劇脂肪組織炎癥[3-4］，然后通過損害正常脂質分布、脂肪組織功能等導致脂毒性增加，細胞應激通路激活，進而引發(fā)胰島素抵抗等多種脂肪組織系統性功能障礙。因此，深入探討衰老致脂肪組織慢性炎癥及其可能機制對老齡化引起的脂肪組織功能障礙及代謝功能障礙具有重要的意義。

竹節(jié)參是五加科人參屬植物竹節(jié)參Panax japnicus C.A.Mey的干燥根莖，其活性成分為竹節(jié)參總皂苷，主要包括竹節(jié)參皂苷Ⅳ、Ⅳa、Ⅴ等[5］，具有降血脂、抗炎等多種藥理活性。課題組前期研究發(fā)現，竹節(jié)參總皂苷具有顯著的抗炎活性[6-10］，但它對衰老致脂肪組織慢性炎癥的影響尚不明確，故本實驗探討該成分對自然衰老大鼠脂肪組織炎癥的改善作用。

1 材料

1.1 動物 SPF級SD雄性大鼠購自三峽大學實驗動物中心，溫度 （22±2）℃，相對濕度 （60±5）%，光照明暗交替，自由飲食，實驗動物生產許可證號 SCXK（鄂）2011-0061。

1.2 試藥 竹節(jié)參采自湖北省恩施竹節(jié)參種植基地，經湖北省天然產物研究與開發(fā)重點實驗室專家鑒定為五加科人參屬植物竹節(jié)參Panax japonicas C.A.Mey的干燥根莖，竹節(jié)參總皂苷的分離純化參照課題組前期報道[11］?？俁NA提取試劑盒 （美國Thermo公司，批號139506）；RNA逆轉錄試劑盒 （日本TaKaRa公司，批號AK4401）；PCR引物由生工生物工程 （上海）股份有限公司提供，見表1；βactin抗體 （貨號 4970 L）、 NF-κΒ 抗體 （貨號 8242 S）、pNF-κB抗體 （貨號3033 S） （美國Cell Signaling公司）；IL-1β抗體 （貨號 ab6671）、 TNF-α抗體 （貨號 ab9722）（美國Abcam公司）；TLR4抗體 （貨號 SC-293072，美國Santa Cruz公司）；相應二抗 （批號125510、125435，武漢科瑞有限公司）；ECL顯影劑 （批號P0018-1，碧云天生物技術研究所）。其余試劑均為分析純。

表1 PCR引物序列

1.3 儀器 TP1020脫水儀、EG1105H包埋機、Ultracut-R超薄切片機、DMR多功能顯微鏡 （德國Leica公司）；PowerPacTMBasic電泳儀、T100TMThermal Cycler PCR熱循環(huán)儀（美國Bio-Rad公司）；Gene Genius凝膠系統 （英國Syngne公司）。

2 方法

2.1 動物分組及給藥 將48只2月齡SPF級SD大鼠分成自然衰老組及竹節(jié)參總皂苷低、中、高劑量組 （10、30、60 mg／kg），每組12只，待喂養(yǎng)至18月齡后，再取12只2月齡SPF級SD大鼠同時喂養(yǎng)4個月，作為正常對照組。竹節(jié)參總皂苷組大鼠從18月齡開始給藥，至22月齡止，每星期停藥1 d。給藥結束后，實驗前12 h大鼠禁食不禁水，10%水合氯醛麻醉處死，小心取新鮮附睪脂肪組織，過液氮，迅速保存于-80℃低溫冰箱中。

2.2 附睪脂肪HE染色 大鼠處死后，切取全部附睪脂肪并稱定質量，生理鹽水沖洗，切取厚度適中、呈片狀者，固定、脫水、石蠟包埋后切片，厚度為6 μm。切片經脫蠟復水后，蘇木精染3 min，流水沖30 min，伊紅染30 s，梯度酒精脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片，顯微鏡下觀察并取圖。

2.3 IL-1β、 TNF-α、 MCP-1、 IL-6 mRNA 表達檢測 采用RT-PCR法。取附睪脂肪200～300 mg于1.5 mL EP管中，加 150 μL TRIzol研磨至一定程度后補加850 μL TRIzol， 輕輕混勻，冰上靜置5 min，4℃ 12 000 r／min離心10 min；取上清，加三氯甲烷及DEPC水，各占上清體積的1／5，劇烈搖晃15 s，冰上放置 5 min，4℃、12 000 r／min離心15 min，吸取上清無色溶液，加入等量異丙醇，上下混勻，于-20℃放置15～30 min， 4℃、 12 000 r／min離心10 min，倒掉上清，加入1 mL 75%乙醇，移液槍輕輕吹取沉淀，4℃、7 500 r／min離心5～10 min，吸走上清，室溫下晾干，即得RNA，按試劑盒說明書進行逆轉錄，得cDNA。PCR反應體系總體積為10 μL [雙蒸水3.5 μL，PCR Master mix（2x） 5 μL， IL-1β、 TNF-α、 MCP-1、 IL-6、 上下游引物各0.5 μL， cDNA模板0.5 μL］， 以 GAPDH 為內參， 擴增條件為95℃ 5 min；95℃ 30 s，58℃ 30 s，72℃ 1 min GOTO2，35次；72℃ 5 min，4℃下低溫保存。PCR產物經電泳后凝膠成像儀拍照取圖，檢測mRNA表達，Image-Pro-Plus 6.0軟件進行分析。

2.4 IL-1β、 TNF-α、 TLR4、 NF-κB、 pNF-κB 蛋白表達檢測 采用Western blot法。將組織于冰上研磨1～2 min，渦旋后3 000 r／min離心1 min，去除上清液，重復3次至上清近無色，去上清，加適量RIPA裂解液、PMSF及磷酸蛋白酶抑制劑A、B（100∶1∶1∶1），組織于冰上研磨1～2 min， 4℃、 12 000 r／min離心15 min， 取上清加入1／5上清體積的蛋白質Loading buffer，100℃下煮沸10 min，蛋白樣品于-80℃下保存，電泳分離后轉至PVDF膜，5%牛奶封閉1 h，一抗4℃孵育過夜，TBST洗滌3次，二抗室溫下孵育 1 h，TBST洗滌 3次，ECL顯色，Image-Pro-Plus 6.0軟件進行分析。

2.5 統計學分析 通過SPSS 18.0軟件進行處理，數據用s）表示，各組樣本間均數比較采用單因素方差分析，RT-PCR、Western blot數據均采用Image-Pro-Plus 6.0軟件進行分析，P＜0.05表示差異有統計學意義。

3 結果

3.1 竹節(jié)參總皂苷對脂肪組織HE染色的影響 圖1顯示，正常對照組脂肪細胞排列緊密，大體呈圓形，大小均一；與正常對照組比較，自然衰老組脂肪細胞結構紊亂、大小不均、排列散亂，巨噬細胞細胞浸潤顯著增加 （P＜0.05）；與自然衰老組比較，竹節(jié)參總皂苷組可顯著減少衰老致炎性細胞浸潤 （P＜0.05），細胞形態(tài)有所改善。

圖1 各組脂肪組織HE染色 （×200）

3.2 竹節(jié)參總皂苷對 IL-1β、TNF-α、MCP-1、IL-6 mRNA表達的影響 圖2顯示，與正常對照組比較，自然衰老組IL-1β、 TNF-α、 MCP-1、 IL-6 mRNA 表達顯著增加 （P＜0.05）；與自然衰老組比較，竹節(jié)參總皂苷中、高劑量組四者mRNA表達顯著降低 （P＜0.05）。

3.3 竹節(jié)參總皂苷對IL-1β、TNF-α蛋白表達的影響 圖3顯示，與正常對照組比較，自然衰老組IL-1β、TNF-α蛋白表達顯著上調 （P＜0.01）；與自然衰老組比較，竹節(jié)參總皂苷組兩者蛋白表達顯著下調 （P＜0.05）。

3.4 竹節(jié)參總皂苷對TLR4蛋白表達的影響 圖4顯示，與正常對照組比較，自然衰老組TLR4蛋白表達顯著上升（P＜0.01）；與自然衰老組比較，竹節(jié)參總皂苷組其蛋白表達顯著下調 （P＜0.05）。

3.5 竹節(jié)參總皂苷對pNF-κB蛋白表達的影響 圖5顯示，與正常對照組比較，自然衰老組pNF-κB蛋白表達顯著上升 （P＜0.01）；與自然衰老組比較，竹節(jié)參總皂苷組其蛋白表達顯著降低 （P＜0.05）。

4 討論

衰老一般是生物體隨著時間的推移，機體各組織持續(xù)處在慢性、低度的炎癥狀態(tài)，進而引發(fā)機體功能障礙[12］。脂肪組織是人體內重要的內分泌器官，在年齡相關的代謝功能障礙和長壽中起著關鍵作用[13］，衰老會促使脂肪細胞肥大和死亡，這類脂肪細胞會招募血液中的單核細胞浸潤至脂肪組織并分化成巨噬細胞；脂肪組織內促炎型巨噬細胞通過分泌MCP-1等炎癥因子進一步招募巨噬細胞浸潤至脂肪組織，通過圍繞并吞噬死亡或垂死的脂肪細胞形成非常典型的牙套狀結構，這種典型的冠狀結構被用于量化脂肪組織炎癥水平；脂肪組織內部固有的巨噬細胞會從抑炎型 （M2）向促炎型 （M1）轉變，從而加劇脂肪組織慢性炎癥。Lumeng等[14］發(fā)現，在衰老機體中脂肪組織巨噬細胞會從M2型向M1型轉變，促炎型巨噬細胞在衰老大鼠的脂肪組織中聚集，并分泌IL-6、MCP-1等細胞因子，加劇炎癥反應；本實驗經HE染色發(fā)現，與正常對照組比較，自然衰老組大鼠脂肪組織細胞排列紊亂，大量出現巨噬細胞浸潤致牙套狀結構；竹節(jié)參總皂苷可明顯改善其病變情況，脂肪組織排列趨近整齊，因巨噬細胞浸潤所形成的牙套狀結構明顯減少，表明該成分可減少衰老大鼠中的巨噬細胞浸潤，改善細胞形態(tài)。

圖2 竹節(jié)參總皂苷對 IL-1β、TNF-α、MCP-1、IL-6 mRNA表達的影響

圖3 竹節(jié)參總皂苷對IL-1β、TNF-α蛋白表達的影響

圖4 竹節(jié)參總皂苷對TLR4蛋白表達的影響

圖5 竹節(jié)參總皂苷對pNF-κB蛋白表達的影響

在衰老過程中，機體內大量脂肪組織重新分布，從皮下向腹部內臟、肝臟、骨骼肌等其他異位位點轉移，脂肪在內臟等非皮下部位沉積時，會引起脂肪組織功能失調，增加了機體代謝性炎癥發(fā)生的風險[15］。在脂肪細胞分化及表型維持過程中，PPARr家族、C／EBPs家族、抗生脂因子抑制劑具有重要作用。研究表明[16］與年輕個體比較，衰老大鼠C／EBP-α等關鍵的生脂轉錄因子生成顯著減少，CUGBP、TNF-α表達增多，其中后者可增加前體脂肪細胞中前者活性和CHOP表達，而且CHOP還可抑制脂肪形成，上述變化導致衰老個體中前脂肪細胞增殖、分化能力降低。功能障礙的前脂肪細胞使機體處于游離脂肪酸過多的脂毒性狀態(tài)，進而引發(fā)并加劇脂肪組織慢性炎癥。

課題組前期發(fā)現，竹節(jié)參具有良好的抗炎活性，具有降血脂、改善心血管疾病、抗病毒增強免疫力的作用，并在體內外多個水平予以證實[6-10］。本實驗顯示，與正常對照組比較，衰老大鼠脂肪組織IL-6、MCP-1、TNF-α、IL-1β mRNA表達，以及 TNF-α、IL-1β蛋白表達顯著升高，其中MCP-1可進一步促使血液中單核細胞浸潤至脂肪組織，分化為促炎性巨噬細胞；TNF-α能作用于TNF-α受體，再次活化 NF-κB通路；IL-6可激活 JNK、ERK1／2，誘導IRS-1 Ser磷酸化，降低IRS-1表達，引發(fā)胰島素抵抗，從而進一步加劇衰老個體脂肪組織的慢性炎癥，而竹節(jié)參總皂苷干預后上述炎性因子表達均顯著下降，并呈劑量依賴性，表明該成分可改善衰老致脂肪組織慢性炎癥。

雖然關于衰老致脂肪組織慢性炎癥的具體分子機制尚不明確，但大量研究表明衰老致游離脂肪酸過多可能激活TLR4／NF-κB炎癥通路，從而引發(fā)或加劇脂肪組織炎癥。Suganami等[17］經體外實驗發(fā)現，飽和脂肪酸對3T3-L1細胞進行預處理后，脂肪細胞大量表達炎性因子，如MCP-1、TNF-α、IL-6；有研究顯示[18］，飽和游離脂肪酸處理TLR4缺失小鼠-異常的脂肪組織產生的游離脂肪酸等內源性配體結合，激活 NF-κB炎癥通路，促使 IL-6、MCP-1、TNF-α、IL-1β等炎癥因子表達升高。本實驗顯示，衰老大鼠脂肪組織TLR4、pNF-κB蛋白表達顯著上調，表明衰老大鼠脂肪組織中TLR4／NF-κB炎癥通路被激活，而竹節(jié)參總皂苷干預后兩者蛋白表達顯著下調，表明該成分可抑制TLR4表達，降低NF-κB磷酸化，從而改善衰老大鼠脂肪組織炎癥。

綜上所述，竹節(jié)參總皂苷對衰老大鼠脂肪組織損傷有改善作用，其機制可能與減少脂肪組織巨噬細胞浸潤及游離脂肪酸致TLR4蛋白表達、抑制NF-κB通路激活有關。