王雙艷 王 磊 陳張帆 崔忠凱 周 茜 陳松林①

(1.青島海洋科學(xué)與技術(shù)試點國家實驗室海洋漁業(yè)科學(xué)與食物產(chǎn)出過程功能實驗室 農(nóng)業(yè)農(nóng)村部海洋漁業(yè)可持續(xù)發(fā)展 重點實驗室 中國水產(chǎn)科學(xué)研究院黃海水產(chǎn)研究所 青島 266071；2.上海海洋大學(xué)水產(chǎn)與生命學(xué)院 上海 201306)

多聚免疫球蛋白受體pIgR(Polymeric immune- globulin receptor)是Ⅰ型跨膜糖蛋白，屬于免疫球蛋白超家族的一員，在動物黏膜相關(guān)淋巴組織中結(jié)合并介導(dǎo)分泌型抗體跨過上皮細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)運，經(jīng)酶切后以復(fù)合物的形式分泌到黏膜表面，抑制病原微生物的粘附和入侵，在先天性免疫與獲得性免疫中均具有重要作用(Phaliponet al,2003; Kaetzel,2005)。哺乳動物的pIgR蛋白包含5個免疫球蛋白功能域(Ig-like domains,ILD)，可以與二聚體IgA或者四聚體IgM結(jié)合，兩棲動物和鳥類的pIgR蛋白包含4個ILD，分別與哺乳動物的第1、3、4和5個ILD同源(Piskurichet al,1995; Wielandet al,2004)。

目前，在紅鰭東方鲀(Takifugu rubripes)(Hamuroet al,2007)、鯉魚(Cyprinus carpio)(Romboutet al,2008)、草魚(Ctenopharynodon idellus)(張毅,2016)、牙鲆(Paralichthy solivaceus)(Xuet al,2013)、斜帶石斑魚(Epinephelus coioides)(Fenget al,2009)、虹鱒(Oncorhynchus mykiss)(Zhanget al,2010)、大菱鲆(Scophthalmus maximus)(丁冰潔等,2013)、鯽魚(Carassius auratus)(Wanget al,2017)等硬骨魚類中均克隆得到了pIgR基因。結(jié)構(gòu)分析表明，硬骨魚pIgR蛋白僅有2個ILD，分別與哺乳動物的ILD1和ILD5同源。因此，研究魚類pIgR對于了解生物進(jìn)化過程具有重要意義。魚類pIgR也具有和哺乳動物pIgR類似的轉(zhuǎn)運功能，顯示了生物進(jìn)化的嚴(yán)謹(jǐn)性和保守性。最新的研究發(fā)現(xiàn)，在硬骨魚中存在一種新型的免疫球蛋白IgT。對虹鱒的研究發(fā)現(xiàn)，pIgR僅能與腸道IgT結(jié)合，而不能與血液IgT結(jié)合(Zhanget al,2010)，提示硬骨魚pIgR的功能仍有很多未知之謎。

半滑舌鰨(Cynoglossus semilaevis)是我國重要的海水經(jīng)濟(jì)養(yǎng)殖魚類，由于其肉質(zhì)鮮美滑嫩、營養(yǎng)價值高、生長快速等特點而深受人們喜愛。隨著養(yǎng)殖數(shù)量的增多，病害的威脅也日趨嚴(yán)重，尤其是細(xì)菌引起的潰爛癥、腸炎癥最為嚴(yán)重，給養(yǎng)殖業(yè)帶來了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。同時，半滑舌鰨是一種底棲魚類，腹部摩擦底面，特別容易受到損傷，在水環(huán)境中黏膜包被的皮膚、鰓、腸等是病原侵襲的主要部位，黏膜不僅僅是物理屏障，其局部黏膜的免疫應(yīng)答對病原體的抵御更加重要。因此，對半滑舌鰨抗病分子機(jī)制的研究將會對其病害防治提供重要的理論基礎(chǔ)。目前關(guān)于pIgR基因在半滑舌鰨的克隆及功能研究尚未見報道。

本研究對半滑舌鰨的pIgR基因進(jìn)行全長cDNA克隆并初步分析其結(jié)構(gòu)特征，采用實時熒光定量PCR(qRT-PCR)技術(shù)(邢賀飛等,2016)檢測了該基因在半滑舌鰨不同組織中的表達(dá)模式和在哈維氏弧菌(Vibrio harveyi)的刺激下不同組織的表達(dá)特征，從而為探究pIgR在半滑舌鰨的免疫應(yīng)答中的作用機(jī)制、開發(fā)抗病相關(guān)分子標(biāo)記提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實驗用魚

1.1.1 正常組織 本實驗中所用的半滑舌鰨取自山東省海陽市黃海水產(chǎn)公司，18月齡健康的半滑舌鰨體重為(104.9±4.6) g，全長為(25.8±1.3) cm，體寬為(6.8±0.2) cm。麻醉后，解剖分離肝、脾、腎、頭腎、鰓、腸、肌肉、心臟、皮膚等組織，將組織樣品迅速放入RNA保存液中，置于-20℃冰箱保存。

1.1.2 哈維氏弧菌感染及樣品采集 根據(jù)半滑舌鰨的感染實驗(Weiet al,2017)，將10月齡健康的半滑舌鰨經(jīng)腹腔注射哈維氏弧菌感染，在感染后的12、24、48、72和96 h共5個時間點，并以感染前0 h作為對照，分別取3條半滑舌鰨。將活魚麻醉后迅速取肝、脾、腸、腎、鰓和皮膚等6個免疫組織，放入RNA保存液中，置于-20℃冰箱中保存。

1.2 RNA提取及cDNA的合成

使用Trizol法進(jìn)行半滑舌鰨總RNA的提取，用瓊脂糖凝膠電泳檢測總RNA質(zhì)量，并使用Gene Quant Pro RNA/DNA分光光度計測定RNA濃度。RNA鑒定合格后，用cDNA反轉(zhuǎn)試劑盒(TaKaRa)合成cDNA。使用TaKaRa RACE試劑盒，根據(jù)其說明書合成RACE-Ready-cDNA。

1.3 pIgR基因全長cDNA的克隆

1.3.1 中間片段的驗證 首先根據(jù)半滑舌鰨全基因組測序結(jié)果(Chenet al,2014)，獲得pIgR基因的部分cDNA序列，應(yīng)用Primer Premier 5.0軟件設(shè)計引 物(pIgR-F/pIgR-R)(表1)，分別以腸、腎和鰓為模板進(jìn)行體系為15 μl的普通PCR擴(kuò)增。體系為：Mix為7.5 μl，pIgR-F為0.6 μl，pIgR-R為0.6 μl，ddH2O為5.3 μl，模板cDNA為1 μl。程序為：95℃預(yù)變性5 min；95℃ 30 s，58℃退火30 s，72℃延伸30 s，為35個循環(huán)；72℃延伸7 min；4℃保存。

表1 本研究所用到的引物 Tab.1 Primers used in this study

將得到的PCR產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測，利用膠回收試劑盒(康為世紀(jì))對所需的目的片段進(jìn)行收集、純化，連接到pEASY-T1載體，轉(zhuǎn)化Top10感受態(tài)細(xì)胞，涂板后經(jīng)37℃培養(yǎng)12～16 h，挑取3個陽性克隆送到北京睿博興科生物技術(shù)有限公司(青島區(qū))測序。

1.3.2 5′和3′ RACE克隆 根據(jù)驗證得到的部分cDNA序列設(shè)計5′和3′端的RACE引物(pIgR-5′- GSP/pIgR-5′-NGSP和pIgR-3′-GSP/pIgR-3′-NGSP)。第一輪反應(yīng)體系10 μl，根據(jù)TaKaRaTaqTMHot Start Version說明書介紹的體系比例加樣混合，進(jìn)行Touch down PCR程序反應(yīng)。

將第一輪PCR反應(yīng)產(chǎn)物稀釋50倍后作為第二輪普通PCR擴(kuò)增反應(yīng)的模板。反應(yīng)體系為50 μl，同上按比例加樣混合后，進(jìn)行第二輪普通PCR反應(yīng)。將得到的PCR產(chǎn)物根據(jù)中間片段驗證的方法處理并測序。

1.4 生物學(xué)分析及進(jìn)化樹構(gòu)建

使用生物學(xué)軟件DNAstar對克隆得到的pIgR全長cDNA序列進(jìn)行分析，預(yù)測其開放閱讀框(ORF)以 及氨基酸序列，并推導(dǎo)出蛋白的分子量和等電點；使用SignalP4.1對翻譯的氨基酸序列進(jìn)行信號肽分析，利用TMpred預(yù)測氨基酸序列跨膜結(jié)構(gòu)域。pIgR基因同源氨基酸序列的搜索在NCBI數(shù)據(jù)庫中通過Blast完成并預(yù)測功能結(jié)構(gòu)域，通過MEGA 7.0軟件完成生物系統(tǒng)進(jìn)化樹構(gòu)建和氨基酸多序列比對。

1.5 pIgR基因的表達(dá)模式檢測

通過使用qRT-PCR檢測健康的半滑舌鰨不同組織中pIgR基因的表達(dá)量；經(jīng)哈維氏弧菌感染刺激后6個不同時間點的肝、腎、脾、腸、鰓和皮膚的表達(dá)模式。根據(jù)得到的ORF序列設(shè)計實時熒光定量引物(pIgR-qRT-F/pIgR-qRT-R)， 再 以β-actin基因(β-actin-F/β-actin-R)(表 1)作為內(nèi)參基因，根據(jù)TaKaRa SYBR?Premix ExTaqTM說明書的方法進(jìn)行pIgR基因的定量分析。根據(jù)測得的Ct值，利用2-ΔΔCt法計算pIgR基因相對表達(dá)量，實驗得到的數(shù)據(jù)均采用SPSS軟件進(jìn)行方差分析，設(shè)定P＜0.05為差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 半滑舌鰨pIgR基因序列特征

半滑舌鰨pIgR基因的cDNA全長為1419 bp，其中，ORF為1020 bp，編碼339個氨基酸，5′ UTR為 109 bp，3′ UTR為290 bp，相對分子質(zhì)量為37472.76 D，理論等電點為6.870。蛋白結(jié)構(gòu)預(yù)測結(jié)果顯示，在1～19 aa之間存在1個信號肽序列，之后為胞外區(qū)、跨膜區(qū)和胞內(nèi)區(qū)，分別由263、22和54個氨基酸組成。胞外區(qū)包括2個ILD功能結(jié)構(gòu)域分別在26～111 aa和135～224 aa位置(圖1)。

圖1 半滑舌鰨pIgR基因cDNA序列以及推導(dǎo)的氨基酸序列 Fig.1 The cDNA and deduced amino acid sequences of C.semilaevis pIgR

2.2 系統(tǒng)進(jìn)化樹分析及氨基酸多序列比對

將半滑舌鰨pIgR的氨基酸序列通過蛋白序列比對在NCBI數(shù)據(jù)庫中下載的其他物種：大菱鲆(S.maximus,AGN54539.1)、牙鲆(P.olivaceus,ADK91435.1)、紅鰭東方鲀(T.rubripes,NP_001266944.1)、大黃魚(Larimichthys crocea,XP_010733629.2)、青鳉(Oryzias latipes,XP_004079170.1)、虹鱒(O.mykiss,ADB81776.1)、鯉魚(C.carpio,ADB97624.1)、草魚(C.idellus,ALX37964.1)、斑馬魚(Danio rerio,NP_001289179.1)、非洲爪蟾(Xenopus laevis,ABK62772.1)、原雞(Gallus gallus,NP_001038109.1)、鼠(Mus musculus,NP_ 035212.2)、人(Homo sapiens,NP_002635.2)的pIgR蛋白序列進(jìn)行分析。多序列氨基酸比對結(jié)果顯示，半滑舌鰨pIgR與其他硬骨魚類都只含有2個ILD區(qū)，分別對應(yīng)哺乳類的ILD1和ILD5，哺乳類及鳥類在ILD1中存在3個互補(bǔ)決定區(qū)(Complementary determining region,CDR)，而硬骨魚類則沒有相似序列(圖2)。系統(tǒng)進(jìn)化樹顯示魚類的pIgR聚為一支，其中，半滑舌鰨與大菱鲆和牙鲆聚 為一個分支，3種淡水魚(鯉魚、草魚和斑馬魚)聚為一個分支；兩棲類、鳥類和哺乳類聚為另一支(圖3)。

圖2 半滑舌鰨pIgR氨基酸多重序列比對結(jié)果 Fig.2 The multiple sequence alignment of the pIgR amino acid

圖3 半滑舌鰨pIgR與其他物種pIgR系統(tǒng)進(jìn)化分析 Fig.3 Phylogenetic analysis of C.semilaevis pIgR sequence with other pIgR sequences in fish,amphibians,birds,and mammals

2.3 半滑舌鰨pIgR基因的表達(dá)模式

2.3.1pIgR基因在各組織中的表達(dá) 健康組織表達(dá)結(jié)果顯示，pIgR基因在半滑舌鰨各個組織中均有表達(dá)，在鰓中表達(dá)量最高，其次是心臟、脾臟和皮膚，在肝臟、頭腎和腸中表達(dá)量較低，在肌肉中的表達(dá)量最低(圖4)。

圖4 半滑舌鰨pIgR基因在不同組織的表達(dá)分布 Fig.4 pIgR gene of C.semilaevis expression profile in different tissues

2.3.2 哈維氏弧菌感染后pIgR基因的表達(dá)量的變化

經(jīng)哈維氏弧菌感染后，半滑舌鰨內(nèi)臟和鰓組織中pIgR基因的表達(dá)模式發(fā)生變化。各組織中pIgR基因的相對表達(dá)量均呈現(xiàn)先增加后減少的趨勢，其中，鰓和脾臟在48 h時出現(xiàn)峰值；腎臟、肝臟和腸在72 h時出現(xiàn)峰值；皮膚在96 h內(nèi)一直處于上升趨勢(圖5)。

3 討論

本研究通過PCR及RACE方法成功獲得半滑舌鰨pIgR基因cDNA全長序列，豐富了對半滑舌鰨免疫相關(guān)基因的認(rèn)識。與硬骨魚類pIgR基因的氨基酸序列進(jìn)行同源比對分析，表明8種硬骨魚類都只含有2個ILD，分別與哺乳動物的ILD1和ILD5同源。哺乳動物pIgR與免疫球蛋白的結(jié)合實驗證明ILD1是受體結(jié)合的必要結(jié)構(gòu)(Kaetzelet al,2005)。雖然已有研究證明，硬骨魚pIgR能夠結(jié)合IgM和IgT(Fenget al,2009; Zhanget al,2010)，但結(jié)合及轉(zhuǎn)運的機(jī)制還需要進(jìn)一步研究。另外，研究證明，斑馬魚存在多種pIgR-like基因，在鯉魚腸道中也發(fā)現(xiàn)一種具有IgM結(jié)合活性的pIgR-like蛋白(Kortumet al,2014)，在半滑舌鰨中的研究有待繼續(xù)開展。

組織表達(dá)模式分析發(fā)現(xiàn)，pIgR基因在半滑舌鰨各個組織中均有表達(dá)，其中，在鰓中表達(dá)最高，在心臟、脾臟和皮膚中表達(dá)稍高，在肌肉中表達(dá)最低，說明pIgR特異地在黏膜免疫相關(guān)組織中表達(dá)。心臟組織樣品采集時充盈了血液，因此pIgR表達(dá)量較高。本研究結(jié)果與牙鲆(Xuet al,2013)、大菱鲆(丁冰潔等,2013)、斜帶石斑魚(Fenget al,2009)和紅鰭東方鲀(Hamuroet al,2007)等基本一致。已有研究證明，硬骨魚類pIgR基因?qū)?xì)菌和寄生蟲的感染均有快速的響應(yīng)模式。滅活鰻弧菌(Vibrio anguillarum)浸泡刺激后，大菱鲆免疫組織中pIgR的相對表達(dá)量在72 h內(nèi)均呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢，且黏膜相關(guān)淋巴組織中的峰值出現(xiàn)最早(丁冰潔等,2013)。白點蟲感染泥鰍(Misgurnus anguillicaudatus)的脾臟、腎臟、皮膚和鰓中pIgR的表達(dá)量均有顯著升高(Yuet al,2018)。本研究對哈維氏弧菌感染不同時間，半滑舌鰨免疫相關(guān)組織中pIgR基因的表達(dá)變化規(guī)律進(jìn)行了檢測。在鰓和4種內(nèi)臟組織中pIgR基因均呈現(xiàn)先增加后減少的趨勢，其中，鰓和脾臟pIgR的表達(dá)量在48 h時出現(xiàn)峰值；腎臟、肝臟和腸中pIgR的表達(dá)量在72 h時出現(xiàn)峰值。然而，在皮膚中的pIgR的表達(dá)量在96 h內(nèi)持續(xù)上升，證明皮膚一直處于應(yīng)答狀態(tài)，這可能是因為腹腔注射的哈維氏弧菌經(jīng)血液循環(huán)及組織擴(kuò)散到 皮膚，導(dǎo)致皮膚潰爛。因此，皮膚中大量表達(dá)pIgR，發(fā)揮持久的免疫防御作用，提示pIgR在黏膜免疫防御中發(fā)揮重要作用。

圖5 哈維氏弧菌感染后半滑舌鰨pIgR在免疫組織中表達(dá)變化 Fig.5 The expression of C.semilaevis pIgR in immunologic tissues after V.harveyi infection

綜上所述，本研究對半滑舌鰨pIgR基因進(jìn)行了cDNA全長克隆、進(jìn)化分析及表達(dá)模式的研究，尤其是對pIgR在黏膜免疫防御中的作用進(jìn)行了深入分析，為進(jìn)一步研究pIgR在免疫應(yīng)答中的作用機(jī)制提供了理論基礎(chǔ)。