史曉麗 張瑩雪 孟憲紅① 孔 杰 欒 生 羅 坤 曹寶祥 曹家旺 陳寶龍

(1.農(nóng)業(yè)農(nóng)村部海洋漁業(yè)可持續(xù)發(fā)展重點(diǎn)實驗室 中國水產(chǎn)科學(xué)研究院黃海水產(chǎn)研究所 青島 266071； 2.青島海洋科學(xué)與技術(shù)試點(diǎn)國家實驗室海洋漁業(yè)科學(xué)與食物產(chǎn)出過程功能實驗室 青島 266071)

中國對蝦(Fenneropenaeus chinensis)是我國重要的土著海水養(yǎng)殖種類之一，近十幾年來，其養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)飽受病害困擾。在諸多病原當(dāng)中，白斑綜合征病毒(White spot syndrome virus,WSSV)是對對蝦養(yǎng)殖生產(chǎn)毒害最大的病毒之一(Lightner,1996)，它導(dǎo)致的疾病傳播快、破壞性強(qiáng)，且防治困難，已給我國乃至全球的對蝦養(yǎng)殖業(yè)造成了極大危害，嚴(yán)重制約了對蝦養(yǎng)殖業(yè)的健康發(fā)展。國內(nèi)外學(xué)者展開了大量研究工作，如消除傳染源、切斷傳播途徑、控制水質(zhì)量、提高對蝦抵抗力等以降低其危害，但至今效果不顯著(Yanget al,2001; Heet al,2012; Yangetal,2012; 曹家旺等,2017)。研究對蝦對病原感染的免疫應(yīng)答機(jī)制，可以為有效進(jìn)行對蝦的病害防治提供重要的理論指導(dǎo)。

甘氨酸脫羧酶(Glycine Decarboxylase,GLDC)是由P-蛋白、H-蛋白、T-蛋白和L-蛋白4個亞基構(gòu)成的多酶復(fù)合體系(Tadaet al,1987)。它作為天冬門氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶超家族(Aspartateamino transferase superfamily,AAT_I)的成員，是一種磷酸吡哆醛依賴酶。在人類中的研究表明，甘氨酸脫羧酶的突變是非酮性高甘胺酸血癥(Nonketotic Hyperglycinemia,NKH)的病因，該疾病是由先天基因缺陷導(dǎo)致大量甘氨酸在體液中積累而引起的嚴(yán)重的神經(jīng)功能障礙，如腦病、肌張力減退、呼吸暫停、頑固性癲癇和可能的死亡(Kanekaret al,2013)。也有學(xué)者指出，GLDC是非小細(xì)胞肺癌(Non-small cell lung cancer,NSCLC)發(fā)生的關(guān)鍵酶，NSCLC初期腫瘤的TICs中檢測到高表達(dá)量的LIN28B干細(xì)胞因子和GLDC(Zhanget al,2012)。GLDC在糖酵解和甘氨酸/絲氨酸代謝中引起巨大變化，導(dǎo)致嘧啶代謝發(fā)生變化，從而影響腫瘤細(xì)胞的增殖(信波等,2007)。迄今為止，水產(chǎn)動物中尚未見該基因相關(guān)的研究報道。

在中國對蝦感染W(wǎng)SSV后的表達(dá)譜芯片研究中，發(fā)現(xiàn)甘氨酸脫羧酶基因出現(xiàn)顯著差異表達(dá)，此外，該基因內(nèi)部出現(xiàn)與抗病性狀呈顯著關(guān)聯(lián)的SNP位點(diǎn)(本實驗室未發(fā)表數(shù)據(jù))。故此，本研究采用RACE技術(shù)克隆中國對蝦的甘氨酸脫羧酶基因(以下稱FcGLDC基因)，并研究其在WSSV侵染后的時空表達(dá)特點(diǎn)；利用直接測序法篩選基因內(nèi)部的SNP位點(diǎn)，并利用飛行時間質(zhì)譜法對SNP位點(diǎn)進(jìn)行分型及其與抗WSSV性狀的關(guān)聯(lián)分析。研究結(jié)果將有助于為中國對蝦抗WSSV育種提供理論依據(jù)和實踐資料。

1 材料與方法

1.1 實驗材料及人工WSSV感染實驗

中國對蝦實驗群體取自中國水產(chǎn)科學(xué)研究院黃海水產(chǎn)研究所遺傳育種中心[體重(1.01±0.21) g]，實驗前暫養(yǎng)7 d。實驗用水為砂濾海水，養(yǎng)殖期間水溫為24.8～25.4℃，鹽度為28，持續(xù)充氧，每天換水，并投喂配合飼料。利用單尾、等量、口飼法對1500尾左右的對蝦進(jìn)行WSSV感染，感染方法參見逄錦菲等(2013)，選取WSSV感染實驗中早期死亡的48尾和后期死亡的48尾對蝦分別作為敏感群體和抗性群體，將2個群體的肌肉組織保存于液氮中，用于后續(xù)DNA的提取及關(guān)聯(lián)分析。

隨機(jī)挑選暫養(yǎng)的健康中國對蝦180尾，平均分為2組(WSSV感染組和對照組)，每組3個平行。WSSV感染組從第五腹節(jié)處注射病毒含量103copies/μl的病毒懸液10 μl，對照組從第五腹節(jié)處注射PBS 10 μl，各組分別在實驗開始后的0、6、12、24、48和72 h取鰓、肝胰腺和肌肉組織，每個時間點(diǎn)各取3尾存于液氮中，用于后續(xù)RNA的提取及熒光定量驗證。

1.2 基因組DNA和總RNA的提取及cDNA合成

使用Trizol法提取中國對蝦肝胰腺組織的總RNA，具體操作方法參照說明書(Invitrogen,美國)。采用紫外分光光度計與瓊脂糖凝膠電泳檢測所提取RNA的質(zhì)量及完整性。利用SMARTTMRACE Amplification Kit(Clontech,美國)反轉(zhuǎn)錄合成cDNA第一條鏈。按照TIANGEN基因組DNA提取試劑盒的方法進(jìn)行基因組DNA的提取。采用紫外分光光度計與瓊脂糖凝膠電泳檢測所提取DNA的質(zhì)量及完整性。

1.3 中國對蝦FcGLDC基因全長cDNA的克隆及測序

根據(jù)本實驗室的中國對蝦454轉(zhuǎn)錄組測序獲得的甘氨酸脫羧酶基因的部分EST序列，使用Primer Premier 5.0軟件設(shè)計5′RACE和3′RACE引物(表1)，利用Advantage 2 Polymerase(AD酶)進(jìn)行擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測后，利用膠回收試劑盒回收目的片段，連接到pMD18-T simple載體上，轉(zhuǎn)化入Top 10感受態(tài)細(xì)胞。使用M13引物對克隆進(jìn)行菌落PCR鑒定，陽性克隆經(jīng)確定后送青島擎科測序公司進(jìn)行測序。

1.4 中國對蝦FcGLDC基因的克隆及測序

以對蝦的基因組DNA為模板，根據(jù)FcGLDC基因的cDNA序列設(shè)計引物(表1)。利用TaKaRa的LA TaqDNA聚合酶進(jìn)行擴(kuò)增，反應(yīng)體系：DNA模板2 μl，正反向引物各5 μl，dNTP mixture(2.5 mmol/L each) 8 μl，Buffer 5 μl，LA Taq0.5 μl，加水補(bǔ)足到50 μl。PCR反應(yīng)程序：94℃變性5 min；94℃變性30 s，60℃退火30 s，72℃延伸3 min，35個循環(huán)，72℃延伸5 min。擴(kuò)增產(chǎn)物測序由青島擎科測序公司進(jìn)行。

1.5 基因生物信息學(xué)分析

測序結(jié)果通過NCBI網(wǎng)站上的BLASTX進(jìn)行序列同源性比對分析，利用DNASTAR軟件進(jìn)行全長序 列拼接，在線生物學(xué)軟件ExPASY對全長序列編碼的氨基酸序列進(jìn)行生物信息學(xué)分析，使用MEGA 5.0軟件的鄰接法(NJ)構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹。

表1 引物序列及信息 Tab.1 Primer sequences in RACE,qRT-PCR and DNA amplification

1.6 基因的時空表達(dá)分析

以18S rRNA作為Real-time PCR反應(yīng)的內(nèi)參基因，采用TaKaRa的熒光定量PCR試劑盒對基因進(jìn)行熒光定量qRT-PCR檢測。所用儀器為ABI 7500型熒光定量PCR儀，各個基因引物序列見表1。20 μl反應(yīng)體系包含：2×SYBR Green PCR Master Mix 10 μl，正向和反向引物各1 μl(2 μmol/L)，稀釋后的cDNA模板1 μl(1∶10稀釋)，循環(huán)參數(shù)按照說明書。實驗重復(fù)3次，以平均值進(jìn)行后續(xù)數(shù)據(jù)分析。根據(jù)2-ΔΔCt方法計算每個基因的相對表達(dá)量(Livaket al,2001)，所得數(shù)據(jù)用SPSS 18.0進(jìn)行單因素方差分析(One-way ANOVA)，比較均值的差異顯著性，P＜0.05為差異顯著，P＞0.05為差異不顯著。

1.7 中國對蝦FcGLDC基因的SNP位點(diǎn)篩查及其與抗WSSV性狀的關(guān)聯(lián)分析

取中國對蝦5個個體的DNA進(jìn)行混合，進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)，擴(kuò)增產(chǎn)物用1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測后將產(chǎn)物送青島擎科測序公司測序。在測序結(jié)果中尋找有明顯雙峰的位點(diǎn)，將其定為SNP位點(diǎn)。之后利用飛行時間質(zhì)譜法對SNP位點(diǎn)進(jìn)行分型，并在敏感群體和抗性群體中對分型結(jié)果進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 中國對蝦FcGLDC基因cDNA全長序列的克隆

利用Trizol法獲得中國對蝦肝胰腺組織的RNA，經(jīng)1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測后發(fā)現(xiàn)，18S和28S rRNA條帶清晰，說明其完整性較好，紫外分光光度計檢測其OD260 nm/OD280 nm為1.86，表明其純度較高，可用于后續(xù)實驗。

中國對蝦FcGLDCcDNA序列全長3481 bp，其中，5′UTR長17 bp，3′UTR長86 bp，ORF為2829 bp，編碼942個氨基酸，包含94個堿性氨基酸(K和R)，108個酸性氨基酸(D和E)，322個疏水氨基酸(A、I、L、F、W和V)，233個親水氨基酸(N、C、Q、S、T和Y)，222個帶電荷氨基酸(K、R、D和E)，預(yù)測蛋白分子量為104.66 kDa，理論等電點(diǎn)為6.51(圖1)。

2.2 中國對蝦FcGLDC基因的克隆

經(jīng)PCR擴(kuò)增得到中國對蝦GLDC基因DNA序列全長，共4964 bp，包含12個外顯子和11個內(nèi)含子。所有內(nèi)含子均由GT開頭，以AG結(jié)尾，符合GT-AG法則。所有內(nèi)含子都在開放閱讀框內(nèi)部(圖2)。

2.3 FcGLDC蛋白系統(tǒng)進(jìn)化分析

氨基酸序列分析顯示，F(xiàn)cGLDC蛋白含有天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶超家族的典型保守序列SAAILPISW(A也可為S)，定位于第736～744氨基酸(圖3)。氨基酸序列比對發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)cGLDC的蛋白序列與節(jié)肢動物的相似度最高，與內(nèi)華達(dá)白蟻(Zootermopsis nevadensis)、體虱(Pediculus humanus corporis)和白紋伊蚊(Aedes albopictus)的相似度分別是71%、68%和68%，而與哺乳動物如非洲象(Loxodonta africana)和草原鹿鼠(Peromyscus maniculatus bairie)的相似度分別為67%和67%。

系統(tǒng)進(jìn)化分析表明，GLDC基因在進(jìn)化過程中分為了脊椎動物(哺乳動物、爬行動物等)和無脊椎動物(主要為節(jié)肢動物)兩個大的分支，在無脊椎動物分支 中，中國對蝦所屬的甲殼亞門和家蠅(Musca domestica)、埃及伊蚊(Aedes aegypti)等六足亞門的物種之間也體現(xiàn)了差異性(圖4)。

圖1 中國對蝦GLDC基因cDNA全長序列及其編碼的氨基酸序列 Fig.1 The full-length cDNA sequence and deduced amino acid sequence of the FcGLDC gene

圖2 FcGLDC基因的DNA結(jié)構(gòu) Fig.2 The DNA structure of FcGLDC 紅色框表示外顯子，黑色線表示內(nèi)含子 Red box represents exon,black line represents intron

圖3 中國對蝦與其他物種GLDC氨基酸的序列比對 Fig.3 Alignment analysis of amino acid sequence of FcGLDC from various species 黑色方框內(nèi)為保守序列。Conserved sequence marked with black box

2.4 中國對蝦FcGLDC基因的組織表達(dá)分析

FcGLDC基因在中國對蝦各組織中的相對表達(dá)量分析結(jié)果顯示，該基因在鰓、肝胰腺和肌肉中均有表達(dá)，其中，肌肉中的表達(dá)量最高，肝胰腺中次之， 鰓中的表達(dá)量最少，但三者間無顯著差異(P＞0.05)(圖5A)。

FcGLDC基因在感染W(wǎng)SSV的對蝦不同組織中的相對表達(dá)量變化分析結(jié)果顯示，在鰓中，該基因的 表達(dá)量在感染后的變化與對照組基本一致，均為急劇下降，在24 h時，實驗組表達(dá)量有小幅上升，是對照組的4.47倍(P＜0.05)(圖5C)。在肝胰腺中，GLDC基因的表達(dá)量同樣在注射后明顯降低，在12 h有上升趨勢，而后在48 h時表達(dá)量達(dá)到最低。肝胰腺中，各個時間點(diǎn)對照組與實驗組的表達(dá)量差異均不顯著(P＞0.05)(圖5B)。在肌肉組織中，實驗組GLDC基因的表達(dá)量在24 h和72 h時表現(xiàn)為2次峰值，分別為對照組的19.98倍(P＜0.05)和4.21倍(P＜0.05)(圖5D)。在6個時間點(diǎn)中，實驗組的表達(dá)量均高于對照組。

圖4 中國對蝦與其他物種GLDC的系統(tǒng)進(jìn)化分析 Fig.4 The phylogenetic tree analysis of FcGLDC from various species

圖5 FcGLDC mRNA的組織表達(dá)及其在感染后的組織表達(dá)(n=3) Fig.5 The expression profiles of FcGLDC in hepatopancreas,gill,and muscle(n=3)

2.5 中國對蝦FcGLDC基因SNP位點(diǎn)多態(tài)性分析及其關(guān)聯(lián)分析

利用直接測序法，在FcGLDC內(nèi)部共發(fā)現(xiàn)4個可能的SNP位點(diǎn)，并利用質(zhì)譜法對這4個位點(diǎn)進(jìn)行了成功分型。分型結(jié)果采用PopGene軟件處理，統(tǒng)計各位點(diǎn)的期望雜合度He，觀測雜合度Ho，計算各位點(diǎn)多態(tài)信息含量PIC，并進(jìn)行哈迪-溫伯格平衡檢驗(表2)。

由表2可知，F(xiàn)cGLDC基因內(nèi)的這4個SNP標(biāo)記的Ho范圍為0.045～0.462，He范圍為0.108～0.465。C1588-TG和C4406-CT的PIC分別為0.355和0.285，為中度多態(tài)(0.25＜PIC＜0.5)，C4854-GA和C2967-AG的PIC分別為0.142和0.101，屬于低度多態(tài)(PIC＜0.25)。哈溫平衡分析結(jié)果顯示，只有C1588-TG符合哈迪-溫伯格平衡檢驗，且差異不顯著。

表2 SNP位點(diǎn)多態(tài)性分析 Tab.2 The analysis of genetic polymorphism of SNPs

使用SPSS 18.0對基因型和抗WSSV性狀之間的相關(guān)性進(jìn)行卡方檢驗，發(fā)現(xiàn)各位點(diǎn)與抗WSSV性狀不相關(guān)(P＞0.05)(表3)。

表3 SNP位點(diǎn)與抗WSSV性狀的關(guān)聯(lián)分析 Tab.3 The correlation analysis of SNPs between WSSV-sensitive group and WSSV-resistant group

3 討論

本研究首次報道了對蝦中的甘氨酸脫羧酶，克隆的FcGLDC基因ORF全長為2829 bp，編碼942個氨基酸。氨基酸序列分析表明，其含有天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶超家族的典型保守序列SAAILPISW(A也可為S)。蛋白的進(jìn)化分析顯示，該甘氨酸脫羧酶基因與其他節(jié)肢動物的甘氨酸脫羧酶基因明顯聚為一類。ORF序列分析、蛋白保守位點(diǎn)分析及蛋白的系統(tǒng)進(jìn)化分析均表明FcGLDC基因與其他物種的甘氨酸脫羧酶具有較高的相似性，因此，確定本研究克隆的FcGLDC基因為中國對蝦的甘氨酸脫羧酶基因。

本研究分析了中國對蝦感染W(wǎng)SSV后GLDC基因在鰓、肝胰腺及肌肉組織中的表達(dá)特征，結(jié)果顯示，該基因在3種組織中均有表達(dá)，且在肌肉中的表達(dá)最高。感染后，通過分析GLDC在3種組織中的表達(dá)規(guī)律發(fā)現(xiàn)，肌肉對該基因最敏感，說明WSSV對該基因有相對比較大的刺激?？紤]到對蝦感染W(wǎng)SSV后出現(xiàn)了運(yùn)動機(jī)能減退的情況(Lightneret al,1998)，推測肌肉中該基因的表達(dá)與對蝦的運(yùn)動不協(xié)調(diào)有關(guān)。

本研究通過直接測序法得到了中國對蝦GLDC基因全長DNA序列，該DNA序列全長為5608 bp，包含11個內(nèi)含子，鑒定的外顯子-內(nèi)含子邊界都與經(jīng)典的剪接供體(GT-)和受體序列(-AG)一致。開放閱讀框起于第1個外顯子，止于第12個外顯子。眾所周知，真核生物的基因在每個外顯子和內(nèi)含子的接頭區(qū)，都有一段高度保守的共有序列，即每個內(nèi)含子的5′端起始的2個核苷酸均為GT，3′端的2個核苷酸均為AG。但也有少數(shù)基因不符合GT-AG法則，如在人類135 kb的GLDC基因含有的24個內(nèi)含子中，只發(fā)現(xiàn)有1個內(nèi)含子不符合GT-AG法則(Takayanagiet al,2000)。

本研究通過直接測序法定位了中國對蝦GLDC基因DNA全長序列中4個可能的SNP位點(diǎn)，并進(jìn)一步通過飛行時間質(zhì)譜法對這4個位點(diǎn)進(jìn)行分型檢測。4個SNP位點(diǎn)有2個位于內(nèi)含子上，2個位于外顯子上。位于外顯子上的突變位點(diǎn)均在密碼子的第3位，屬于同義突變，未對所編碼氨基酸序列造成影響。位于內(nèi)含子區(qū)域的突變在轉(zhuǎn)錄翻譯過程中被剪切，并不參與調(diào)控過程。位點(diǎn)多態(tài)性分析顯示，有3個位點(diǎn)不符合哈迪-溫伯格平衡，推測這可能是雜合子數(shù)量過多或不足造成的。位點(diǎn)與性狀的關(guān)聯(lián)分析表明，獲得的SNP位點(diǎn)均與性狀不相關(guān)。關(guān)聯(lián)分析研究時需要考慮群體分層的問題。由于群體存在遺傳背景的差異，使得來自不同亞群的個體中等位基因頻率存在差異，即存在群體分層，關(guān)聯(lián)分析時這些位點(diǎn)會造成假陽性(Emahazionet al,2001)。因此，加大樣本量，并盡量使用遺傳背景一致或相似的群體如采用基于家系的群體進(jìn)行關(guān)聯(lián)研究就顯得尤為重要。本研究選用家系材料作為驗證群體，遺傳背景相近，符合關(guān)聯(lián)研究所用群體的要求。水產(chǎn)動物中，羅非魚(Oreochromis niloticus)、大口黑鱸(Micropterus salmoides)、櫛孔扇貝(Chlamys farreri)等物種的經(jīng)濟(jì)性狀與SNP位點(diǎn)的關(guān)聯(lián)分析時采用的群體多小于200個個體(劉福平等,2009; 杜芳芳等,2011; 李紀(jì)勤,2012)，本研究采用的是感染早期死亡和后期死亡的各48尾個體進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析，數(shù)量上基本達(dá)到了關(guān)聯(lián)分析群體數(shù)量的要求。

本研究首次在中國對蝦中獲得了甘氨酸脫羧酶基因的全長cDNA序列及其DNA序列，分析了WSSV感染后該基因在不同組織中的表達(dá)特征，并進(jìn)行了基因內(nèi)部SNP位點(diǎn)多態(tài)性分析及其關(guān)聯(lián)分析，研究結(jié)果將有助于為中國對蝦抗WSSV育種提供理論依據(jù)和實踐資料。