范耘碩 邵 蓬 賈旭穎 高金偉 竇 勇 史謝堯 周文禮

(天津市水產生態(tài)與養(yǎng)殖重點實驗室 天津農學院水產學院 天津 300384)

水產動物在養(yǎng)殖與運輸過程中會受到多種脅迫因子的影響。機體在脅迫作用下的應激反應分為三級(Wendelaar Bonga,1997)，其中，主要應激反應包括兒茶酚胺和皮質醇循環(huán)水平的增加；繼發(fā)性應激反應由主要反應引起，包括能量調動的增加，主要表現(xiàn)為高血糖和脂質代謝量的上升，為應對脅迫提供了必要的能量。其他繼發(fā)性應激反應與體內滲透壓及心血管、呼吸和免疫功能有關(Barton,2002)。而主要應激反應與繼發(fā)性應激反應可能會引起影響魚體機能的三級應激反應，如生長性能、繁殖能力和存活率等(Schreck,2010)。溫度脅迫是水產養(yǎng)殖過程中重要的脅迫因子之一，魚類對水溫變化的響應主要表現(xiàn)為攝 食量、生長周期、繁殖率和存活率等生理生化指標的變化(李勇等,2011)?？寡趸竿ǔ４嬖谟诤醚跎锏母鞣N組織中，超氧化物歧化酶(Superoxide dismutase,SOD)和過氧化氫酶(Catalase,CAT)是水生動物重要的抗氧化因子，可以除去體內過量的活性氧自由基(成艷波等,2017)?？寡趸富盍χ苯邮軠囟日{控，環(huán)境溫度過高或過低會導致抗氧化酶活力下降(劉峰等,2016; 羅偉等,2017)。非特異性免疫是魚類免疫反應的主要機制，溶菌酶(Lysozyme,LZM)和堿性磷酸酶(Alkaline phosphatase,AKP)是這一過程中的2個關鍵酶(薛寶貴等,2013)。溫度也是刺激魚類非特異性免疫機能變化的主要環(huán)境因素之一，當環(huán)境溫度低于魚類最適水溫時，魚體的免疫反應通常會降低或延遲，而過高的水溫會則造成與免疫相關酶活力的喪失，影響魚類正常的免疫應答反應(Raidaet al,2007; Bowden,2008)。

大鱗副泥鰍(Paramisgurnus dabryanus)為鯉形 目(Cypriniformes)、鰍科(Cobitidae)、副泥鰍屬(Paramisgurnus)，屬溫水性魚類，具有口感風味佳，營養(yǎng)價值高，生長速度快，環(huán)境耐受力強等特點，已成為東亞地區(qū)，特別是中國和韓國重要的淡水養(yǎng)殖品種之一(Youet al,2011; Xiaet al,2011; Zhanget al,2015)。目前，關于溫度脅迫對水產動物影響的研究多見于常見或名貴水產經濟動物，而關于溫度脅迫對大鱗副泥鰍的研究較少。本研究以大鱗副泥鰍為研究對象，通過對實驗魚進行4種溫度下12 h的脅迫實驗及24 h的恢復實驗，測定肝臟和血清中部分抗氧化與非特異性免疫指標的變化，以期為評價大鱗副泥鰍對環(huán)境變化的適應能力提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗用魚與飼養(yǎng)管理

實驗用魚由天津鴻騰水產科技發(fā)展有限公司提供，體重為(38.20±3.70) g，體長為(19.3±2.8) cm。實驗用魚運回實驗室后，暫養(yǎng)7 d，暫養(yǎng)水溫為22℃。實驗開始前，選取大小均勻、體格健壯、活力較強的個體，禁食24 h后用于實驗。實驗分為脅迫期與恢復期，實驗共36 h，其中，脅迫期為12 h，分為4個處理，分別標記為對照組、高溫組、降溫組和低溫組，對應水溫分別為22℃、29℃、15℃和8℃，每個處理設3個平行，每個平行使用60 L玻璃水槽養(yǎng)殖容器，每個水槽中隨機放60尾魚。使用加熱棒和制冷循環(huán)水機控制溫度，各水槽溫度誤差為±0.5℃，每20 min檢測1次水溫；恢復期為24 h，各處理水溫快速調整至(22±0.5)℃。實驗用水為曝氣48 h的自來水，實驗期間使用氣泵充氣，水體pH為8.5～8.0，溶解氧為6.1～ 7.3 mg/L，總N濃度為0.2～0.3 mg/L。

1.2 樣品采集

在脅迫期的第1、2、4、8、12 h及恢復期的第4、8、12、24 h(以r-4、r-8、r-12和r-24 h表示)分別取血清和肝臟樣品，每次隨機從各槽中取出5尾實驗魚，使用MS-222(0.5 mg/L)麻醉后，進行尾靜脈取血，將取出的血液轉入1.5 ml離心管后，4℃靜置2 h，4℃條件下，3000 r/min離心10 min，取上清液，轉入-80℃超低溫冰箱保存；取血后，在冰盤上解剖實驗魚，取肝臟，用4℃去離子水沖洗，并按1∶9(W/V)加入預冷生理鹽水(4℃，0.86%)，使用玻璃勻漿器在冰水浴中勻漿，制成10%組織勻漿液，4℃條件下3500 r/min離心10 min，取上清液，轉入-80℃超低溫冰箱保存。

1.3 實驗指標測定

實驗魚肝臟樣品中的CAT、SOD、丙二醛(Malondialdehyde,MDA)、LZM及AKP分別采用南京建成生物工程研究所提供的A007-2過氧化氫酶(CAT)測定試劑盒(可見光法)、A001-1總超氧化物歧化酶(T-SOD)測試盒(羥胺法)、A003-1丙二醛(MDA)測定試劑盒(TBA法)、A050-1溶菌酶(LZM)檢測試劑盒(比濁法)以及A059-1堿性磷酸酶(AKP)測試盒(可見光比色法)進行測定，測定儀器為SHIMADZU紫外UVmini-1240可見分光光度計，Thermo Scientific Varioskan Flash全波長掃描式多功能讀數(shù)儀(多功能酶標儀)；血清谷丙轉氨酶(Alanine aminotransferase,ALT)、谷草轉氨酶(Aspartate transaminase,AST)含量使用東芝TBA-120FR全自動生化分析儀進行測定；使用考馬斯亮藍G250染料結合法測定總蛋白質含量(Bradford,1976)。

1.4 實驗數(shù)據(jù)處理

實驗數(shù)據(jù)以平均值±標準差(Mean±SD)表示。使用IBM SPSS 21.0對實驗數(shù)據(jù)進行單因素方差分析(One-way ANOVA)和Duncan多重比較，設定P值為0.05，P＜0.05表示差異顯著。

2 結果

2.1 溫度脅迫對大鱗副泥鰍肝臟抗氧化相關指標的影響

實驗期間，對照組SOD活力基本穩(wěn)定。溫度脅迫顯著降低肝臟SOD活力(P＜0.05)，至脅迫期結束 (12 h)，各實驗組SOD活力均顯著低于對照組(P＜0.05)，其中，高溫組SOD活力最低，顯著低于其他處理組(P＜0.05)?；謴推趦?，各實驗組SOD活力均逐漸升高，至恢復期結束時(r-24 h)，各實驗組SOD活力基本恢復至對照組水平(P＞0.05)(圖1)。對照組CAT活力在實驗期間基本穩(wěn)定。溫度脅迫顯著降低肝臟CAT活力(P＜0.05)，至脅迫期結束(12 h)，各實驗組CAT活力均顯著低于對照組(P＜0.05)，其中，高溫組顯著高于降溫組與低溫組(P＜0.05)?；謴推趦?，各實驗組CAT活力均逐漸升高，至恢復期結束時(r- 24 h)，各實驗組CAT活力基本恢復至對照組水平(P＞ 0.05)(圖2)。對照組MDA含量在實驗期間基本穩(wěn)定。溫度脅迫顯著升高肝臟MDA含量(P＜0.05)，至脅迫期結束(12 h)，各實驗組MDA含量均顯著高于對照組(P＜0.05)，其中，低溫組顯著高于高溫組(P＜0.05)。恢復期內，各實驗組MDA均逐漸下降，至恢復期結束時(r-24 h)，各實驗組MDA含量基本恢復至對照組水平(P＞0.05)(圖3)。

2.2 溫度脅迫對大鱗副泥鰍肝臟LZM與AKP活力的影響

圖1 溫度脅迫對大鱗副泥鰍肝臟SOD活力的影響 Fig.1 Effects of temperature stress on SOD activity of P.dabryanus

實驗期間，對照組LZM活力基本穩(wěn)定。溫度脅迫顯著降低肝臟LZM活力(P＜0.05)，至脅迫期結束(12 h)，各實驗組LZM活力均顯著低于對照組(P＜ 0.05)。恢復期內，高溫組LZM活力基本穩(wěn)定，降溫組與低溫組逐漸升高，至恢復期結束時(r-24 h)，高溫組LZM活力顯著低于其他各組(P＜0.05)，降溫組與 低溫組基本恢復至對照組水平(P＞0.05)(圖4)。對照組AKP活力在實驗期間基本穩(wěn)定。溫度脅迫顯著降低肝臟AKP活力(P＜0.05)，至脅迫期結束(12 h)，各實驗組AKP活力均顯著低于對照組(P＜0.05)。恢復期內，高溫組AKP活力基本穩(wěn)定，降溫組與低溫組逐漸升高，至恢復期結束時(r-24 h)，高溫組AKP活力顯著低于其他各組(P＜0.05)，降溫組與低溫組基本恢復至對照組水平(P＞0.05)(圖5)。

2.3 溫度脅迫對大鱗副泥鰍血清轉氨酶含量的影響

實驗期間，對照組AST含量基本穩(wěn)定。溫度脅迫顯著升高肝臟AST含量(P＜0.05)，至脅迫期結束(12 h)，各實驗組AST含量均顯著高于對照組(P＜ 0.05)。恢復期內，各實驗組AST含量均呈先升高后下降的趨勢，至恢復期結束時(r-24 h)，各實驗組AST 含量基本恢復至對照組水平(P＞0.05)(圖6)。對照組ALT含量在實驗期間基本穩(wěn)定。溫度脅迫顯著升高血清ALT含量(P＜0.05)，至脅迫期結束(12 h)，各實驗組ALT含量均顯著高于對照組(P＜0.05)，其中高溫組顯著高于降溫組?；謴推趦?，各實驗組ALT含量均呈先升高后下降的趨勢，至恢復期結束時(r-24 h)，高溫組ALT活力顯著高于其他各組(P＜0.05)，降溫組與低溫組基本恢復至對照組水平(P＞0.05)(圖7)。

圖4 溫度脅迫對大鱗副泥鰍肝臟LZM活力的影響 Fig.4 Effects of temperature stress on LZM activity of P.dabryanus

圖5 溫度脅迫對大鱗副泥鰍肝臟AKP活力的影響 Fig.5 Effects of temperature stress on AKP activity of P.dabryanus

3 討論

3.1 溫度脅迫對大鱗副泥鰍肝臟抗氧化指標相關酶活力的影響

圖6 溫度脅迫對大鱗副泥鰍血清AST含量的影響 Fig.6 Effects of temperature stress on AST content of P.dabryanus

圖7 溫度脅迫對大鱗副泥鰍肝臟ALT含量的影響 Fig.7 Effects of temperature stress on ALT content of P.dabryanus

應激可以通過細胞色素C氧化酶復合物功能增加肝細胞色素P450產生活性氧自由基的能力(Kato,1977)，而過量的自由基會導致肝臟損傷。SOD通過 去除自由基來平衡氧化和抗氧化過程，從而防止細胞損傷；CAT催化H2O2分解為氧和水，阻斷高活力羥基自由基反應，并阻止H2O2的毒性細胞效應(van der Oostet al,2003; Gület al,2004)。而作為脂質過氧化的最終產物，MDA濃度是反映體內氧自由基數(shù)量的重要指標(Mourenteet al,1999)。研究表明，溫度脅迫會對影響魚類抗氧化系統(tǒng)造成影響。對石斑魚雜交后代(Epinephelus moara♀ ×Epinephelus lanceolatus♂)的研究發(fā)現(xiàn)，低溫脅迫會使實驗魚CAT活力呈現(xiàn)波動性變化，導致幼魚免疫力和抗氧化能力下降(邵彥翔等,2017)。謝明媚等(2015)在銀鯧(Pampus argenteus)幼魚的急性溫度脅迫研究中發(fā)現(xiàn)，急性溫度脅迫會在一定程度上引起實驗魚肝臟的損傷，并對其抗氧化能力和免疫應答反應產生影響。彭婷等(2012)對羅非魚(Oreochromis niloticus)的低溫脅迫研究發(fā)現(xiàn)，隨著溫 度降低，羅非魚的生化、免疫及抗氧化指標均發(fā)生顯著變化，由此可能導致羅非魚在低溫脅迫后出現(xiàn)昏迷及死亡等異常狀況。潘桂平等(2016)對云紋石斑魚(Epinephelus moara)幼魚的研究發(fā)現(xiàn)，低溫脅迫對云紋石斑魚幼魚抗氧化和免疫性能影響顯著，低溫脅迫導致該魚體內的MDA含量升高，因而肝臟合成更多 的抗氧化物質來進行抗氧化防御。本研究中，實驗魚肝臟CAT與SOD活力隨著溫度脅迫的進行與對照組相比呈現(xiàn)出逐漸降低的趨勢，至脅迫期結束，各實驗組均顯著低于對照組，MDA含量在溫度脅迫過程中持續(xù)升高，至脅迫期結束各實驗組均與對照組差異顯著，表明在溫度驟變的條件下，實驗魚抗氧化酶活力會受到顯著抑制，抗氧化能力減弱。而進入恢復期，各實驗組CAT與SOD活力均逐漸提高，MDA含量逐漸降低，至恢復期結束時與對照組不存在顯著差異，則表明當溫度恢復后，本實驗溫度驟變范圍對大鱗副泥鰍肝臟抗氧化酶活力的抑制是可恢復的，可以認為實驗條件下的溫度驟變不會造成大鱗副泥鰍永久性肝損傷。

3.2 溫度脅迫對大鱗副泥鰍肝臟LZM與AKP活力的影響

LZM在魚類的體液、血清和巨噬細胞中普遍存在，是吞噬細胞殺菌的物質基礎，具有溶解細菌作用(殷海成等,2014)。LZM主要針對革蘭氏陽性菌，但也影響一些革蘭氏陰性菌，如腸道沙門氏菌(Salmonella enteritidis)和嗜水氣單胞菌(Aeromonas hydrophila)，其具有抗感染、抗腫瘤、抗病毒以及增強抗生素的功能，起到防御病原體的重要作用(Saurabhet al,2008; Junget al,2012)。AKP是一種磷酸單酯水解酶，特異性低，起到解毒劑的作用，它在水中溶解生成乙醇和磷酸，因此，是魚類生物健康的重要標志(Hoseinifaret al,2015)。研究認為，溫度脅迫會對魚類非特異性免疫機能產生影響。低溫脅迫下，河豚(Takifugu obscurus)血漿蛋白和AKP等生化指標顯著下降，誘導抗氧化酶、HSP90和C3的基因表達，表明其免疫系統(tǒng)會受到低溫脅迫的影響(Chenget al,2017)。對吉富品系尼羅羅非魚(Oreochromis niloticus)幼魚的研究表明，溫度脅迫下實驗魚血清LZM與AKP活力在實驗期內，基本呈先上升后下降的變化趨勢，認為溫度脅迫顯著改變羅非魚幼魚的非特異性免疫能力(強俊等,2012)。低溫脅迫下，虹鱒(Oncorhynchus mykiss)血清的AKP活力顯著降低，并在48 h的恢復期內維持在較低水平，而高溫脅迫下，AKP活力相比對照組略有降低(管標等,2014)。本研究中，實驗魚肝臟LZM與AKP活力在脅迫期均受到溫度驟變的影響，至脅迫期結束時，各實驗組均顯著低于對照組，表明溫度驟變顯著降低肝臟LZM與AKP活力，減弱機體非特異性免疫功能；進入恢復期，高溫組LZM與AKP活力基本停留在脅迫結束時的水平，至恢復期結束時仍顯著低于對照組，而降溫組與低溫組LZM與AKP活力則持續(xù)升高，至恢復期結束時，基本恢復至對照組水平，表明高溫脅迫會對大鱗副泥鰍非特異性免疫機能造成不可逆的破壞，而低溫脅迫對大鱗副泥鰍非特異性免疫機能的抑制是可恢復的，實驗條件下不會造成永久性破壞。

3.3 溫度脅迫對大鱗副泥鰍血清轉氨酶的影響

正常情況下，AST和ALT在包括肝臟在內的許多器官中普遍存在，當機體由于應激反應或發(fā)生病變時，細胞膜通透性發(fā)生變化，在濃度差作用下導致細胞內的AST和ALT釋放到血液中，引起血清中的ALT和AST含量升高(孫學亮等,2010)。因此，檢測血清中AST和ALT水平的變化，可以反映細胞膜通透性的變化，并判斷肝臟等組織是否發(fā)生病變(Lemaireet al,1991; Lee,2001)。本研究中，溫度脅迫顯著升高實驗魚血清的AST與ATL含量表明溫度驟變會引起實驗魚細胞膜通透性的變化，肝臟細胞的凋亡速度或數(shù)量增加使轉氨酶進入血液；進入恢復期，各實驗組AST與ALT含量均呈下降趨勢，至恢復期結束時，各實驗組AST含量基本恢復到對照組水平，而ALT含量上則在降溫組與低溫組基本恢復至對照組水平，高溫組則仍顯著高于對照組。高溫條件會引起大鱗副泥鰍血液ALT含量升高，造成不可逆的破壞，而低溫條件對大鱗副泥鰍血液轉氨酶含量的影響是可恢復的，實驗條件下不會對機體肝細胞機能造成永久性破壞。

4 結論

在實驗條件下，連續(xù)12 h的溫度脅迫會顯著抑制大鱗副泥鰍抗氧化能力與非特異性免疫能力，且在高溫條件下對其非特異性免疫相關酶活力造成持續(xù)抑制，大鱗副泥鰍對低溫條件的耐受能力較強，在實際生產中應避免高溫。