馬冬梅 黃樟翰 朱華平 謝 駿

(中國水產(chǎn)科學(xué)研究院珠江水產(chǎn)研究所 農(nóng)業(yè)農(nóng)村部熱帶亞熱帶水產(chǎn)資源利用與養(yǎng)殖重點實驗室 廣州 510380)

禾花魚泛指在華南地區(qū)稻田養(yǎng)殖的溫水性鯉魚(Cyprinus carpio)，因為魚食禾花后，魚肉具有禾花香味而得名。稻田養(yǎng)殖鯉魚這種稻魚共生的農(nóng)業(yè)生產(chǎn)模式在我國具有悠久的歷史和文化傳承，稻漁產(chǎn)業(yè)化水產(chǎn)養(yǎng)殖是具有穩(wěn)糧、促漁、增收、提質(zhì)、環(huán)境友好、發(fā)展可持續(xù)等多種生態(tài)系統(tǒng)功能的稻、漁結(jié)合的種養(yǎng)模式(馬達文等,2016; Xieet al,2011)。稻田養(yǎng)魚模式在保護環(huán)境和保證水稻增產(chǎn)的同時，增加了水產(chǎn)養(yǎng)殖的產(chǎn)量，是目前水產(chǎn)養(yǎng)殖的研究熱點之一(Huet al,2013)。廣東地區(qū)的禾花魚養(yǎng)殖業(yè)已成為發(fā)展農(nóng)村經(jīng)濟的一條重要途徑，但對目前廣東地區(qū)禾花魚的形態(tài)學(xué)研究和種質(zhì)調(diào)查才剛剛起步。根據(jù)廣東省乳源瑤族自治縣養(yǎng)殖戶反映，當?shù)氐暮袒~養(yǎng)殖品種形態(tài)變異大，品種混雜，其中的‘石鯉'體型為典型的團圓體型，而‘柴鯉'為典型的長體型。分析其原因，一方面可能是經(jīng)過長期的養(yǎng)殖馴化過程，不同地區(qū)的鯉魚因受到不同的自然環(huán)境的選擇和人工選擇，在遺傳和形態(tài)上已發(fā)生了不同方向的分化(Xuet al,2014)。另一方面，可能是因為不同鯉魚種內(nèi)(劉淑琴等,1990)和種間(謝洪民,1985)的雜交，導(dǎo)致鯉魚養(yǎng)殖品種非?；祀s，形態(tài)各異。

在自然界中，生物體的形態(tài)特征是生物體的遺傳結(jié)構(gòu)與生活環(huán)境長期相互作用的結(jié)果，是物種多樣性最直觀的表現(xiàn)形式(Endler,1986; 顧志敏等,2008)。而在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中的生物種群會在自然環(huán)境和人工選擇壓力下形成明顯不同于自然生態(tài)系統(tǒng)的種群或者類群(Hall,2004; Clutton-Brock,1999)。無論是在自然生態(tài)系統(tǒng)中，還是農(nóng)業(yè)生產(chǎn)系統(tǒng)中，魚類形態(tài)特征的變化與生理機能和生活習(xí)性的變化相比，更為具體、易于比較觀察，是魚類分類學(xué)的重要依據(jù)(曹文宣等,1981)。魚類形態(tài)特征中的可數(shù)可量性狀不僅是魚類分類的依據(jù)，也是魚類人工選擇育種時的基本選擇指標，即優(yōu)良品種選擇時的重要依據(jù)(閆學(xué)春等,2007)。所以，對魚類形態(tài)學(xué)的研究是經(jīng)濟魚類研究的基礎(chǔ)。 以世代生活在廣東地區(qū)的稻魚養(yǎng)殖系統(tǒng)中的禾花魚為研究對象，將傳統(tǒng)的形態(tài)學(xué)研究方法與幾何形態(tài)學(xué)研究方法相結(jié)合，分析具有代表性的稻田養(yǎng)殖禾花魚的形態(tài)學(xué)特征，并與其他鯉魚品系的形態(tài)學(xué)分析數(shù)據(jù)進行比較。同時，通過對禾花魚線粒體COⅡ基因序列的擴增與分析，確定廣東粵北地區(qū)稻田養(yǎng)殖禾花魚在遺傳學(xué)上的分類地位。

1 材料與方法

1.1 實驗魚

實驗用禾花魚取自廣東省韶關(guān)乳源瑤族自治縣的稻田養(yǎng)魚基地，為當年的禾花魚魚苗，在魚苗長至平均全長約為5 cm時放入稻田中進行養(yǎng)殖，養(yǎng)殖期為5個月，期間不投喂人工配合飼料，僅以稻田中的雜草、田螺和昆蟲等天然餌料為食。

1.2 形態(tài)觀察與測量

從稻田里隨機取67尾體重在10 g以上的禾花魚，用麻醉劑麻醉后，快速測量體寬WB(Body width)，并用相機拍照，將照片導(dǎo)入本研究室自主研制開發(fā)的魚類外部形態(tài)測量軟件1.0，測量每尾魚的全長LT(Total length)、體長LS(Soma length)、體高DB(Body depth)、頭長LH(Head length)、頭高HH(Head height)、吻長LM(Snout length)、眼徑DE(Eye diameter)、尾柄長LCP(Length of caudal peduncle)、尾柄高DCP(Depth of caudal peduncle)和尾鰭長LC(Caudal fin length)共11個生長性狀。同時，取鰭條放入無水乙醇中，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 數(shù)量性狀分析和統(tǒng)計

在對上述測量的生長性狀進行統(tǒng)計時，為消除由于魚的體型大小不同而引起的對數(shù)據(jù)可靠性的影響，分析時用頭部形態(tài)測量值除以頭長，尾部形態(tài)測量值除以尾柄高，分別計算頭高/頭長(HH/LH)、吻長/頭長(LM/LH)、眼徑/頭長(DE/LH)、尾柄高/尾柄長(DCP/LCP)、尾鰭長/尾柄長(LC/LCP)，其他的形態(tài)測量值除以體長，如全長/體長(LT/LS)、頭長/體長(LH/LS)、體高/體長(DB/LS)、體寬/體長(WB/LS)、尾柄長/體長(LCP/LS)。

采用Microsoft Excel軟件分析禾花魚的形態(tài)測量數(shù)據(jù)及其比值，然后使用SPSS 11.0對10個比值進行單因素方差分析(One-way ANOVA)、主成分分析和聚類判別分析(張文彤,2002)。

1.4 禾花魚與其他6種鯉魚形態(tài)學(xué)比較分析

按照郭梁等(2017)的方法從CNKI數(shù)據(jù)庫(http:// www.cnki.net)中查找鯉屬(Cyprinus)魚類的生長性狀測量值，用取平均值的方法將不同文獻所報道的同種魚的相同部位形態(tài)測量數(shù)據(jù)進行合并，去掉測量部位數(shù)據(jù)少的品種，得到黃河鯉(Cyprinus carpio)、荷包紅鯉(C.carpiovar.wuyuannensis)、興國紅鯉(C.carpiovar.Xingguonensis)、建鯉(C.carpiovar.Jian)、鏡鯉(C.carpiovar.specularis)和甌江彩鯉(C.carpiovar.color) 6種鯉魚的7個生長形態(tài)性狀比值：全長/體長(LT/LS)、體高/體長(DB/LS)、體寬/體長(WB/LS)、尾柄高/尾柄長(DCP/LCP)、頭長/體長(LH/LS)、頭高/頭長(HH/LH)和眼徑/頭長(DE/LH)(表1)。統(tǒng)計分析方法參照1.3。

1.5 利用COⅡ基因分析禾花魚的進化地位

根據(jù)鯉的線粒體上的細胞色素氧化酶亞基Ⅱ(Cytochrome oxidase subunit Ⅱ,COⅡ)基因序列(序列號: JN105352.1)設(shè)計引物，引物序列為：COⅡ F：5′-TAATGGCACACCCAACGCAAC-3′，COⅡ R：5′-AGCTTCCTAGCGAGGCGTCTT-3′，由金唯智生物科技公司合成(蘇州)。禾花魚鰭條基因組DNA的提取采用天根生化科技(北京)有限公司的“血液/細胞/組織基因組DNA提取試劑盒”，具體方法參考試劑盒說明書。用0.8%的瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA的完整性和純度，-20℃保存?zhèn)溆?。PCR擴增禾花魚COⅡ基因，PCR產(chǎn)物在ABI 3500全自動測序儀上進行測序，測序結(jié)果用ClustalW軟件進行比較分析。統(tǒng)計38尾禾花魚COⅡ基因序列，將數(shù)目最多的TA基因型COⅡ基因序列與鯉科(Cyprinidae)鯉屬鯉種的5個群體(建鯉COⅡ基因序列未見報道)，如黃河鯉(KU050703.1)、興國紅鯉(KU146530.1)、鏡鯉(KU146531.1)、荷包紅鯉(KF856964.1)和甌江彩鯉(KP993136.1)及鯉科鯉屬的三角鯉(Cyprinus multitaeniata)(KU373073.1)和鯉科Danio屬的斑馬魚(Danio rerio)(KM244705.1) COⅡ基因序列進行比對，再用Mega 7.0軟件，采用最大似然法構(gòu)建進化樹，并用Bootstrap法進行檢驗，參數(shù)設(shè)置為999次。

表1 6種鯉魚的7個形態(tài)性狀比值平均值 Tab.1 The mean values of seven morphological characteristics from six common carp populations

2 結(jié)果與分析

2.1 稻田養(yǎng)殖禾花魚的形態(tài)觀察與數(shù)據(jù)測量

目前，廣東地區(qū)典型的稻田養(yǎng)殖禾花魚體型從長而側(cè)扁到團而體厚的均可見。魚體顏色各異，有些個體魚體背部為青灰色，有些個體魚通體為金紅色，有些個體魚體背部為淺灰色，鰭為淺灰色略帶紅色或鰭為黃色桔黃至淺黃色。隨機取67尾禾花魚進行測量，體重范圍為10～44 g，變化范圍較大。計算其測量數(shù)據(jù)的平均值及方差(表2)。

2.2 稻田養(yǎng)殖禾花魚形態(tài)的聚類分析

根據(jù)67尾禾花魚的頭高/頭長(HH/LH)、吻長/頭長(LM/LH)、眼徑/頭長(DE/LH)、尾柄高/尾柄長(DCP/LCP)、尾鰭長/尾柄長(LC/LCP)、全長/體長(LT/LS)、頭長/體長(LH/LS)、體高/體長(DB/LS)、體寬/體長(WB/LS)和尾柄長/體長(LCP/LS)10個形態(tài)學(xué)比例指標，用SPSS 11.0軟件進行聚類分析表明，67尾鯉魚可以分為體型偏向修長型和偏向團圓型兩大類。

2.3 稻田養(yǎng)殖禾花魚形態(tài)的主成分分析

對同一稻田養(yǎng)殖環(huán)境的67尾禾花魚的10個形態(tài)學(xué)比例指標進行主成分分析，得到3個主成分，累積貢獻率為73.5%，基本可以反映綜合指標所概括的信息，每個比例性狀在各主成分的載荷量見表3。第1主成分中起最主要作用的是尾柄高/尾柄長和尾鰭長/尾柄長，可以解釋為魚體的尾部特征；第2主成分中起主要作用的是頭高/頭長、吻長/頭長和眼徑/頭長，可以解釋為魚體的頭部特征；第3主成分中起主要作用的是頭高/頭長和體高/體長，也可以解釋為魚體的總體特征。

將上述聚類分析得到的體型偏向修長型和偏向團圓型2組魚每個個體的主成分值繪制散點圖(圖2)，在第1主成分上，2組體型不同的禾花魚區(qū)分明顯，在尾柄高/尾柄長、尾鰭長/尾柄長和體高/體長這3個 比值中，偏長體型組魚的平均值分別為0.78、1.57和0.37，偏團圓體型組魚的平均值為1.07、2.08和0.44，均呈極顯著差異(P＜0.01)；在第2主成分上，2組體型不同的禾花魚部分重合，區(qū)分不明顯，在頭高/頭長、吻長/頭長和眼徑/頭長3個比值中，偏長體型組魚的平均值分別為0.85、0.27和0.25，偏團圓體型組魚的平均值為0.86、0.31和0.23，除吻長/頭長值有顯著差異(P＜0.05)外，頭高/頭長和和眼徑/頭長值無顯著差異(P＞0.05)；在第3主成分上，2組體型不同的禾花魚完全重合，頭高/頭長在2組禾花魚中無顯著差異。

表2 禾花魚的形態(tài)測量平均值及其標準差 Tab.2 The mean value and standard deviation of the morphological traits of rice flower carp

圖1 同一禾花魚群體內(nèi)不同個體的形態(tài)聚類關(guān)系 Fig.1 Cluster analysis of the common carp individuals cultured in paddy field according to morphological characteristics

表3 禾花魚10個形態(tài)特征變量的主成分載荷 Tab.3 Loading of principal components(PC) for 10 morphometric characteristics of rice flower carp

圖2 禾花魚依據(jù)形態(tài)特征數(shù)據(jù)分組后的主成分分析散點圖 Fig.2 Scatter diagram for the principal component analysis of the rice flower carps grouped according to morphological characteristics

2.4 稻田養(yǎng)殖禾花魚與其他幾種鯉魚的形態(tài)比較分析

用可以查詢到的6種鯉魚的7個生長性狀比值，與偏長體型和偏團圓體型2組禾花魚各自相對應(yīng)的生長性狀比值的平均值進行主成分分析，結(jié)果見表4。得到2個主成分，其累積貢獻率為82.7%，主成分分析結(jié)果基本可反映綜合指標所隱含的信息，第1主成分中起主要作用的是體高/體長和尾柄高/尾柄長，以及頭長/體長、體寬/體長和全長/體長，可解釋為魚體的總體體型特征；第2主成分中起主要作用的是頭高/ 頭長，可解釋為魚體的頭部特征。

表4 2種體型禾花魚與其他6種鯉魚7個形態(tài)特征變量的主成分載荷 Tab.4 Loading of principal components(PC) for 7 morphometric characteristics of rice flower carp and other six common carp populations

從依據(jù)第1主成分和第2主成分繪制的散點圖(圖3)可以看出，無論是長體型禾花魚還是團圓體型禾花魚的主成分值均介于興國紅鯉和荷包紅鯉之間，且在第1主成分上，長體型禾花魚與興國紅鯉、鏡鯉和建鯉聚在一起，而與和甌江彩鯉和荷包紅鯉聚在一起的團圓體型禾花魚區(qū)分開；在第2主成分上，長體型禾花魚與團圓體型禾花魚聚在一起，再與荷包紅鯉、興國紅鯉、建鯉和黃河鯉聚在一起，而與鏡鯉和歐江彩鯉區(qū)分開。

圖3 2種體型禾花魚與其他6種鯉魚7個生長性狀 比值的第1主成分、第2主成分散點圖 Fig.3 Scatter plot of PC1 versus PC2 extracted from 7 morphometric characteristics of rice flower carp with two shapes and another six common carp populations

將2.1中聚類分析得到的偏長體型組魚和偏團圓體型組魚生長性狀比值的平均值與6種其他鯉魚的生長性狀比值進行聚類分析，結(jié)果表明，偏長體型禾花魚與興國紅鯉聚合在一起，再與鏡鯉聚合在一起，再與黃河鯉、建鯉聚為一支，荷包紅鯉與甌江彩鯉聚為另一支，偏團圓體型的禾花魚介于兩支之間(圖4)。

2.5 禾花魚線粒體COⅡ基因的克隆與進化分析

對測序得到的38尾禾花魚的COⅡ基因(606 bp，圖5)進行比較，結(jié)果表明，僅有2個多態(tài)位點，一個位于+31，為顛換位點A-T(4：34)，另一個位于+597，為轉(zhuǎn)換位點A-G(28：10)，共4種基因型(AA∶AG∶TG∶TA=3∶1∶9∶25)，其中，TA基因型個體數(shù)目最多，占總數(shù)的65.8%，而多態(tài)位點數(shù)僅占序列長度的0.33%。經(jīng)分析，這4種基因型與體型特征之間沒有對應(yīng)關(guān)系，不能區(qū)分長體型禾花魚和團圓體型禾花魚。

用TA基因型禾花魚COⅡ部分基因序列與7種已知的鯉科魚類COⅡ基因序列進行比對，結(jié)果表明，禾花魚與鯉科鯉屬的5種魚COⅡ基因同源性均在99%以上，與斑馬魚COⅡ基因的同源性僅為79%。從構(gòu)建的進化樹可以看出(圖6)，禾花魚與荷包紅鯉的COⅡ基因同源性最高，其次為興國紅鯉，而斑馬 魚COⅡ基因是聚類分析的外群，可以確定禾花魚為鯉屬鯉種的一個群體。

圖4 2種體型的禾花魚與其他6種鯉魚的形態(tài)學(xué)聚類分析 Fig.4 Dendrogram of rice flower carps with two shapes and another six common carp populations by cluster analysis

圖5 禾花魚的COⅡ基因部分序列 Fig.5 The partial sequence of COⅡ gene from rice flower carp 加粗字表示多態(tài)位點 Bold shows the polymorphic sites

圖6 禾花魚和7種鯉科魚的COⅡ基因進化樹分析 Fig.6 Phylogenetic tree of COⅡ genes from rice flower carp and seven carp populations within Cyprinidae

3 討論

廣東粵北地區(qū)養(yǎng)殖戶反映目前禾花魚養(yǎng)殖品種形態(tài)變異大，其中，團圓體型的“石鯉”在稻田養(yǎng)殖過程中不易逃走，而且肉厚、骨軟、成活率高，而長體型的“柴鯉”易逃走，且肉少、骨硬、成活率低。為了進一步對該禾花魚養(yǎng)殖品種進行選育，本研究用形態(tài)學(xué)統(tǒng)計聚類分析的描述方法，將禾花魚依據(jù)形態(tài)分為體型偏團圓型和偏修長型兩大類，并揭示了兩類禾花魚的形態(tài)差異主要表現(xiàn)在尾柄高/尾柄長、尾鰭長/尾柄長和體高/體長這3個比例性狀上。而這3個比例性狀，特別是“體高/體長和尾柄高/尾柄長”，是鯉魚選育的重要考量指標，如對荷元鯉的選育研究表明，荷元鯉的體長/體高為2.35～2.55之間，可獲得單位體長的最好增重效果(Maet al,1981; 張建森,1985)。對廣東地區(qū)傳統(tǒng)稻田養(yǎng)殖禾花魚生長形態(tài)學(xué)的統(tǒng)計、描述和分類，可為禾花魚的下一步選育工作奠定形態(tài)學(xué)研究基礎(chǔ)。

禾花魚在養(yǎng)殖過程中沒有投喂人工餌料，所以，生長較為緩慢，在形態(tài)數(shù)據(jù)測定時，其個體體重僅在10～44 g范圍內(nèi)，而與其相比較的其他種類的鯉魚規(guī)格在100 g以上(鄭水平等,1998; 明俊超等,2009)，有些甚至達到2 kg(郭梁等,2017)。有研究表明，不同生長階段、雌雄差異、飼料和養(yǎng)殖環(huán)境等都會對魚類的形態(tài)特征產(chǎn)生影響(王蘭梅等,2017; 岳亮等,2016; 沈偉良等,2017)。但從本研究對禾花魚的形態(tài)數(shù)據(jù)聚類分析結(jié)果可以看出，興國紅鯉、荷包紅鯉、鏡鯉、黃河鯉和建鯉的聚合分析結(jié)果與之前的鯉魚形態(tài)聚類結(jié)果相吻合(明俊超等,2009; 郭梁等,2017)。長體型禾花魚與興國紅鯉、鏡鯉、黃河鯉、建鯉聚合在一起，而荷包紅鯉與甌江彩鯉聚在一起，偏團圓體型的禾花魚的形態(tài)性狀處于長體型鯉與團圓體型鯉的中間類型。分析結(jié)果與觀察得到的結(jié)果相似，說明禾花魚1齡前已顯示出初步的形態(tài)特征，與其他鯉魚品種進行形態(tài)比較結(jié)果較為準確，可為其他規(guī)格差異較大種群形態(tài)學(xué)比較研究提供參考依據(jù)。另外，從目前的研究結(jié)果可以看出，粵北地區(qū)的偏團圓體型的禾花魚形態(tài)與荷元鯉的形態(tài)相似，但對荷元鯉的形態(tài)學(xué)研究數(shù)據(jù)不足，限制了禾花魚與其進行比較(Maet al,1981; 張建森,1985)。此外，對另2種稻田養(yǎng)殖鯉魚——“青田稻田魚”和“從江稻田魚”的形態(tài)學(xué)聚類分析發(fā)現(xiàn)，這2種田魚在形態(tài)上已明顯區(qū)別于興國紅鯉、黃河鯉和建鯉等8種鯉魚種群(郭梁等,2017)。而本研究中的稻田養(yǎng)殖禾花魚形態(tài)學(xué)聚類分析表明，禾花魚的形態(tài)仍具有明顯的鯉魚特征，雖然已經(jīng)過多年的傳統(tǒng)稻田養(yǎng)殖，但還不能從形態(tài)上將其從鯉魚群體中區(qū)分出來。從上述比較結(jié)果還可以看出，目前，廣東地區(qū)禾花魚品種較為混雜，需要以形態(tài)學(xué)為基礎(chǔ)，進一步建立家系進行選育。

稻田養(yǎng)殖鯉魚在不同地區(qū)的品種有所不同，包括很多個地方種，如廣東地區(qū)主要養(yǎng)殖的禾花魚為華南鯉(Cyprinus carpio rubrofuscus)，廣西地區(qū)主要養(yǎng)殖的禾花魚為烏鯉(Procypris merus)等。COⅡ基因作為鯉魚品種的遺傳標記已有大量的報道，包括25種鯉科魚類(凌去非等,2006)、中國紅鯉(Cyprinus flammans)(王成輝等,2004)、甌江彩鯉(呂耀平等,2009)及錦鯉(Cyprinus carpio)、甌江彩鯉和長鰭鯉(Cyprinocirrhites polyactis)之間的親緣關(guān)系(Wanget al,2004)。在上述研究的基礎(chǔ)上，本研究對禾花魚的COⅡ基因序列進行了分析，確定了禾花魚為鯉科、鯉屬、鯉種的一個群體。在研究5種體色20尾甌江彩鯉COⅡ基因(604 bp)中發(fā)現(xiàn)，多態(tài)位點百分率為1.49%，而本研究38尾禾花魚的COⅡ基因(606 bp)多態(tài)位點僅占0.33%，遠低于鯉魚種間3.79%的水平(呂耀平等,2009)。雖然禾花魚體型差異較大，但根據(jù)COⅡ基因多樣性的判別，遠沒有達到種間的水平。

本研究對粵北地區(qū)典型稻田養(yǎng)殖基地的禾花魚進行了形態(tài)學(xué)分析和初步的遺傳學(xué)分析，用科學(xué)的方法闡釋了生產(chǎn)實踐觀察到的禾花魚形態(tài)多樣性豐富的現(xiàn)象，根據(jù)測量數(shù)據(jù)對2種體型的禾花魚進行了分類，并用分子手段確定了地方養(yǎng)殖品種的分類地位，為禾花魚接下來的育種工作奠定了基礎(chǔ)。